Biomarcadores agnósticos de fusiones génicas en oncología: revisión diagnóstica y terapéutica Tumor-agnostic biomarkers in Oncology: a review of diagnostic and therapeutic management Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias (AETS) Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN INFORMES DE EVALUACIÓN DE TECNOLOGÍAS SANITARIAS Biomarcadores agnósticos de fusiones génicas en oncología: revisión diagnóstica y terapéutica Tumor-agnostic biomarkers in Oncology: a review of diagnostic and therapeutic management Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias (AETS) Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN INFORMES DE EVALUACIÓN DE TECNOLOGÍAS SANITARIAS Convenio de colaboración/financiación: Este documento ha sido realizado por la Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Salud Carlos III en el marco de la financiación del Ministerio de Sanidad para el desarrollo de las actividades del Plan anual de Trabajo de la Red Española de Agencias de Evaluación de Tecnologías Sanitarias y Prestaciones del SNS, aprobado en el Pleno del Consejo Interterritorial del SNS del 26 de mayo de 2021. El contenido del presente informe es responsabilidad exclusiva de la Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Salud Carlos III sin que la colaboración de los revisores presuponga por su parte la completa acep- tación del mismo. Para citar este informe: Asensio del Barrio C. Biomarcadores agnósticos de fusiones génicas en oncología: revisión diagnóstica y terapéutica. Red Española de Agencias de Evaluación de Tecnologías y Prestaciones del SNS. Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Salud Carlos III (AETS-ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Madrid. 2024. Informes de Evaluación de Tecnologías Sanitarias. Información editorial Editan: Ministerio de Sanidad. Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Instituto de Salud Carlos III. Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias. Fecha de edición: 2024. Contacto: crisasensio@isciii.es Instituto de Salud Carlos III NIPO pdf: 156240172 NIPO Epub: 156240188 Ministerio de Sanidad: NIPO pdf: 133-24-007-1 NIPO Epub: 133-24-008-7 Maquetación: Diseño Gráfico Gallego y Asociados, S. L. Este documento puede ser reproducido total o parcialmente, por cualquier medio, para su uso no comercial, siempre que se cite explícitamente su procedencia. Biomarcadores agnósticos de fusiones génicas en oncología: revisión diagnóstica y terapéutica. Cristina Asensio del Barrio. Ministerio de Sanidad. Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Salud Carlos III. 2024. 1 archivo pdf; - (Informes, Estudios e Investigación). Palabras clave: biomarcadores agnósticos de fusión, fusión de genes NTRK, reordenamientos de gen ALK, RET y ROS1, tests diagnósticos, algoritmo diagnóstico, estudio inmunohistoquímico, IHC, PCR, hibridación in situ por fluorescencia, FISH, secuenciación de nueva generación, NGS, terapia dirigida o de precisión, efectividad diagnóstica, efectividad terapéutica, seguridad. Keywords: biomarkers, tumor agnostic, fusion NTRK positive tumor, rearrangement ALK, RET and ROS1, diagnostic tests, FISH, Inmunochemistry, IHC, new generation sequence, NGS, diagnostic accuracy, clinical effectiveness, safety. Información preliminar Autoría Autoría completa del informe Cristina Asensio del Barrio. Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Salud Carlos III (AETS-ISCIII). Otros participantes Documentalista Esther Elena García Carpintero. AETS-ISCIII. Revisión interna Este informe de evaluación ha sido sometido a un proceso de revisión interna realizada por el Dr. Luis Mª Sánchez Gómez. AETS-ISCIII. Revisión externa Este informe de evaluación ha sido sometido a un proceso de revisión externa. La AETS-ISCIII agradece su colaboración desinteresada y los comentarios aportados a: • Dr. Ramón Colomer Bosch, Profesor Titular de Oncología, Universidad Autónoma de Madrid (UAM), Jefe de Servicio de Oncología Médica, Hospital Universitario de La Princesa, Madrid. • Dra. Edurne Arriola Aperribay, Jefa de Sección Cáncer de Pulmón y Genitourinario. Oncología Médica, Hospital del Mar, Barcelona. • Dr. Javier de Castro Carpeño, Jefe de Sección, Oncología Médica, Hospital Universitario La Paz, Madrid. Agradecimientos La AETS-ISCIII agradece a la Dra. Marta Soler Soneira, del Centro Nacional de Epidemiología (CNE-ISCIII), sus aportaciones sobre lenguaje inclusivo en la redacción del informe. Declaración de conflictos de interés La Dra. Edurne Arriola Aperribay ha recibido financiación de Pfizer y Lilly para estudios relacionados con Lorlatinib y Selpercatinib. El equipo evaluador de la AETS-ISCIII ha considerado que estas actividades no debieran impedir su participación como revisora externa del informe. Además, su colaboración no ha requerido el acceso a material sensible o confidencial y sólo ha tenido acceso a la información disponible en los últimos borradores del informe. El resto de autores, colaboradores y revisores han declarado no presentar conflictos de interés relacionados con el tema objeto de evaluación del presente informe. 5 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Índice ÍNDICE DE TABLAS ..............................................................................................7 ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................8 SIGLAS Y ACRÓNIMOS .......................................................................................9 ALGUNAS DEFINICIONES O CONCEPTOS ......................................................14 RESUMEN ...........................................................................................................17 SUMMARY ...........................................................................................................23 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................29 1.1. Medicina de precisión .............................................................................29 1.2. Biomarcadores tumor-agnósticos de fusión ...........................................31 1.2.1. Fusiones del gen NTRK ...............................................................32 1.2.2. Reordenamientos ALK .................................................................36 1.2.3. Fusiones del gen ROS1 ...............................................................37 1.2.4. Reordenamientos RET .................................................................38 1.3. Técnicas diagnósticas .............................................................................38 1.3.1. IHQ ...............................................................................................39 1.3.2. FISH .............................................................................................42 1.3.3. RT-PCR ........................................................................................46 1.3.4. NGS .............................................................................................47 1.4. Terapias tumor-agnósticas ......................................................................53 1.4.1. Larotrectinib (Vitrakvi®) ................................................................54 1.4.2. Entrectinib (Rozlytrek®) ...............................................................55 1.4.3. Otros fármacos ............................................................................57 2. OBJETIVOS ....................................................................................................60 3. METODOLOGÍA..............................................................................................62 3.1. Criterios de selección de estudios ..........................................................62 3.2. Criterios de exclusión .............................................................................63 3.3. Fuentes de información ..........................................................................64 3.4. Estrategias de búsqueda ........................................................................64 3.5. Proceso de selección de estudios ..........................................................65 3.6. Extracción de datos ................................................................................66 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 6 4. RESULTADOS .................................................................................................67 4.1. Resultados de la búsqueda y selección de estudios .............................67 4.2. Estudios sobre pruebas diagnósticas para identificar a los biomarcadores agnósticos de fusión......................................................68 4.2.1. Informes de ETS ..........................................................................68 4.2.2. Revisiones sistemáticas y meta-análisis ......................................71 4.2.3. Propuestas de algoritmos diagnósticos para identificar los biomarcadores de fusión .............................................................72 4.2.4. Documentos de consenso de sociedades científicas españolas ...83 4.2.5. Recomendaciones de ESMO .......................................................89 4.2.6. Guías norteamericanas ................................................................94 4.2.7. Documentos de consenso, guías y/o recomendaciones de otras Sociedades Científicas .....................................................100 4.3. Estudios sobre los tratamientos agnósticos .........................................109 4.3.1. Estudios estimativos de efectividad comparada .......................109 4.3.2. Revisiones sistemáticas .............................................................113 4.3.2. Guías de evaluación de tecnología, de NICE ............................114 4.3.4. Documentos de consenso .........................................................118 4.4. Estudios económicos ...........................................................................119 4.4.1. Informe de Scottish Medicine Consortium ................................119 4.4.2. Informe de ETS del Norwegian Institute of Public Health (NIPH) ....120 4.4.3. Estudios originales sobre costes de las pruebas diagnósticas y tratamientos agnósticos ....................................121 5. DISCUSIÓN ..................................................................................................125 5.1. En relación al diagnóstico de biomarcadores de fusión .......................125 5.2. En relación a los tratamientos agnósticos ............................................132 5.3. Aspectos económicos y organizativos .................................................136 6. CONCLUSIONES ..........................................................................................141 6.1. Para futuras investigaciones .................................................................144 7. REFERENCIAS .............................................................................................146 8. ANEXOS .........................................................................................................165 Anexo I. ESCAT. ............................................................................................165 Anexo II. Companion Diagnostic (CDx) ........................................................167 Anexo III. Estrategias de búsqueda ..............................................................169 Anexo IV. Algoritmos diagnósticos para estudio de fusiones NTRK ............173 7 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Índice de tablas Tabla 1. Frecuencia de fusiones NTRK en algunos tumores ...........................34 Tabla 2. Principales ventajas y desventajas de cada técnica diagnóstica ......52 Tabla 3. Criterios de inclusión ..........................................................................63 Tabla 4. Estudios incluidos en el Informe de NIPH ..........................................69 Tabla 5. Niveles ESCAT. .................................................................................165 Tabla 6. CDx aprobados por la FDA ..............................................................166 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 8 Índice de figuras Figura 1. Algoritmo diagnóstico propuesto por Marchetti y cols ....................73 Figura 2. Algoritmo para screening utilizando TMA. Algoritmo propuesto para screening de biomarcadores raros y para seleccionar a los pacientes candidatos a tratamientos tumor-agnósticos. TMA: tissue micro arrays .....................................................................................................74 Figura 3. Protocolo propuesto por Zito Marino y cols .....................................78 Figura 4. Algoritmo diagnóstico propuesto por Solomon y cols .....................80 Figura 5. Algoritmo propuesto por Penault y cols ...........................................82 Figura 6. Algoritmo para identificar fusiones NTRK, de SEOM, SEAP y SEHOP ....86 Figura 7. Propuesta de ESMO para detección de fusiones NTRK ..................90 Figura 8. Algoritmo propuesto para pacientes con NSCLC ..........................172 Figura 9. Algoritmo propuesto para pacientes con CCR ..............................173 Figura 10. Algoritmo propuesto para pacientes con sarcoma ......................174 Figura 11. Algoritmo propuesto para pacientes pediátricos .........................175 9 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Siglas y acrónimos AHRQ Agency for Healthcare Research and Quality’s AJJC American Joint Committee on Cancer ALK Anaplastic Lymphoma Kinase AMP Association for Molecular Pathology AMP Método anchored multiplex PCR ASCO American Society of Surgical Oncology AUC-ROC Área bajo la curva ROC AVAC Años de Vida Ajustados por Calidad BDNF Factor neurotrófico derivado del cerebro (Brain-Derived Neurotrophic Factor) BRAF V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 BSC Best Supportive Care CAP College of American Pathologists CCR Carcinoma colorrectal CCRm Carcinoma colorrectal metastásico CDx Companion Diagnostics CDT Carcinoma diferenciado de tiroides cfDNA/RNA DNA/RNA libre CISH Hibridación in situ cromogénica CMT Carcinoma medular de tiroides CPT Carcinoma papilar de tiroides cDNA DNA complementario CR Respuesta completa ctDNA DNA tumoral circulante CTC Células tumorales circulantes CVRS Calidad de Vida Relacionada con la Salud DFS Supervivencia libre de enfermedad (Disease-free Survival) INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 10 dMMR Deficiencia en la reparación de los errores de emparejamiento (Deficient mismatch-repair) DNA Ácido desoxirribonucleico DOR Odds Ratio Diagnóstica DoR Duración de la respuesta DSS Supervivencia específica de enfermedad (Disease Specific Survival) EA Eventos adversos EANM European Association of Nuclear Medicine ECA Ensayo clínico aleatorizado ECOG Eastern Cooperative Oncology Group EGAPP Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EMA Agencia Europea del Medicamento EML4 Echinoderm Microtubule-Associated Protein 4 EORTC European Organisation for Research and Treatment of Cancer ESCAT ESMO Scale for Clinical Actionability of molecular Targets ESMO European Society for Medical Oncology ETS Evaluación de Tecnologías Sanitarias EUnetHTA European Network for Health Technology Assessment FDA Food and Drug Administration FFPE Fijados en formol e incluidos/embebidos en parafina FISH Hibridación in-situ fluorescente (Fluorescence in-situ hybridization) FN Falsos Negativos FP Falsos Positivos GIST Tumor de estroma gastrointestinal GMI Growth modulation index H&E Hematoxilinia y eosina HER2 Receptor-2 del factor de crecimiento epidérmico humano HI Histología independiente HR Hazard Ratio HTS High-Throughput o secuenciación de alto rendimiento IASLC International Association for the Study of Lung Cancer IC 95% Intervalo de confianza al 95% 11 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA ICER Ratio de coste-efectividad incremental ICr Intervalo de credibilidad IHQ Inmunohistoquímica INAHTA Red Internacional de Agencias de Evaluación de Tecnologías Sanitarias IQR Rango intercuartílico JSCO Japan Society of Medical Oncology JSMO Japan Society of Clinical Oncology KRAS V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene LMNA Lamin A/C LR Cociente de probabilidad (Likelihood Ratio) LYs Años de vida MASC Carcinomas análogos a los secretores de mama de glándula salival MAIC Comparación indirecta ajustada con emparejamiento (Matching-adjusted indirect comparison) MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MEN2 Síndrome de neoplasia endocrina múltiple tipo 2 MKI Inhibidor multiquinasa MSI Alta inestabilidad de microsatélites MSK-IMPACT Memorial Sloan Kettering Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets MTB Comités Moleculares de Tumores (Molecular Tumor Board) MYCN Proteína del protooncogén N-myc NCCN National Comprehensive Cancer Network NE No estimable NGF Factor de crecimiento nervioso (Nerve Growth Factor) NGS Secuenciación de nueva generación NGS-DNA Secuenciación de nueva generación basada en DNA NGS-RNA Secuenciación de nueva generación basada en RNA NHS National Health System NICE National Institute for Health and Clinical Excellence NIPH Norwegian Institute of Public Health NNS Número necesario a cribar NSCLC Non-Small Cell Lung Carcinoma INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 12 NRTK gen del Receptor de Tirosina Kinasa Neurotrófico (neurotrophic tyrosine receptor kinase) NTF Neurotrofina OMS Organización Mundial de la Salud OR Odds ratio ORR Tasa de respuesta global (Overall Response Rate) OS Supervivencia global (Overall Survival) PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PD Progresión de la enfermedad PD-1 Proteína 1 de muerte celular programada PD-L1 Ligando-1 de muerte programada PFS Supervivencia libre de progresión PI3K Fosfatidil inositol 3-quinasa (Phosphatidylinositol 3-kinase) PLC-ɣ Fosfolipasa C-gamma PR Respuesta parcial Q-PCR Quantitative-Reacción en Cadena de la Polimerasa QALYs Años de vida ajustada por calidad (Quality-adjusted Life Year) QT Quimioterapia RANO Response Assessment in Neuro-Oncology RECIST Response Evaluation Criteria In Solid Tumours RET REarranged during Transfection RFT Tiempo libre de recurrencia (Recurrence Free Time) RFS Supervivencia libre de recurrencia (Recurrence Free Survival) RM Resonancia Magnética RNA Ácido ribonucleico ROS1 c-ros proto oncogene RR Riesgo Relativo RT Radioterapia RT-PCR Transcriptasa inversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa RWE Evidencia del mundo real (Real-World Evidence) SD Enfermedad estable Se Sensibilidad SE Error estándar 13 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA SEAP Sociedad Española de Anatomía Patológica SEHOP Sociedad Española de Hematología y Oncología Pediátrica SEOM Sociedad Española de Oncología Médica SIAPeC Italian Society of Pathological Anatomy and Cytodiagnostics SMC Scottish Medicine Consortium SMRT Secuenciación de molécula única (Single Molecule Real-Time) SNC Sistema nervioso central SNS Sistema Nacional de Salud Sp Especificidad SPB Sarcoma de partes blandas SROC Curva ROC sumaria TAT Turnaround time TD Terapia Dirigida (Targeted Therapy) TFN Tasa de Falsos Negativos TKI Inhibidor de tirosina quinasa TMA Tissue micro arrays TMB Carga mutacional tumoral TNM Sistema de estadificación Tumor Node Metastases TOS Taiwan Oncology Society TRK Receptor de tropomiosina quinasa o tirosina quinasa TTP Tiempo hasta la progresión UICC Union for International Cancer Control VN Verdadero Negativo VP Verdadero Positivo VPN Valor Predictivo Negativo VPP Valor Predictivo Positivo WES Secuenciación completa del exoma (Whole Exome Sequencing) WGS Secuenciación completa del genoma (Whole Genome Sequencing) WOS Web of Science INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 14 Algunas definiciones o conceptos • Alteraciones en el número de copias: bien una amplificación o una dele- ción de un gen o de una región del cromosoma (por ejemplo, deleciones en genes supresores de tumores). • Biomarcadores predictivos de sensibilidad y de resistencia: informan sobre la probabilidad de respuesta o no respuesta a un tratamiento concreto. Otros son los biomarcadores predictivos de efectos adversos. • Biomarcadores pronósticos: informan de forma precisa sobre la evolu- ción de la enfermedad y la supervivencia del paciente. • Carga mutacional del tumor: número de cambios génicos o mutaciones en una célula cancerosa. • Cobertura (coverage): se refiere al porcentaje de bases del genoma de refe- rencia que están siendo secuenciadas una cantidad determinada de veces. Es uno de los factores clave en la fiabilidad del nucleótido asignado a esa posición del genoma • Concordancia: es el número de resultados del tests que son concordantes del total de tests analizados. • DNA constitucional: es el DNA en las células germinativas (óvulos y espermatozoides). También se llama DNA de la línea germinal. • End-to-end study: estudios que siguen pacientes desde que se realiza el test diagnóstico, incluyendo el tiempo de duración del tratamiento y hasta que se analizan resultados finales de interés. • Ensayos en cesta (basket trials): incluyen pacientes en función del per- fil molecular, no por el tipo histológico del tumor ni por su localización. • Ensayos paraguas (umbrella trials): se analizan pacientes con un solo tipo de tumor y en función del resultado genético de cada uno, se decidirá la terapia dirigida a pautar. Permiten estudiar si fármacos que funcionan en pacientes con tumores en otros órganos son válidos para ese tipo de tumor concreto basándose en el hecho de que compartan el mismo marcador. • Gen de fusión (fusion gene): Unión del DNA de dos genes. Los genes de fusión pueden ocurrir como resultado de una translocación, deleción o inversión cromosómica. 15 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA • Mutaciones o sustituciones de bases, que implican un cambio de base en el DNA. • Mutaciones drivers o conductoras: aquellas que determinan el inicio de un proceso de carcinogénesis seguido de una proliferación anómala de las células tumorales. • Mutación puntual (point mutation): alteración en la secuencia del DNA causada por el cambio, inserción o deleción de un único nucleótido. • Profundidad (depth o depth of coverage): representa el número prome- dio de veces que cada base del genoma es secuenciada en los fragmentos de DNA. Los valores apropiados de profundidad dependerán del tipo de técnica de secuenciación (panel de genes, exoma o genoma) y de la fre- cuencia alélica de las variantes que se analizarán (germinales y somáticas). • Reordenamiento (rearrangement): alteración estructural de un cromosoma que implica, normalmente, la rotura y/o la reunión de un segmento de mate- rial cromosómico, que da lugar a una configuración anormal, formando un oncogén de fusión; la inversión y la translocación son ejemplos de ello. • Proceso de splicing: corte de intrones y empalme de exones. • TAT (turnaround time): es el tiempo total de un test que incluye la soli- citud, la preparación, transporte de la muestra, análisis, interpretación y emisión del informe de resultados. • TAT terapéutico: el intervalo de tiempo desde que se solicita un test hasta que se toma la decisión terapéutica concreta para la persona enferma. • Terapia molecular dirigida: aquella cuya eficacia depende de la presencia o ausencia de mutaciones drivers. Esta terapia bloquea las vías de señali- zación celular que de forma incorrecta se han activado y que están impli- cadas en la oncogénesis. • Transcriptoma: es el conjunto de genes que se expresan en una célula en un momento dado; el conjunto de todas las «lecturas» de genes presen- tes en una célula (el DNA debe «leerse» y transcribirse, es decir, copiarse para crear el RNA). Estas «lecturas» se llaman transcritos. Dependiendo de la técnica utilizada, a menudo es posible contar el número de transcri- tos para determinar la cantidad de actividad de los genes, también llamada expresión génica, en un tipo específico de células o tejidos. • Translocación: Este término se refiere al cambio en la ubicación de deter- minado material cromosómico. Existen dos tipos principales de transloca- ciones: recíprocas y robertsonianas. En una translocación recíproca, se INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 16 produce el intercambio de segmentos entre dos cromosomas no homólogos. La translocación robertsoniana es la unión de dos cromosomas acrocén- tricos por los centrómeros, con pérdida de sus brazos cortos y formando un solo cromosoma y este nuevo cromosoma se denomina «cromosoma por translocación». En los cromosomas acrocéntricos, el centrómero está localizado cerca del extremo del cromosoma; y son el 13, 14, 15, 21 y 22. • Utilidad clínica: evalúa el impacto en salud de un test en términos de ries- gos y beneficios; considera su disponibilidad, eficacia, efectividad y segu- ridad del test en estudio en comparación a la práctica habitual. • Validez analítica o rendimiento técnico de un test genético: es la capaci- dad del test para medir de forma exacta y fiable un biomarcador de interés en el laboratorio. Viene determinada por la sensibilidad, especificidad, exac- titud, precisión, robustez de los resultados y el control de calidad del test. • Validez clínica: evalúa la capacidad del test para detectar de forma exacta y fiable o para predecir una condición clínica. Incluye dos partes: la evalua- ción de la validez científica, que se refiere a la evidencia de la asociación entre un gen y una enfermedad; y la evaluación del rendimiento diagnós- tico del test en términos de sensibiilidad, especificidad, valores predicti- vos y factores de influencia (como la penetrancia, la prevalencia y otros modificadores). 17 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Resumen Introducción La presencia de algunas alteraciones moleculares que son dianas biológicas para determinados fármacos en varios tipos tumorales indistintamente ha supuesto un cambio de paradigma en el tratamiento oncológico. El estudio sistemático de los biomarcadores de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET se ha convertido en un reto para los sistemas sanitarios para poder seleccionar a pacientes candidatos al trata- miento tumor-agnóstico, que ha demostrado mayor efectividad y seguridad clínica que el tratamiento convencional. Objetivos El objetivo de este informe es revisar la literatura científica con el fin de iden- tificar las mejores evidencias sobre el uso de las técnicas IHC, FISH, RT-PCR y NGS para la identificación sistemática de los biomarcadores de fusión de genes NTRK, ALK, ROS1 y RET en patología oncológica dada su capacidad predictiva de respuesta favorable a terapias agnósticas. También se revisa la efectividad de las terapias agnósticas y su efectividad comparada entre esta terapia dirigida y la terapia estándar, en términos de resultados en salud y seguridad para la persona en tratamiento, así como la repercusión económica asociada a la incorporación de estos tests en la práctica clínica. Metodología Se ha realizado una revisión de revisiones de la literatura científica con el fin de sintetizar e integrar toda la evidencia disponible sobre la validez diagnóstica de los diferentes algoritmos, propuestas diagnósticas y recomendaciones de uso de las diferentes técnicas diagnósticas empleadas para la identificación de los biomarca- dores agnósticos de genes de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET. Se han incluido informes de ETS, documentos de consenso con recomendaciones de las principales sociedades científicas relacionadas con las materias de interés, opiniones de exper- tos, guías de práctica clínica, revisiones sistemáticas y meta-análisis, propuestas de INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 18 algoritmos diagnósticos de grupos de profesionales asistenciales e investigadores y revisiones narrativas de calidad; estudios de comparaciones entre fármacos diri- gidos frente a esos biomarcadores y estudios de costes sobre las pruebas diagnós- ticas y/o los tratamientos agnósticos. La búsqueda de la literatura se realizó en Medline, Embase, Cochrane Library y otras fuentes de información, recogiendo los estudios publicados a partir de 2015, en inglés o en español, y que cumplieran determinados criterios de selección esta- blecidos a priori. De los estudios seleccionados se han presentado las principales características y resultados de manera narrativa. Resultados La búsqueda inicial en Medline permitió localizar 180 referencias sobre las pruebas diagnósticas utilizadas para identificar biomarcadores de fusión y 164 sobre tratamientos agnósticos; en EMBASE, 492 y 208, respectivamente. No se locali- zaron revisiones Cochrane. Una segunda búsqueda en Medline, permitió recupe- rar 70 nuevas referencias sobre las pruebas diagnósticas y 208 sobre las terapias. En total, se recuperaron 742 referencias sobre pruebas diagnósticas para biomar- cadores y 643 sobre tratamientos tumor-agnósticos. Se eliminaron 263 duplicados. La búsqueda manual a partir de los listados de referencias de algunos documentos y la búsqueda en las páginas web mencionadas en el apartado de fuentes de infor- mación, permitió localizar 9 referencias más. Estudios de efectividad diagnóstica Se ha seleccionado un total de 25 estudios sobre las diferentes pruebas diag- nósticas utilizadas para identificar los biomarcadores agnósticos de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET. Se han presentado ordenados según el tipo de estudio, recogiendo las princi- pales características y resultados de cada uno de ellos. Dos son informes de ETS, elaborados para ayudar en la toma de decisiones en el sistema sanitario noruego. Uno de ellos sobre el uso de los tests moleculares para la detección de genes NTRK de fusión en pacientes con tumores sólidos localmente avanzados o metastásicos, basado en una revisión sistemática de artículos que comparaban la efectividad diag- nóstica de las pruebas. El otro, sobre los tests utilizados para detección de alteracio- nes en el gen ROS1 en pacientes con NSCLC localmente avanzado o metastásico 19 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA en quienes la opción de menor coste para estudiar reordenamientos ROS1 sería realizar el screening con IHQ y a continuación confirmar los resultados positivos mediante FISH u otros métodos por la posibilidad de FP en IHQ. Una revisión sistemática de la literatura sobre la prevalencia, diagnóstico y tratamientos de tumores con fusiones NTRK en población pediátrica. Seis estudios, basados en revisiones de la literatura o en la opinión de personas expertas, con pro- puestas de algoritmos diagnósticos para identificar los genes de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET, junto a principales reflexiones o conclusiones recogidas en estos docu- mentos. Algunos de estos seis estudios se refieren a diferentes tumores con posibles fusiones NTRK, otros se limitan al estudio de reordenamientos ALK y ROS1 en cán- cer de pulmón. A continuación se presentan tres documentos de consenso elabora- dos por diferentes sociedades científicas españolas para estudio de fusiones NTRK en tumores sólidos, de diferentes biomarcadores en CCR y en cáncer de pulmón. Después se exponen los tres documentos de recomendaciones del grupo de trabajo de Investigación Traslacional y Medicina de Precisión de ESMO, sobre métodos para la detección de fusiones NTRK, sobre la detección de fusiones RET y sobre el uso de la NGS en pacientes con tumores metastásicos. De las guías americanas, se han seleccionado las de la NCCN para diagnóstico de fusiones NTRK en NSCLC, una guía actualizada de CAP-IASLC-AMP en NSCLC y la guía de ASCO sobre diagnóstico de biomarcadores en cáncer de pulmón. Finalmente, se recogen siete documentos de consenso de otras sociedades cien- tíficas de otros países (Canadá, Japón, Taiwán, Australia, India) referidos al estu- dio de biomarcadores predictivos en distintos tumores sólidos y otro documento de consenso de la red mundial de sarcomas. Estudios de efectividad terapéutica No se han encontrado ensayos clínicos controlados y aleatorizados sobre la efectividad de los fármacos tumor-agnósticos larotrectinib y entrectinib en com- paración a los quimioterápicos existentes para tratamiento de tumores positivos a fusiones NTRK, ni estudios que realicen comparaciones directas entre ambos fár- macos y/o con los quimioterápicos. Se han seleccionado 9 estudios de efectividad comparada con diferentes metodologías entre larotrectinib y entrectinib o con los quimioterápicos, 1 revisión sistemática, 3 guías de evaluación de tecnologías de NICE y un documento de consenso. Uno de los estudios realiza comparaciones indirectas entre los datos de series históricas de pacientes con tumores sólidos en estados avanzados o metastásicos (sin INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 20 información sobre la presencia o no de fusiones NTRK) sometidos al tratamiento convencional y los datos agregados de los ensayos clínicos de larotrectinib, donde se observa que la ORR del larotrectinib es superior. En otro estudio se utiliza la metodología de comparación indirecta ajustada con emparejamiento entre larotrec- tinib y entrectinib en pacientes oncológicos con fusiones NTRK, encontrando que larotrectinib presenta mejores resultados. Tres estudios son de efectividad com- parada intrapaciente, entre los fármacos agnósticos y el tratamiento previo, utili- zando el GMI, que permite estudiar el beneficio aportado por el nuevo fármaco en comparación al anterior. Otro estudio utiliza un modelo de supervivencia particio- nal para proyectar la efectividad comparada a largo plazo del larotrectinib frente a entrectinib como tratamientos de segunda línea en pacientes con NSCLC metastá- sico, encontrando mejores resultados de años de vida y QALYs para el larotrecti- nib. Otro estudio utiliza un modelo de supervivencia particional, con tres estados de salud mutuamente excluyentes (libre de progresión, progresión y muerte) para comparar la efectividad del larotrectinib vs entrectinib en CCR, SPB y metásta- sis cerebrales con fusiones NTRK, encontrando también mejores resultados para el larotrectinib. Otro estudio de efectividad comparada a largo plazo entre larotrecti- nib y la terapia estándar en adultos con tumores metastásicos de CDT, CCR y SPB positivos a genes NTRK de fusión, utilizando la misma metodología de modelo de supervivencia particional, muestra mejores resultados para el larotrectinib. En otro estudio se realizan comparaciones indirectas ajustadas por emparejamiento, utili- zando un propensity score, entre entrectinib y crizotinib en pacientes con NSCLC positivos a fusiones ROS1 y ALK, siendo el entrectinib superior. La revisión sistemática sobre efectividad clínica y evidencia económica de los inhibidores multiquinasa TRK e inhibidores TRK selectivos (entrectinib y laro- trectinib), y sobre la calidad de vida de pacientes con tumores positivos a fusio- nes NTRK muestra que los fármacos agnósticos presentaban mejores resultados de efectividad y seguridad. NICE publica tres guías de evaluación de tecnologías, dos sobre larotrectinib y entrectinib para el tratamiento de tumores sólidos positivos a fusiones NTRK y una tercera sobre el entrectinib para el tratamiento de pacientes con NSCLC avanzado positivo a ROS1. Se obtiene un ICER de £16,155 por QALY ganado con el larotrec- tinib en comparación a la práctica clínica. Consideran que no hay suficientes datos para estimar de forma fiable el beneficio del larotrectinib a largo plazo, que no hay evidencia respecto a si la respuesta al larotrectinib es similar en todos los tipos de tumores, que la NGS es necesaria para establecer que paciente es o no candidato a larotrectinib, y que debido a la incertidumbre existente, no es posible recomendar el uso rutinario de larotrectinib. En el segundo informe también concluyen que no se puede recomendar el uso de entrectinib en la práctica rutinaria en el NHS. En 21 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA cambio, sí se recomienda el uso de entrectinib en pacientes con NSCLC positivos a fusiones ROS1, y especialmente si presentan metástasis cerebrales. Estudios de evaluación económica Se han seleccionado 7 estudios de evaluación económica de las pruebas y/o fármacos agnósticos. Un informe elaborado por el SMC para el NHS de Escocia que presenta un análisis de coste-utilidad donde se comparaba el uso de entrecti- nib con el mejor tratamiento de soporte, utilizando un modelo de supervivencia particionado con tres estados de salud (pre-progresión, progresión y muerte) y se adoptó un horizonte temporal de 30 años. Para el caso base se estimó un ICER de £37,398/QALY. El análisis de sensibilidad de una vía de entrectinib versus BSC fue más sensible a la variación de ±20% en los valores de utilidad de PFS, costes de diagnóstico de la enfermedad y OS. El estudio de micro-costes incluido en uno de los informes de ETS, estima que la NGS supone un coste de unas 16.000 coronas noruegas por muestra, pero cuando esta prueba se realiza para estudiar varios genes y varias muestras (de NTRK, ROS1, RET y ALK en pacientes con NSCLC) los costes se reducen a unas 2.000 coronas por paciente. De los otros 5 estudios, dos son análisis de micro-costes realizados en Francia; otro es un estudio inglés basado en datos ofrecidos por NICE en el que se estima el número necesario a cribar para identificar pacientes con fusiones NTRK; otro es un estudio de coste-efectividad, que estudia los QALYs y el incremento en años de vida del larotrectinib frente al comparador tratamiento estándar (múltiples tipos de tratamientos) realizado en Países Bajos; otro estudio de coste-efectividad para com- parar el entrectinib frente al tratamiento estándar en pacientes oncológicos, también realizado en Países Bajos, y donde se incluía el estudio de fusiones NTRK en estos pacientes, utilizando un árbol de decisión (para reflejar la fase de diagnóstico) y un modelo de microsimulación (para reflejar el tratamiento) y que llevó a la conclu- sión de que el entrectinib no era coste-efectivo en comparación la quimioterapia utilizada (podría serlo si se incluyeran los tests genéticos en la práctica habitual). Conclusiones La identificación de los biomarcadores tumor-agnósticos de genes de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET resulta fundamental dada la posibilidad de acceso a INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 22 fármacos dirigidos frente a dichos genes. Las pruebas diagnósticas IHQ, FISH, RT-PCR y NGS permiten detectar fusiones en estos genes. Para la detección de fusiones NTRK, la NGS basada en RNA se considera el gold standard. FISH es una prueba de alta Se y Sp para la detección de genes de fusión, como ALK, ROS1 y RET. Para NTRK se requiere realizar un test FISH para cada gen. La IHQ es una técnica válida y muy empleada por su accesibilidad y facilidad de realización a diferencia de FISH que requiere de experiencia para su realización. La RT-PCR y la biopsia líquida son pruebas no demasiado extendidas en la práctica clínica. La incorporación de paneles NGS en los laboratorios, asociado a un descenso en los costes, podría facilitar que esta tecnología se convirtiera en la prueba de elec- ción para el diagnóstico de fusiones NTRK y reordenamientos ALK, ROS1 y RET. Las numerosas propuestas de algoritmos diagnósticos y/o recomendaciones reflejan el elevado interés en este ámbito de la medicina de precisión a la vez que demuestran la falta de un consenso generalizado sobre su mejor utilización. Son necesarios estudios que incluyan un mayor número de pacientes oncoló- gicos y metodológicamente rigurosos que permitan comparar el rendimiento diag- nóstico de las diferentes pruebas en función del tipo de tumor y de los biomarca- dores en estudio. También es necesario estudiar la efectividad de los fármacos escogidos a raíz de los resultados de los tests diagnósticos y su seguridad. Deben analizarse varia- bles de resultado de efectividad terapéutica de interés clínico pero también de inte- rés para las personas tratadas como supervivencia global y calidad de vida. El aná- lisis debe incluir un seguimiento a medio y largo plazo. Además, son necesarios estudios de evaluación económica que incluyan datos de las pruebas diagnósticas empleadas hasta la evolución de las personas enfermas tras el tratamiento administrado, que se puedan contextualizar a los distintos siste- mas sanitarios. Igualmente resultan necesarios estudios sobre aspectos organizati- vos claves para la implementación de los mejores algoritmos diagnósticos y de los tratamientos más adecuados en el ámbito de la medicina de precisión. 23 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Summary Introduction The presence of some molecular alterations that are biological targets for cer- tain drugs has led to a paradigm shift in cancer treatment. The systematic study of the NTRK, ALK, ROS1 and RET biomarkers has become a challenge for healthcare systems in order to select patients who are candidates for agnostic treatment, which has shown greater effectiveness and clinical safety than conventional treatment. Objectives The objective of this report is to review the scientific literature in order to iden- tify the best evidence on the use of IHC, FISH, RT-PCR and NGS techniques for the systematic identification of the NTRK, ALK, ROS1 and RET gene fusion bio- markers in oncology given its predictive value for a beneficial response to agnostic therapies. The effectiveness of agnostic drugs and their comparative effectiveness between this targeted therapy and standard therapy are also reviewed, in terms of health and safety results for the patient, as well as the economic implications asso- ciated with the implementation of these tests in clinical practice. Methods A review of reviews from the scientific literature has been carried out in order to synthesize and integrate all the available evidence on the diagnostic validity of the different algorithms, diagnostic proposals and recommendations for the use of the different diagnostic techniques used for the identification of agnostic biomark- ers NTRK, ALK, ROS1 and RET. The studies considered to be included were the following: HTA reports, consensus documents with recommendations from the main scientific societies, expert opinions, clinical practice guidelines, systematic reviews and meta-analyses, proposals for diagnostic algorithms from groups of healthcare professionals and researchers and some narrative reviews; comparative studies between targeted drugs against these biomarkers and studies of economic evaluation related to diagnostic tests and/or agnostic treatments. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 24 The literature search was carried out in Medline, Embase, the Cochrane Library and other sources of information, collecting studies published from 2015, in English or Spanish, and that met certain selection criteria established a priori. The main characteristics and results of the selected studies have been presented. Results From the initial search, it was possible to find 180 references on the diagnostic tests used to identify fusion biomarkers and 164 on agnostic treatments, in Medline; in EMBASE, 492 and 208, respectively. No Cochrane reviews were located. The second search in Medline found 70 new references on diagnostic tests and 208 on therapies. In total, 742 references on diagnostic tests for biomarkers and 643 on tumor-agnostic treatments were retrieved. 263 duplicates were removed. Nine new references were selected from the manual search from the lists of references of some documents and the search in some web pages. Diagnostic effectiveness studies A total of 25 studies on the different diagnostic tests used to identify NTRK, ALK, ROS1 and RET fusion agnostic biomarkers have been selected. They have been presented according to the type of study, collecting the main characteristics and results of each of them. Two are HTA reports, to aid decision-making in the Norwegian healthcare system. One of them, on the use of molecular tests for the detection of NTRK fusion genes in patients with locally advanced or metastatic solid tumors, based on a systematic review of articles that compared the diagnostic effectiveness of the tests. The other, on the tests used to detect molecular alterations in ROS1 gene in patients with locally advanced or met- astatic NSCLC. In these patients, the lowest cost option to study ROS1 rearrange- ments could be to perform IHC screening and then confirm the positive results by FISH or other methods due to the possibility of FP in IHC. A systematic review of the literature on the prevalence, diagnosis, and treat- ment of tumors with NTRK fusions in the pediatric population. Six studies, based on reviews of the literature or on expert opinion, with proposals for diagnostic algo- rithms to identify the NTRK, ALK, ROS1, and RET fusion genes, together with the main conclusions from these documents. Some of these six studies refer to differ- ent tumors with possible NTRK fusions, others are focused in the study of ALK and 25 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA ROS1 rearrangements in lung cancer. Below are three consensus documents pre- pared by different Spanish scientific societies for the study of NTRK fusions in solid tumors, the study of different biomarkers in CRC and in lung cancer. Afterwards, three documents about the recommendations of the ESMO Translational Research and Precision Medicine working group are presented. One of them, focused on methods for the detection of NTRK fusions, other on the detec- tion of RET fusions and on the third on the use of NGS in patients with metastatic tumors. Three American guidelines have been selected: the NCCN guide for the diagnosis of NTRK fusions in NSCLC, an updated guide of CAP-IASLC-AMP in NSCLC and the ASCO guide on diagnosis of biomarkers in lung cancer. Finally, seven consensus documents from other scientific societies in other countries (Canada, Japan, Taiwan, Australia, India) referring to the study of pre- dictive biomarkers in different solid tumors and another consensus document from the global sarcoma network are collected. Therapeutic effectiveness studies No randomized controlled clinical trials have been found on the effectiveness of the tumor-agnostic drugs larotrectinib and entrectinib compared to the standard treatment of tumors positive to NTRK fusions, nor studies that make direct com- parisons between both drugs and/or with the standard treatment. Nine effectiveness studies compared with different methodologies between larotrectinib and entrectinib or with standard treatment, 1 systematic review, 3 NICE technology appraisal guid- ances and a consensus document have been selected. One of the studies makes indirect comparisons between data from historical series of patients with advanced or metastatic solid tumors (without information on the presence or absence of NTRK fusions) undergoing conventional treatment and aggregated data from clinical trials of larotrectinib, showing a higer ORR of larotrectinib. Another study used a matching-adjusted indirect comparison between larotrectinib and entrectinib in cancer patients with NTRK fusions, finding that laro- trectinib presented better results. Three intra-patient comparative effectiveness stud- ies, between agnostic drugs and previous treatment, using the GMI, which makes it possible to study the benefit provided by the new drug compared to the previ- ous one. Another study uses a partitioned survival model to project the compara- tive long-term effectiveness of larotrectinib versus entrectinib as second-line treat- ments in patients with metastatic NSCLC, finding better outcomes in life years and QALYs for larotrectinib. Another study uses a partitioned survival model, with INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 26 three mutually exclusive health states (progression-free, progression, and death) to compare the effectiveness of larotrectinib versus entrectinib in CRC, SPB, and brain metastases with NTRK fusions, also finding better results for larotrectinib. Another long-term comparative effectiveness study between larotrectinib and stand- ard therapy in adults with NTRK fusion gene-positive DTC, CRC, and SPB meta- static tumors, using the same partitional survival model methodology, shows better results for larotrectinib. Another study made matching-adjusted indirect compar- ison, using a propensity score, between entrectinib and crizotinib in patients with NSCLC positive for ROS1 and ALK fusions, and entrectinib shows better results. The systematic review on the clinical effectiveness and economic evidence of TRK multikinase inhibitors and selective TRK inhibitors (entrectinib and laro- trectinib), and on the quality of life of patients with NTRK fusion-positive tumors, shows that agnostic drugs had better results of effectiveness and safety. NICE published three technology appraisal guidances, two on larotrectinib and entrectinib for the treatment of NTRK fusion-positive solid tumors and a third on entrectinib for the treatment of patients with ROS1-positive advanced NSCLC. There is an ICER of £16,155 per QALY gained with larotrectinib compared to clin- ical practice. They consider that there are insufficient data to reliably estimate the long-term benefit of larotrectinib, that there is no evidence as to whether the response to larotrectinib is similar in all tumor types, that NGS is necessary to establish that a patient is or not a candidate for larotrectinib, and that due to the existing uncer- tainty, it is not possible to recommend the routine use of larotrectinib. In the sec- ond report they also conclude that the use of entrectinib in routine practice in the NHS cannot be recommended. On the other hand, the use of entrectinib is recom- mended in patients with NSCLC positive for ROS1 fusions, and especially if they have brain metastases. Economic evaluation studies Seven economic evaluation studies of agnostic tests and/or drugs have been selected. A report produced by the SMC for the NHS Scotland presenting a cost-utility analysis comparing the use of entrectinib with BSC, using a partitioned survival model with three health states (pre-progression, progression and death) and a time horizon of 30 years was adopted. For the base case, an ICER of £37,398/QALY was estimated. One-way sensitivity analysis of entrectinib versus BSC was more sensitive to ±20% variation in PFS utility values, disease diagnostic costs, and OS. 27 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA The micro-cost study included in one of the HTA reports estimates that the cost of NGS is around 16,000 NOK per sample, but when this test is performed to study several genes and several samples (NTRK, ROS1, RET and ALK in patients with NSCLC) the costs are reduced to about 2,000 NOK per patient. Of the other 5 studies, two are micro-cost studies carried out in France; another is an English study based on data provided by NICE in which the number needed to screen to identify a patient with NTRK fusions is estimated; another is a cost-effectiveness study, which shows the QALYs and the increase in years of life of larotrectinib compared to the comparator standard treatment (multiple types of treatments) carried out in the Netherlands; another cost-effectiveness study to com- pare entrectinib against standard treatment in cancer patients, also conducted in the Netherlands, and which included the study of NTRK fusions in these patients, using a decision tree (to represent the diagnostic phase) and a microsimulation model (to represent the treatment) and which led to the conclusion that entrectinib was not cost-effective compared to standard treatment (it could be if genetic tests were included in routine practice). Conclusions The identification of tumor-agnostic biomarkers of NTRK, ALK, ROS1 and RET fusion genes is essential given the possibility of access to drugs directed against these genes. Diagnostic tests IHC, FISH, RT-PCR and NGS can detect fusions in these genes. For the detection of NTRK fusions, RNA-based NGS is considered the gold standard. FISH is a high Se and Sp test for the detection of fusion genes, such as ALK, ROS1 and RET. For NTRK, a FISH test is required for each gene. IHC is a valid and widely used technique due to its accessibility and ease of performance, unlike FISH, which requires experience to perform. RT-PCR and liquid biopsy are tests that are not very widespread in clinical practice. The progressive incorpora- tion of NGS panels in laboratories, associated with a decrease in costs, could facil- itate this technology becoming the test of choice for the diagnosis of NTRK fusions and ALK, ROS1 and RET rearrangements. The numerous proposals for diagnostic algorithms and/or recommendations reflect the high interest in this field of precision medicine while demonstrating the lack of a general consensus on its best use. New studies that include a larger number of cancer patients and methodolog- ically rigorous are needed to compare the diagnostic performance of the different tests depending on the type of tumor and the biomarkers under study. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 28 It is also necessary to study the effectiveness of the drugs chosen based on the results of the diagnostic tests and their safety. It is important to include outcome variables of clinical interest but also of interest to patients, such as overall survival and quality of life. The analysis should include a medium and long-term follow-up. In addition, economic evaluation studies are necessary, with data from the diag- nostic tests until the evolution of the patient after treatment. It is necessary that these results can be contextualized to the different health systems. Studies are also nec- essary on key organizational aspects for the implementation of the best diagnostic algorithms and the most appropriate treatments in the field of precision medicine. 29 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 1. Introducción 1.1. Medicina de precisión En los últimos años se ha podido comprobar que determinadas alteraciones moleculares del genoma son las responsables del origen y desarrollo de la mayor parte de los procesos oncológicos, pero, además, se ha constatado que algunas de esas alteraciones moleculares sirven de diana terapéutica sobre la que actúan los denominados fármacos dirigidos. Este nuevo concepto sobre los mecanismos de inicio y evolución tumora- les ha conducido a un cambio fundamental en el tratamiento oncológico, de modo que del anterior enfoque centrado en el órgano afectado y en el tipo histológico del tumor, se ha ido pasando a otra forma de abordaje centrada en los marcadores moleculares presentes en el tumor, facilitando el auge de la denominada medicina de precisión (1). De acuerdo a la definición del National Cancer Institute, la medicina de pre- cisión es aquella «forma de medicina que utiliza información sobre los genes, las proteínas y el entorno de cada paciente para prevenir, diagnosticar y tratar una enfermedad». La ESMO (European Society of Medical Oncology) también quiso respaldar el desarrollo y evolución de la medicina de precisión, reconociendo las implicaciones que este cambio de paradigma en el diagnóstico y tratamiento onco- lógico iba a suponer, tal como manifestó a través de una publicación en 2014 (2). El fundamento de la medicina de precisión es poder diseñar el tratamiento médico más ajustado a las características de cada paciente de modo que estos se clasifiquen en subpoblaciones que difieren en la susceptibilidad a una enfermedad concreta y su respuesta a un tratamiento específico. En concreto, en pacientes con cáncer, el término medicina de precisión se suele referir a la utilización de fármacos en un grupo de pacientes con alteraciones moleculares específicas, generalmente cambios genómicos o alteraciones en la expresión proteica. En este entorno resulta clave la identificación de los denominados biomarcadores asociados a los tumores. También en la medicina de precisión resulta clave cualquier parámetro medioam- biental o de estilo de vida que lleve a diseñar o modificar el tratamiento (3). Por tanto, el proceso de integrar los datos clínicos, anatomopatológicos y moleculares con el fin de seleccionar el tratamiento óptimo o más adaptado al perfil biológico del tumor constituye la medicina de precisión (4-6). INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 30 Además, recientemente se ha observado que algunas de estas alteraciones gené- ticas se pueden detectar en varios tipos tumorales de diferente histología y localiza- ción, y se han desarrollado fármacos que van dirigidos a dichas alteraciones por lo que estos distintos tumores podrían tratarse con el mismo fármaco específico. De este modo ha surgido el nuevo concepto de tratamientos tumor-agnósticos, trans- versales o independientes del tipo tumoral, que han supuesto un gran avance en la investigación y en el abordaje oncológico pues están desarrollados para actuar en función de una alteración molecular concreta con independencia del órgano de origen del tumor primario. Por ello, el manejo del paciente oncológico ha pasado de estar basado en un modelo histológico a apoyarse, fundamentalmente, en un modelo mutacional que depende del perfil genético del tumor. La medicina de precisión o personalizada permite al profesional planificar las estrategias de un modo individualizado. Con ello se pretende aportar al paciente los mejores resultados clínicos posibles, seleccionando de manera adecuada a aquellos pacientes con determinadas alteraciones moleculares tumorales que pueden res- ponder al tratamiento, y evitando la administración de ciertos tratamientos que no van a ser efectivos y que, por el contrario, pueden ocasionar graves efectos adver- sos o retrasos en la instauración de otra terapia que sí pueda ser efectiva (7,8). Por otro lado, en el aspecto económico, la personalización del tratamiento permitiría una optimización de los costes asociada a unos tiempos menores de hospitaliza- ción y al hecho de evitar un gasto innecesario por no administrar tratamientos a determinadas personas no respondedoras, contribuyendo así a la sostenibilidad de los sistemas sanitarios, siempre que se haga un uso correcto de los recursos, pues el estudio molecular se realizaría sobre un elevado número de pacientes, pero sólo un número limitado se beneficiaría del tratamiento. La llegada de nuevas terapias de gran efectividad pero sólo efectivas en pacien- tes con determinadas alteraciones genéticas, viene acompañada de la necesidad de encontrar estrategias diagnósticas para identificar a aquellos pacientes que se pueden beneficiar de estos tratamientos según sus características específicas fisio- lógicas y genéticas, y que puedan ser finalmente implementadas en los hospitales para conseguir el tratamiento óptimo de dichos pacientes. La implementación de técnicas diagnósticas requiere un proceso de aprendizaje de los profesionales y un uso adecuado de recursos (9). En este contexto resulta esencial identificar la presencia de biomarcadores tumorales. Es posible diferenciar hasta cuatro tipos de biomarcadores: de predis- posición (los que sugieren la probabilidad de desarrollar un tumor), los diagnós- ticos (permiten confirmar la enfermedad), los pronósticos (informan sobre cómo 31 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA puede ser la evolución del tumor en un paciente concreto) y los predictivos (infor- man sobre la posibilidad de respuesta o no a un determinado fármaco o los los pre- dictivos de resistencia a un fármaco y los predictivos de efectos adversos) (10). Es fundamental, por ello, que estos biomarcadores puedan ser detectados con gran exactitud por las técnicas diagnósticas (11). El objetivo de la medicina de precisión es que, a partir del estudio del per- fil molecular tumoral en un paciente concreto, se pueda establecer el tratamiento dirigido más apropiado, el más específico y que ocasione menos efectos secunda- rios. El desarrollo de las técnicas de diagnóstico molecular, especialmente de la secuenciación de nueva generación (NGS), ha permitido detectar nuevas alteracio- nes genéticas asociadas al origen de ciertos tumores lo que ha contribuido al avance de la medicina de precisión. Algunos biomarcadores se presentan como eventos raros o muy raros en deter- minados tumores. Se acepta como alteración molecular rara aquella que se da en menos del 5% de los pacientes. Entre estas alteraciones están los reordenamientos ALK y ROS1, presentes en un 3-5% y 1-2% de tumores pulmonares, respectiva- mente, e incluso en porcentajes inferiores en otros tumores. También las fusiones de genes NTRK y reordenamientos RET presentan una incidencia muy baja en los tumores más frecuentes. La identificación de estos biomarcadores predictivos de buena respuesta a determinados tratamientos dirigidos se ha convertido en un reto para los sistemas de salud. Ante esta situación, se plantean dos posibilidades, en general. Una sería realizar screening con pruebas que puedan ser factibles a gran escala, como la inmu- nohistoquímica (IHQ), y sólo en casos positivos utilizar otras técnicas de confirma- ción; otra, utilizar la secuenciación masiva paralela para todos los tumores por su gran capacidad diagnóstica (12). La reducción de costes de los estudios de secuen- ciación masiva y su progresiva implantación en los diferentes centros sanitarios hace que esta técnica se esté convirtiendo en la prueba de elección, como ya lo es en el cáncer avanzado de pulmón. 1.2. Biomarcadores tumor-agnósticos de fusión Los biomarcadores agnósticos con terapias aprobadas o en desarrollo (en fase de ensayo clínico avanzado) constituyen el nuevo paradigma en oncología y son la máxima expresión de la oncología personalizada de precisión, en la que el tratamiento está guiado por las alteraciones moleculares y no por el tipo histoló- gico o localización del tumor. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 32 Como define la ESMO, un biomarcador es «una característica que es medida o evaluada de forma objetiva como un indicador de un proceso biológico normal o de un proceso patológico o de respuesta a una intervención terapéutica». Algunos biomarcadores se forman por reordenamiento de genes, y algunos de estos reordenamientos generan los llamados genes de fusión. Las fusiones de genes son uno de los tres tipos principales de alteraciones genéticas en procesos tumora- les y son responsables de una gran variedad de tumores. Los más estudiados son los genes de fusión ALK, RET, ROS1 y NTRK. Los genes de fusión están ocasionados por roturas del gen y creación de nuevas moléculas oncogénicas, y resultan en una expresión genética o una activación cons- titutiva de la vía. Algunas de estas alteraciones genéticas pueden tener un impacto significativo en el tratamiento de algunos tumores porque han mostrado suscepti- bilidad a algún fármaco específico. Son las alteraciones moleculares accionables o intervenibles. A medida que se van conociendo nuevas alteraciones intervenibles, se van desarrollando fármacos dirigidos frente a ellas, por lo que se hace necesario disponer de tecnologías capaces de detectar dichas alteraciones de forma rápida y económica con el fin de incorporarlas a la práctica clínica y que formen parte del diagnóstico rutinario. La importancia de identificar la presencia de estos biomar- cadores de fusión en el proceso tumoral de un paciente radica en la posibilidad de utilizar determinados fármacos tumor-agnósticos de mayor efectividad y seguridad clínica que el tratamiento convencional. 1.2.1. Fusiones del gen NTRK El gen NTRK (receptor de tirosina quinasa neurotrófico, neurotrophic tyro- sine receptor kinase) incluye tres genes, NTRK1, NTRK2 y NTRK3, localizados en los cromosomas 1, 9 y 15, respectivamente. Estos genes codifican las proteínas del receptor quinasa de la tropomiosina (tropomyosin receptor kinase, Trk), que inclu- yen tres proteínas de membrana (TrkA, TrkB y TrkC). Estas proteínas son recep- tores involucrados en la regulación del crecimiento, diferenciación y apoptosis de las neuronas del sistema nervioso central y periférico por lo que se expresan en gran cantidad en el sistema nervioso, pero también en algunos tejidos no neuro- nales, como los sistemas cardiovascular, endocrino, reproductor e inmunológico. Cada receptor está formado por un dominio extracelular (a través del cual se unen a un ligando), una región transmembrana y un dominio quinasa (ATP-binding) intracelular, con actividad de tirosina quinasa. Cuando el ligando neurotrofina (NTF) se une al dominio extracelular del receptor, se activan la oligomerización de los 33 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA receptores y la fosforilación de residuos de tirosina específicos en el dominio quinasa intracitoplasmático, y como consecuencia de ello se genera una cascada intracelu- lar de señales que conducen a la activación de la PI3K/AKT (Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B) y MAPK (vía de la proteína quinasa activada por mitóge- nos, mitogen-activated protein kinase) que, a su vez, inducen la proliferación, dife- renciación y supervivencia de las células neuronales normales y neoplásicas (13,14). Las NTF son específicas para cada receptor. Así, el factor de crecimiento neu- ronal (NGF, nerve growth factor) activa la proteína TrkA; el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, brain-derived neurotrophic factor) y la NTF 4/5 acti- van la TrkB; y la NTF-3 activa la TrkC (15). La unión de NGF a TrkA y de BDNF a TrkB llevan a la activación de las vías MAPK/RAS/ERK, PLC-ɣ (fosfolipasa C-gamma) y PI3K con la consiguiente proliferación y crecimiento celular, diferen- ciación y supervivencia neuronal; y la unión de NTF-3 a TrkC activa la vía PI3K/ AKT lo que impide la apoptosis e incrementa la supervivencia celular. Las fusiones de genes NTKR consisten en la rotura de una sección de un cro- mosoma que contiene el gen NTRK y su posterior unión a otro gen en otro cromo- soma. Todos los genes de fusión NTRK identificados implican la unión de la región 3´ de uno de los genes NTRK (que contiene el dominio quinasa) con la región 5´ (N-terminal) de otro gen diferente (el par de fusión), mediante reordenamiento intra o intercromosómico. El oncogén de fusión quimérico codifica una proteína que con- tiene el N-terminal del par de fusión unido al C-terminal de la proteína Trk (donde se encuentra el dominio tirosina quinasa). El transcrito de fusión codifica las pro- teínas Trk de fusión, en las que el dominio tirosina quinasa está siempre presente, mientras que el dominio transmembrana sólo está presente en determinados tipos de fusiones. Estas proteínas de fusión resultantes son proteínas quiméricas onco- génicas u oncoproteínas, constitutivamente activas, con capacidad para iniciar y perpetuar la activación continuada ligando-independiente de las vías de señaliza- ción en cascada «downstream» PI3K/AKT y MAPK. La mayoría de las fusiones se dan en los genes NTRK1 y NTRK3, salvo en los tumores cerebrales primarios en los que la fusión más frecuente es en NTRK2. Cada gen NTRK se puede fusionar con diferentes genes. La fusión más frecuente (>75%) es la ETV6-NTRK3, que consiste en una translocación t(12;15)(p13:q25) (16). Otras fusiones frecuentes son la LMNA-NTRK1 y EML4-NTRK3, pero se han descrito numerosos pares de fusión (17). Las fusiones que afectan al gen NTRK se encuentran entre las primeras trans- locaciones de genes descritas en cáncer. Su presencia indicaría que esta alteración genética está en el origen del proceso tumoral, ya que es mutuamente excluyente de otros iniciadores oncogénicos, tal como se ha confirmado en los estudios Voyager-1 y INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 34 Voyager-2 de bases de datos de evidencia del mundo-real (RWE) (18,19), así como en otros trabajos con tumores de mama y carcinoma colorrectal CCR (17). Se considera un biomarcador oncológico de referencia pues está presente en una gran variedad de tumores sólidos y hematológicos, tanto en pacientes adul- tos como pediátricos, aunque con una frecuencia considerablemente variable entre unos y otros. La revisión sistemática y meta-análisis realizados por Forsythe y cols (20) analizó la literatura publicada entre enero de 1987 y enero de 2020, incluyendo 101 tipos histológicos y 222 estudios. Este estudio permitió constatar la presencia de fusiones de NTRK recurrentes o casi constantes en ciertos tumores poco frecuen- tes, mientras que en tumores de gran prevalencia, su presencia es muy escasa. Los resultados de incidencia global y prevalencia global a 5 años de fusiones NTRK en tumores sólidos fueron 0,52 y 1,52 por 100.000 habitantes en 2018, respecti- vamente, que están por debajo del umbral establecido para definir una enferme- dad ultra-rara. En la Tabla 1 se muestran los resultados de prevalencia para algu- nos tumores de este estudio. Tabla 1. Frecuencia de fusiones NTRK en algunos tumores Tumor Frecuencia de fusiones NTRK IC 95% de la frecuencia de fusiones NTRK Carcinoma secretor de mama 92,9% 72,6-100 Carcinoma secretor análogo de mama de glándula salival (MASC) 79,7% 62,8-96,5 Fibrosarcoma infantil 90,6% 67,4-100 Nefroma mesoblástico congénito 21,5% 13,1-32,2 Glioma de alto grado 21,2% 8,98-38,91 CCR 0,26% 0,15-0,36 Cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) 0,17% 0,09-0,25 Carcinoma de mama invasivo 0,10% 0,03-0,18 En tumores poco frecuentes como el fibrosarcoma infantil, el carcinoma secre- tor de mama y el MASC, la incidencia de las fusiones NTRK es muy elevada. El fibrosarcoma infantil es el sarcoma de partes blandas (SPB) más frecuente en niños y niñas menores de 1 año, y presenta fusiones ETV6-NTRK3 en más del 85% de casos mientras que en el porcentaje restante son muy frecuentes otras fusiones NTRK3 y NTRK1. Lo mismo ocurre en el nefroma mesoblástico congénito celular, donde las fusiones ETV6-NTRK se presentan en la mayoría de pacientes, aunque también se han descrito otras fusiones NTRK3. En más del 90% de los carcinomas secretores 35 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA de mama y MASC también presentan fusiones ETV6-NTRK (21). La prevalencia del cáncer de tiroides infantil está en torno al 4%, siendo más de un 90% carcino- mas papilares de tiroides (CPT) y un 26% de estos CPT presentan fusiones NTRK (NTRK1 y NTRK3), especialmente en aquellos tumores inducidos por radiaciones y, en general, muestran un peor pronóstico. En sarcomas y gliomas infantiles, la frecuencia de fusiones NTRK es <5%, mientras que se ha estimado una prevalencia intermedia de 5-25% en el CPT, mela- nomas spitzoides y tumores del estroma gastrointestinal (GIST) en personas adul- tas (14,22,23). En cambio, en tumores muy prevalentes como los de pulmón, CCR, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, melanoma, gliomas y sarcomas de adultos, su frecuencia estaría por debajo del 1%. Westphalen y cols (17) analizaron una gran base de datos de FoundationCORE con más de 295.000 pacientes con cáncer e informaron de un 0,3% de casos positi- vos a fusiones NTRK en 45 tipos diferentes de tumores y en un total de 134 subti- pos histológicos distintos. La prevalencia en pacientes de edad adulta fue de 0,28% y en pacientes pediátricos de 1,34%, en general, y de 2,28% en pacientes menores de 5 años. La fusión más frecuente fue ETV6-NTRK3, tanto en personas adultas como pediátricas (26,4% y 32,7%, respectivamente). En los NSCLC, no se encon- tró relación entre la carga tumoral mutacional (TMB) y la presencia o no de fusio- nes NTRK, mientras que en los pacientes con CCR, aquellos con fusiones NTRK sí presentaban una mayor TMB y una alta inestabilidad de microsatélites (MSI). Otro resultado interesante que ofreció este estudio fue que la edad de pacientes con NSCLC y fusiones NTRK era significativamente menor que la de pacientes con reordenamientos ALK o ROS1 (39 años, frente a 54 y 56, respectivamente). La importancia de la presencia de fusiones NTRK en procesos tumorales radica en que codifican proteínas susceptibles al tratamiento con inhibidores de quina- sas, con los que se han demostrado tasas de respuesta de la enfermedad mayores y más duraderas, independientemente de la edad del paciente, el tipo tumoral y la pareja de fusión de los genes NTRK (14). Sumado a su papel como predictivo de respuesta a estos fármacos, se reconoce también el valor pronóstico de las fusiones NTRK, pues la sobreexpresión de TrkA y TrkC indicaría una evolución favorable en neuroblastomas, mientras que la sobreexpresión de TrkB, que se presenta prin- cipalmente en neuroblastomas con amplificación de MYCN, suele indicar un peor pronóstico (9). Por este motivo, y a pesar de que estos genes de fusión NTRK son poco frecuentes, su detección en la práctica clínica resulta de gran importancia al permitir la selección de aquellos pacientes que se beneficiarían de este tratamiento dirigido y por ello constituyen uno de los principales objetivos sobre los que tra- bajar en la terapia personalizada (24). INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 36 1.2.2. Reordenamientos ALK El gen ALK (anaplastic lymphoma quinasa, quinasa del linfoma anaplásico) está situado en 2p23.1 en el brazo corto del cromosoma 2. ALK codifica una pro- teína transmembrana que es un receptor tirosina quinasa miembro de la superfa- milia de los receptores insulin-like, que normalmente se expresan en intestino del- gado, testículo y cerebro. Entre los reordenamientos ALK, un 95% de los casos se produce por la rotura de los genes ALK y EML4 (echinoderm microtubule-associated protein-like 4) y su pos- terior fusión en dirección opuesta: inversión intracromosómica en el brazo corto del cromosoma 2 [Inv (2)(p21p23)], de modo que la terminación 5´del EML4 queda junto a la terminación 3´ del ALK. El resultado final es el oncogén de fusión EML4-ALK que inhibe la apoptosis y favorece la proliferación celular tumoral. La transloca- ción ALK determina la expresión de la proteína de fusión resultante, que activa al dominio intracelular independiente de ligando (tras la unión del ligando, ALK se dimeriza, se fosforila y se activa la proteína tirosina quinasa) y así activa múlti- ples vías de señalización aberrante de ALK, como las vías PI3K/AKT, RAS/RAF/ MAPK y JAK/STAT3, responsables de la transformación, proliferación y supervi- vencia de las células tumorales. Las fusiones ALK se pueden detectar en distintos tipos de tumores como el cáncer de mama, CCR y de pulmón. En torno al 4-8% de los NSCLC presenta reordenamientos ALK (25,26) y se estima una prevalencia global de las variantes 1-3 del gen de fusión EML4-ALK cercana al 82% (IC 95%: 76,68-86,99%) (27). Otros reordenamientos ALK se producen con otros pares de fusión, como NPM1, TPM4, KIF5B, TFG o KLC1, entre otros. Generalmente, la presencia de reordena- mientos ALK suele ser excluyente de mutaciones EGFR o KRAS. Pacientes con tumores NSCLC ALK positivos presentan con mayor frecuen- cia ciertas características: suelen ser pacientes más jóvenes (mediana de 52 años) que la media de pacientes con cáncer de pulmón, no fumadores o de bajo con- sumo tabáquico y con predominio del tipo histológico de adenocarcinoma (28,29). Muchos progresan desarrollando metástasis cerebrales. De hecho, se estima que en el momento del diagnóstico, un 30% de pacientes con tumores asociados a reorde- namientos ALK presenta metástasis en el sistema nervioso central (SNC). Aunque el número de pacientes portadores con NSCLC de estas alteraciones es bajo, su correcta identificación resulta muy importante ya que el tratamiento con inhibidores tirosina quinasa (TKIs) se ha asociado a unos buenos resultados terapéu- ticos (30,31). La mayoría de las guías recomienda que pacientes con adenocarcinoma 37 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA de pulmón sean estudiados para determinar si presentan reordenamientos ALK y se aconseja realizar este estudio antes de iniciar el tratamiento de primera línea (32). 1.2.3. Fusiones del gen ROS1 El gen ROS1 (ROS proto-oncogene 1) se localiza en el brazo largo del cro- mosoma 6 (6q22.1). Este gen codifica una proteína que es miembro de la familia de los receptores de insulina que controlan el ciclo celular y la proliferación celu- lar a través de las vías STAT3 y PI3K/AKT/mTOR. Cuando se presentan fusiones ROS1, se produce la activación constitutiva de la tirosina quinasa que tiene un efecto oncogénico. Durante el reordenamiento, el fragmento 3´ del gen se puede unir a diferentes pares (CD74, EZR, CCDC6, TPM3, SDC4, SLC34A2, etc) siendo la alteración CD74-ROS1 la más frecuente- mente detectada. La presencia de estas alteraciones en ROS1 suele ser excluyente de mutaciones EGFR, ALK o KRAS (V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral onco- gene homolog), por ello, se recomienda el estudio de todas estas alteraciones en el momento del diagnóstico (33). Las fusiones ROS1 se han identificado en un 0,2-2,4% de los CCR y en un 1-2% de los NSCLC. De igual manera que los reordenamientos ALK, la aparición de los genes de fusión ROS1 en NSCLC se da con mayor frecuencia en pacientes más jóvenes, mujeres y no fumadores o en fumadores leves y en adenocarcinomas (29,34). Alrededor de un 20-30% de pacientes con NSCLC positivos a ROS1 pre- senta metástasis cerebrales en el momento del diagnóstico (35). Además, en un 40% de estas personas enfermas se han descrito eventos tromboembólicos (36). Para que las personas sean candidatas a terapia dirigida es necesario confir- mar que son positivas a este reordenamiento ROS1. Se recomienda que en pacien- tes con NSCLC no-escamoso avanzado se realicen estudios para identificar reor- denamientos ROS1, independientemente de sus características clínicas de cara de tomar la decisión terapéutica (13,29). De igual modo, resulta importante conocer si la persona a tratar no presenta estas alteraciones moleculares para evitar some- terles a un tratamiento ineficiente y costoso. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 38 1.2.4. Reordenamientos RET El gen RET (rearranged during transfection) juega un papel importante en el desarrollo de los riñones y del sistema nervioso. RET está localizado en el brazo largo del cromosoma 10 (10q11.21) y codifica un receptor tirosina quinasa con un dominio extracelular, otro dominio transmembrana y el dominio tirosina qui- nasa intracelular. La fosforilación de los residuos de tirosina intracelular conduce a la activación del receptor RET, lo que activa varias vías descendentes como la RAS-MAPK, PI3K-AKT, JAK-STAT implicadas en la proliferación y superviven- cia celular. Algunas alteraciones genéticas, como los reordenamientos RET, se han iden- tificado en el crecimiento y proliferación de varios tumores, especialmente el CPT y el NSCLC (37). Los reordenamientos RET implican la secuencia 3´ de RET, que codifica el dominio quinasa, y la secuencia 5´ del otro gen, del par de fusión. Un 10-20% de los CPT presenta fusiones RET, especialmente los carcinomas indu- cidos por radiación, siendo los reordenamientos más frecuentes los CCDC6-RET y NCOA4-RET. El 1-3% de los NSCLC están asociados a reordenamientos RET (38,39), lo que supone más de 37.000 pacientes al año, según estimaciones de la OMS (https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer), siendo más frecuente en adenocarcinomas y en pacientes con determinadas características clínicas como ser no fumadores o con una historia de mínima exposición al tabaco y ser relativa- mente jóvenes (≤ 60 años) (29,37). Desde que en 2012 se descubriera la presencia de reordenamientos RET en NSCLC, se han identificado numerosos tipos diferen- tes de fusiones aunque la más frecuente se produce entre el intrón 11 del gen RET y el intrón 15 del gen KIF5B (40). La presencia de fusiones RET suele ser exclu- yente de alteraciones en otros genes como EGFR, KRAS, ALK, ERBB2 o BRAF (41). También se han descrito reordenamientos RET en otros tumores como tumo- res spitzoides, colangiocarcinomas, CCR, cáncer de ovario, páncreas y glándulas salivares, en una frecuencia muy baja (<1%), mientras que las mutaciones RET se han descrito en el carcinoma medular de tiroides (CMT) y en el síndrome de neo- plasia endocrina múltiple tipo 2 (MEN 2) (38,42-44). 1.3. Técnicas diagnósticas Ante la evidencia del beneficio clínico de varios TKIs, tanto selectivos como multiquinasa, con una alta efectividad terapéutica y un buen perfil de tolerabilidad y 39 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA seguridad, ha surgido la necesidad de establecer posibles aproximaciones diagnósti- cas para identificar pacientes oncológicos con fusiones NTRK, ALK, RET y ROS-1. Las principales técnicas diagnósticas de laboratorio propuestas para identificar estos biomarcadores agnósticos son la IHQ, la hibridación in situ por fluorescen- cia (FISH), la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) y la NGS de DNA o RNA. 1.3.1. IHQ Engloba varias técnicas que mediante el uso de anticuerpos específicos marca- dos con una etiqueta colorimétrica, contribuye a identificar la expresión de determi- nados antígenos (proteínas), a diferencia de la FISH y RT-PCR que detectan fusio- nes a nivel de DNA y RNA. En el caso de tumores con fusiones NTRK, el estudio IHQ permite detec- tar la sobreexpresión de Trk, que puede considerarse un marcador subrogado de presencia de genes NTRK de fusión. La IHQ utiliza anticuerpos frente las pro- teínas específicas TrkA o TrkC o frente a cualquiera de las tres proteínas con un único anticuerpo pan-Trk (el más utilizado es EPR17341, anticuerpo monoclonal pan-Trk aprobado para uso diagnóstico in vitro, de Ventana Medical Systems) (45). Dado que en la mayoría de los tejidos adultos normales la presencia de las proteí- nas TrkA/B/C es muy escasa, esta técnica IHC resulta muy sensible para detectar fusiones NTRK (46-48). Es imprescindible contar con controles internos para evitar los FP que, gene- ralmente, se asocian a fusiones NTRK3 (49,50). Los tejidos adultos normales testi- cular, de ganglios submucosos de colon y el tejido nervioso, sí expresan de forma normal proteínas Trk, por lo que se deben utilizar como controles tisulares posi- tivos, siendo el apéndice el control positivo más utilizado (16). La positividad de las estructuras neurales de la pared del apéndice asegura un buen funcionamiento de la fase analítica de la IHQ. Resulta necesario que la muestra esté adecuadamente fijada para evitar hete- rogeneidad en la tinción. Los casos IHQ positivos muestran una positividad difusa en los tejidos neoplásicos, aunque el grado de tinción pueda ser variable. Algunos estudios proponen que los tumores con al menos un 1% de células neoplásicas posi- tivas (tinción positiva respecto al fondo) deben considerarse positivos en el estu- dio IHQ (51), aunque lo más frecuente es que más del 50% de las células tumo- rales presente tinción con una intensidad ≥ 2+, en una escala de 0 a 3+ (negativa, INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 40 débil, moderada y fuerte). Existen diferentes patrones de tinción subcelular: cito- plasmática, membranosa, nuclear y perinuclear. La positividad nuclear se ha des- crito en más del 50% de pacientes con fusión ETV6-NTRK3 (46), pues la proteína codificada por ETV6 se localiza en el núcleo celular. Por el contrario, los tumores que presentan fusiones LMNA-NTRK1 suelen mostrar una tinción citoplasmática difusa y más fuerte que la observada en fusiones NTRK3. La IHC es un método coste-efectivo, seguro, con un tiempo de respuesta (TAT) rápido de 1-2 días, requiere de una cantidad pequeña de material, y puede ser efectiva, incluso, en muestras de calidad no óptima (a diferencia de RT-PCR y NGS donde una calidad adecuada es imprescindible). Además, la IHQ se encuen- tra disponible en la mayor parte de los laboratorios por ser fácil de implementar y validar, y presenta un coste relativamente bajo en comparación a los tests mole- culares. Puede realizarse sobre muestras fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE). Por todas estas ventajas, se acepta como técnica de screening inicial para la detección de fusiones NTRK (52). Dado que mide la expresión de las proteínas Trk, cuando el resultado de la IHQ es negativo, se puede descartar la presencia de fusiones NTRK, mientras que en casos de resultado positivo, se debería realizar una prueba confirmatoria (generalmente, una técnica molecular). Como la IHQ se con- sidera un método de screening, es muy importante que presente una alta sensibili- dad puesto que ante un paciente con un resultado de IHQ negativo es improbable que se vuelva a testar para fusiones NTRK (16). Se ha informado de una sensibilidad (Se) de 87,9% y especificidad (Sp) de 81,1% (16), aunque en otros estudios la IHQ alcanzaba valores superiores, Se de 95-97% y Sp de 98-100%, valor predictivo positivo (VPP) de 97% y valor predic- tivo negativo (VPN) de 98% (23). En el estudio de Solomon y cols (53), con casi 34.000 pacientes, la Se de la pan-Trk IHQ fue del 96,9% y la Sp del 81,1%. Con IHQ es posible detectar las tres fusiones del gen NTRK, pero no es posi- ble identificar el par de fusión. Otra desventaja de esta técnica es que la interpre- tación de los resultados puede ser subjetiva y complicada en tejidos que expresan de forma fisiológica las proteínas Trk (presentarían una tinción de fondo), por ello, en estos casos su especificidad se reduce (aumentan los falsos positivos, FP), por ejemplo, en tumores del sistema nervioso, tumores neuroendocrinos, sarcomas o GIST (45,53). Para estos tumores, sería más aconsejable utilizar técnicas molecu- lares en lugar de la IHQ. Otros posibles errores son los falsos negativos (FN) se refieren a la identifi- cación de fusiones NTRK3 donde se muestra una tinción mucho más débil que si son fusiones NTRK1/2 (46). Así, se ha informado de una Se para detectar fusiones NTRK1 y NTRK2 del 96% y 100%, respectivamente, mientras que para NTRK3 los 41 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA valores oscilaban entre 54,5% a 79% según algunos estudios (51-53). También en sarcomas la Se resultó menor (en torno al 80%), probablemente relacionado con una sobre-representación de fusiones ETV6-NTRK3 cuyo patrón de tinción nuclear puede ser muy heterogéneo. También tiene como desventaja que la IHC detecta la expresión tanto de la proteína nativa (wildtype) como de la proteína de fusión, pero no permite diferen- ciarlas, por lo que la expresión de los receptores no es diagnóstica de genes de fusión NTRK1/2/3, sino que su detección sólo sugiere que es probable que exista dicha fusión (49). Otro inconveniente es que el número de antígenos por análisis es limitado. Para identificar reordenamientos ALK, el único test IHQ aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) como companion diagnostic (CDx) para los inhibidores ALK crizotinib, ceritinib, alectinib y lorlatinib es el test Ventana ALK (D5F3) CDx Assay (Ventana Medical Systems, Inc.) (54,55). Ver Tabla 6 de Anexo II. Otro anticuerpo de similar Se y Sp es 5A4 (56). La IHQ permite detectar los niveles de proteína ALK, que se considera un marcador subrogado muy efec- tivo de reordenamientos ALK. En general, la cantidad de proteína producida por los NSCLC positivos a reor- denamientos ALK es muy inferior a la de otros tumores, por eso, para su detección mediante IHQ se deben utilizar anticuerpos de alta afinidad y en ocasiones se ha propuesto utilizar amplificadores de señal aunque esto se suele desaconsejar por- que interfiere en la intensidad de señal, que es un criterio para realizar el diagnós- tico, e incluso puede invalidar la clasificación de la intensidad. Se recomienda un mínimo de 10 muestras positivas para validación técnica (57). La IHQ podría emplearse como test de screening por sus ventajas (rápido, rela- tivamente sencillo, de bajo coste) para identificar posibles casos positivos pero des- pués se requiere confirmación por otra prueba, generalmente, por FISH. Algunos tumores positivos con IHQ han dado resultado negativo con FISH y esto puede deberse a diferentes motivos como la dificultad de interpretación de casos FISH cercanos al nivel de positividad, la presencia de reordenamientos complejos que dificultan la interpretación de FISH llevando a FN de FISH, la amplificación del gen ALK que suele presentar una baja intensidad de tinción, posibles FP de la IHQ por errores en su interpretación o bien por alteraciones genéticas que lleven a una sobreexpresión de la proteína pero que no esté asociada a reordenamiento ALK (25). La IHQ como técnica de screening para identificar reordenamientos ROS1, presenta unos resultados de Se similares a FISH o RT-PCR, pero su Sp es menor dependiendo de los criterios de positividad utilizados (58,59). Hasta el momento, INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 42 no existen tests IHQ aprobados por la FDA, pero sí hay dos anticuerpos disponi- bles en el mercado (D4D6 y SP384). Se han propuesto diferentes criterios de inter- pretación de la IHQ: de 0 a 3 según la intensidad de tinción o por diferentes puntos de corte, considerando que un resultado es positivo si presenta intensidad mode- rada/fuerte si 2+/3+ o si el H-score es >100 o >150. Cada laboratorio debe validar su propio rango de valores interpretativos pues todavía no hay unos valores estan- darizados. Para ROS1 no existe un tejido normal que se pueda utilizar como ade- cuado control positivo, sino que se recomienda utilizar tejido tumoral positivo a ROS1. La tinción en estos casos ROS1 positivos suele ser citoplasmática aunque se han descrito diferentes patrones de tinción (25). Por su variable especificidad, se aconseja que ante un resultado positivo o dudoso, se aplique una prueba confirma- toria, bien pruebas citogenéticas como FISH o moleculares como RT-PCR o NGS. A diferencia de los reordenamientos en los genes ALK y ROS1, las fusiones RET no se pueden identificar de forma correcta mediante IHC (60). 1.3.2. FISH Se trata de una técnica de citogenética molecular que detecta alteraciones cro- mosómicas tanto numéricas como estructurales en locus específicos de protoonco- genes o genes supresores de tumores. La FISH se basa en el uso de sondas de DNA o RNA marcadas de forma fluo- rescente que se unen a secuencias complementarias en muestras tumorales FFPE. En general, pueden distinguirse varios tipos de sondas: las sondas centroméricas, las teloméricas, las sondas de cromosomas enteros y las sondas locus específico (o de secuencia única). Las sondas centroméricas se utilizan para la detección de alteraciones numéricas y como control de referencia de sondas locus específico, mientras que estas últimas se usan para la detección de translocaciones, delecio- nes o amplificaciones. Las locus específico pueden ser sondas de fusión, que estu- dian la unión de dos regiones génicas, después de una translocación previa o por una deleción, que hace que dos genes que en principio se encuentran distantes en el genoma entren en proximidad, y sondas break-apart o de separación, que estudian el intercambio o desplazamiento de material genómico entre dos cromosomas (61). La FISH ha mostrado buenos valores de Se y Sp para detectar diferentes ano- malías cromosómicas. Presenta una alta fiabilidad y su rendimiento es alto incluso con muestras de baja pureza tumoral (45,62). Otras ventajas de FISH son la posi- bilidad de utilizarla en muestras de tejido fresco o FFPE tumoral, utilizando sólo uno o dos cortes de la muestra, que su TAT suele ser inferior a 7 días laborables, 43 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA generalmente entre 1-3 días, y que no es un requisito tener conocimiento previo del par de fusión (a diferencia de RT-PCR que sólo puede detectar pares de fusión conocidos). FISH ha sido considerada como el gold standard para la detección clí- nica de fusiones de genes (63). Se trata de una técnica más precisa que la IHQ, pero más compleja y laboriosa de ejecutar, con un coste más alto, además de que su interpretación resulta más difícil, siendo necesario contar con un patólogo con experiencia. FISH no puede diferenciar entre distintos pares de fusión. Otras desventajas de FISH son la nece- sidad de disponer de un microscopio de fluorescencia, que el número de alteracio- nes evaluadas por análisis es limitado y que resulta algo más difícil de implemen- tar de forma rutinaria en los laboratorios. Además, FISH no puede confirmar si el gen de fusión se ha transcrito (21). Resulta muy importante la fase pre-analítica de esta prueba donde un pató- logo debe señalar la sección para análisis FISH en una muestra tisular teñida con hematoxilina-eosina (H&E) que sea representativa del tejido tumoral. El grosor de la muestra FFPE puede influir en los resultados FISH, de modo que se recomienda que sea de 4±1 µm. El porcentaje de células tumorales presentes en la muestra es un elemento clave ya que un bajo porcentaje llevaría a unos resultados no infor- mativos. Por eso, la muestra más adecuada para estudio con FISH sería la obte- nida durante la cirugía, mientras que muestras citológicas son más susceptibles de presentar resultados no-interpretables. Es importante recoger información sobre el almacenamiento y procesamiento de las muestras, el diagnóstico patológico y la posible presencia de necrosis. Las muestras citológicas deben ser fijadas en forma- lina y almacenadas como bloques celulares. Las muestras quirúrgicas deben fijarse y almacenarse como bloques FFPE. Se considera el método más sensible para detectar reordenamientos ALK y ROS1. Para estudiar el reordenamiento de ALK se utilizan sondas FISH break apart; un fluorocromo se unirá a la región centromérica 3´ y la otra sonda, a la telo- mérica 5´. Son sondas de color dual: la sonda 3´ ALK se vería naranja mientras que la 5´ ALK aparecería de color verde. Este test requiere un mínimo de 50 células. Se consideran células positivas a reordenamientos ALK cuando las señales naranja y verde adyacentes están separadas una distancia superior a dos veces el diámetro de esas señales, o cuando coexisten dos señales de fusión con una señal naranja. También se considera positivo si aparecen naranjas aisladas nucleares. Las células se consideran negativas a reordenamientos ALK cuando se observan dos señales de fusión con una distancia entre los bordes de las señales inferior a 2 veces el diá- metro de las señales, o una señal de fusión con una señal verde sin su correspon- diente señal naranja, o cuando se observan núcleos con solapamiento de las seña- les de fusión que aparecen en color amarillo o naranja. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 44 Una muestra se considera positiva cuando más de 25 células de 50 (>50%) son ALK-positivas; se considera negativa si menos de 5 células de las 50 (<10%) son ALK-positivas; y se considera que el resultado es incierto o equívoco si entre 5-25 células (10-50%) son positivas. Para estos casos dudosos un segundo profe- sional debería realizar el contaje de células positivas en la muestra: si el porcentaje de células positivas es <15% (<15 células de 100), la muestra se considerará nega- tiva, mientras que si es ≥15% (≥15 células de 100) se considerará positiva (64). Para detección de reordenamientos ALK, el único test FISH aprobado como CDx por la FDA en pacientes con NSCLC antes de tomar la decisión de tratamiento con crizotinib o brigatinib es Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular, Illinois, USA). Ver Tabla 6 de Anexo II. Este kit también es válido para estudiar reordenamientos ROS1 en muestras FFPE. Para el estudio de reordenamientos ROS1, se considera que el gold standard es FISH con sondas de color dual break-apart (65). Se recomienda que la inter- pretación sea realizada por dos personas, en un mínimo de 50 células tumorales y se acepta un nivel de corte de un 15% de células anormales para considerar el test positivo (28), aunque dentro del mismo tumor pueden existir diferentes patrones de señales anormales. El test se informa como positivo cuando las sondas están separadas por una distancia igual o mayor al diámetro de la señal y/o se muestran 3´ señales separadas (37,66). Generalmente, el color de las señales es el contrario a los reordenamienteos ALK: 3´ ROS1 se marca en verde y 5´ ROS1 en naranja. Si el resultado es incierto (sólo positivas entre el 10-15%) es necesario confirmar con otra técnica. En casos donde no hay reordenamiento ROS1, el solapamiento de ambas sondas produce una señal amarilla, mientras que las señales naranja y verde aparecen separadas. La imagen positiva a ROS1 puede presentar dos patrones: el clásico con una señal de fusión (ROS1 nativo) y dos señales separadas 3´ y 5´, y el patrón atípico con una señal nativa ROS1 de fusión y una señal aislada 3´ verde sin la correspon- diente señal 5´ naranja. No obstante, se han descrito algunos FP porque una señal aislada 3´ puede representar una deleción de ROS1 que no sea funcional. También se han descrito FN por la presencia de patrones FISH atípicos como doble señal naranja, debidos a reordenamientos complejos. Algunos test FISH permiten analizar de forma simultánea reordenamientos ALK y ROS1, con la ventaja de aprovechar de forma más eficiente el tejido dispo- nible. Sin embargo, FISH es una técnica demasiado laboriosa y de elevado coste para realizar el screening, por lo que en general, se acepta que este se debe realizar 45 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA con IHQ y posterior confirmación de los casos IHQ positivos con FISH o por méto- dos citogenéticos, y que además de ROS1 se busquen alteraciones ALK y EGFR. Para reordenamientos RET, aunque no existe un protocolo diagnóstico acep- tado de forma universal, ya se ha comentado que la IHQ no se considera un método adecuado, mientras que FISH y RT-PCR serían pruebas sensibles y efectivas, ade- más de la NGS-RNA. Para fusiones NTRK, se puede utilizar FISH con sondas break-apart. Un resul- tado FISH positivo indica la presencia de variantes estructurales en el gen estudiado, pero no si dichas alteraciones tienen o no significación funcional. Una de las son- das comerciales más utilizadas es la sonda break-apart ETV6 que ha demostrado ser muy efectiva para identificar la presencia de fusiones ETV6-NTRK3 (50); de hecho, en los tumores con alta prevalencia conocida de este tipo de fusión, FISH sería el método de elección para identificarla (62). Se han descrito valores de Se del 80% y de 100% de Sp (23). Una desventaja de la FISH para el estudio de fusiones NTRK es la necesidad de realizar tres ensayos FISH en paralelo, uno para cada gen NTRK, lo que supone una mayor laboriosidad, aumento del tiempo de respuesta e incremento de costes (14). Además, se han descrito algunos FN de FISH para fusiones NTRK1 cuando la separación entre las señales es insuficiente, como se ha descrito en fusiones LMNA-NTRK1 que son causadas por una deleción intracromosómica (21,67). También se ha informado de un 30% de FN en la detección de genes NTRK de fusión en niños con sarcomas (68). Por el contrario, algunas translocaciones cro- mosómicas complejas pueden ocasionar FP en FISH (49). Un gen NTRK intacto se observaría con FISH como un solapamiento de las sondas y una fluorescencia amarilla, mientras que la translocación NTRK se presentaría como señales roja y verde separadas. Se acepta un punto de corte de 10% o 15%, es decir, que se daría como positivo si se detecta que más del 10% o 15% de los núcleos celulares pre- sentan señales verdes y rojas separadas una distancia mayor que dos veces el diá- metro de la sonda (13). Otras técnicas de hibridación in situ son la cromogénica (CISH) y con plata (SISH). CISH evalúa el efecto cromogénico en una reacción enzimática. Se trata de una técnica de fácil realización, con la ventaja de utilizar un microscopio de campo brillante de modo que la morfología se preserva mejor y ser de bajo coste, en com- paración a FISH (69,70). CISH ha demostrado alta Se y Sp para la detección de algunas alteraciones como los reordenamientos ALK y ROS1, con resultados com- parables a FISH, pero todavía la experiencia con esta técnica es limitada (62,71). INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 46 1.3.3. RT-PCR Consiste en extraer el RNA tumoral y convertirlo en secuencias de DNA com- plementario (cDNA) utilizando la transcripción inversa. Después, el cDNA se amplifica resultando en un producto de amplificación PCR sólo cuando está pre- sente una fusión concreta. Se trata de una técnica de gran especificidad, relativamente rápida y de bajo coste. Resulta altamente fiable para las variantes conocidas pero muy poco frente a las desconocidas, por lo que se hace necesario conocer previamente los genes acompañantes de la fusión (64,72), por ello esta prueba puede considerarse en caso de tumores con alta probabilidad de presentar pares de fusiones conocidos, como ETV6-NTRK3 en el fibrosarcoma infantil o en el carcinoma secretor de mama. Otra limitación de la RT-PCR se refiere a la conservación del RNA en el tejido FFPE, pues para que el resultado sea correcto es necesario que el RNA tenga adecuada calidad, pero el RNA extraído de esas muestras FFPE se puede encon- trar muy dañado, siendo el resultado poco fiable. Sin embargo, la RT-PCR puede emplearse en muestras citológicas y muestras de tejido fresco congelado (64). Su TAT es de 1 semana. La utilización de la RT-PCR para detectar fusiones NTRK a partir del RNA de algunos tumores resulta muy limitada en la práctica clínica debido a la gran cantidad de distintos reordenamientos NTRK con múltiples genes, y que habría que diseñar primers específicos para todos ellos, lo que supone una labor com- pleja (16). Se han encontrado resultados de Se de la RT-PCR de tan solo un 25% en muestras FFPE (23). Algunos autores consideran que el uso de FISH y RT-PCR se debería limi- tar a las siguientes tres situaciones: 1) para confirmar fusiones NTRK en tumores raros donde esta alteración es patognomónica o muy frecuente, 2) para confirmar fusiones NTRK3 después de un resultado positivo (tinción nuclear) con IHQ, y 3) tras un resultado equívoco o dudoso de NGS cuando no queda muestra tisular dis- ponible (16). RT-PCR es una técnica muy específica, que podría utilizarse para estudiar reor- denamientos ALK en casos de resultados discordantes entre IHQ y FISH. RT-PCR detectaría la sobreexpresión de transcritos de fusión ALK. El meta-análisis reali- zado por Zhang y cols (73) sobre el uso de RT-PCR para identificar reordenamien- tos ALK en pacientes con NSCLC ha demostrado un alto rendimiento diagnóstico con valores agregados de Se del 92,4% (IC 95%: 82,2%-97,0%) y de Sp del 97,8% 47 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA (IC 95%: 95,1%-99,0%) y un AUROC de 0,99 (IC 95%: 0,98-1,00) en muestras FFPE. Por el contrario, esta prueba no resulta útil para identificar reordenamientos ROS1 en pacientes con NSCLC pues este gen también se expresa en tejido pulmo- nar normal e hiperplásico (25). 1.3.4. NGS Las plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS) son capaces de procesar en paralelo múltiples secuencias de DNA o RNA en un único proceso de secuenciación. El desarrollo de nuevas generaciones de secuenciadores que aplican otras tecnologías de secuenciación en paralelo, hace que hoy día sea más apropiado hablar de secuenciación masiva o High-Throughput (HTS) o secuenciación de alto rendimiento en lugar de NGS (74). Entre estas otras tecnologías de secuenciación en paralelo se encuentran la secuenciación por ligación, la secuenciación por sín- tesis y semiconducción (IonTorrent, de Life Technologies) y la secuenciación por síntesis en clusters (como HiSeq, NextSeq o Novaseq, de Illumina). También se han desarrollado los secuenciadores de tercera generación, que utilizan la secuencia- ción de molécula única (single molecule real-time, SMRT) con la que resulta posi- ble secuenciar moléculas más largas. La HTS permite la lectura de millones de secuencias de DNA de forma masiva y paralela, por lo que es posible estudiar alteraciones moleculares en múltiples genes en una única prueba, en un periodo de tiempo menor y con menor coste por base. Además, permite detectar fusiones nuevas. En el ámbito de la oncología, esta tec- nología ha demostrado gran utilidad por la posibilidad de investigar múltiples onco- genes de forma simultánea y en una misma muestra tumoral, y es la única prueba que permite realizar, de forma simultánea, la determinación de todos los biomar- cadores agnósticos (49). Entre las limitaciones de estas pruebas de secuenciación masiva cabe señalar que requieren una alta especialización y gran experiencia bioin- formática, implican tiempos de análisis y respuesta más largos (aunque nuevas tec- nologías consiguen reducir estos tiempos a menos de una semana) que otros aná- lisis moleculares y que todavía resultan muy costosas. La secuenciación masiva incluye varios pasos. Una primera fase pre-analítica, de recogida, preparación de la muestra y extracción del DNA. Luego, se procede a la fragmentación del DNA generando pequeños fragmentos de diferentes tamaños. La etapa de enriquecimiento de secuencias dianas consiste en seleccionar exclusivamente las áreas de interés antes de la secuenciación. En oncología mole- cular existen dos diseños básicos: métodos de captura por hibridación en fase sólida INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 48 y método de amplificación mediante PCR. Esto se produce en las plataformas de segunda generación, mientras que en las de tercera generación no se requiere la amplificación de los fragmentos de DNA por lo que el tiempo de trabajo y costes son menores. Los métodos basados en captura utilizan la hibridación para gene- rar la librería. Son más complejos, tardan más tiempo en tener el resultado, pero son más efectivos para analizar grupos más grandes de genes o regiones genómi- cas más grandes. Los métodos basados en amplicones utilizan múltiples reaccio- nes PCR para generar la librería. Pueden utilizar la multiplex estándar PCR o el método anchored multiplex PCR (método AMP) para amplificar las secuencias de interés. En el caso de la multiplex estándar PCR es necesario conocer los dos pares de fusión, mientras que con la anchored multiplex PCR no lo es y se pueden estu- diar nuevos pares de fusión. Suele ser un método más sencillo y rápido que el de captura por hibridación, y que ha demostrado presentaraltos niveles de Se y Sp incluso en muestras FFPE (13). Una vez generada la librería de DNA, se procederá a la secuenciación o lec- tura del material genético, al mismo tiempo en todas las moléculas de DNA. Es la secuenciación masiva y paralela. Después, se realizará la reconstrucción de la secuencia completa por medio de secuencias de referencia y exportación a ficheros de almacenamiento de datos. Todo esto requiere potentes programas bioinformá- ticos que analizan las variantes encontradas e identifican las que son patológicas o potencialmente patológicas. El siguiente paso es la validación técnica, aplicando tests que confirmen las variantes encontradas por NGS. El último paso es la vali- dación biológica, que incluye el análisis e interpretación de los resultados de la secuenciación con lo que se emitirá un informe final (75). La NGS permite tres tipos de secuenciación diferentes: la secuenciación de panel de genes específicos o secuenciación dirigida, la secuenciación completa del exoma (WES, whole exome sequencing) y la secuenciación completa del genoma (WGS, whole genome sequencing). La secuenciación dirigida o con paneles de genes: consiste en el aislamiento, enriquecimiento y secuenciación de regiones con- cretas del genoma (regiones codificantes de interés y zonas intrónicas adyacentes). Se utilizan paneles de genes con cebadores o sondas para unos genes conocidos, es decir, que secuencia un número determinado y específico de genes relaciona- dos con una enfermedad. Permiten secuenciar mutaciones conocidas (hot spots), genes completos, detectar variaciones en el número de copias y translocaciones. Es la prueba de menor coste de las tres, se realiza más rápidamente, permite la secuen- ciación de los genes de interés con una gran cobertura y profundidad de lectura, de modo que es posible detectar variantes de muy baja frercuencia. Su interpretación es más sencilla porque hay bases de datos de referencia que asocian las variantes encontradas con la enfermedad relacionada. 49 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Hoy día se dispone de diferentes test NGS para el estudio de fusiones de genes, unos basados en DNA y otros en RNA. La NGS basada en DNA (NGS-DNA) per- mite examinar el DNA tumoral y ha demostrado su alto rendimiento para detec- tar mutaciones, amplificaciones, deleciones, fusiones, el estado de la inestabilidad de microsatélites y la carga mutacional tumoral. También es de gran importancia por su capacidad de detección de variantes somáticas en subpoblaciones de células tumorales (mutaciones subclonales), que están presentes en una proporción pequeña en la muestra tumoral, que no eran detectables por el método de Sanger y que son las responsables de algunas recaídas o de la resistencia al tratamiento de algunos tumores (76). Este procedimiento requiere una adecuada pureza tumoral así como de disponer de muestras tisulares de cortes no teñidos o de FFPE de adecuada cali- dad. El resultado suele estar en un plazo de 2 semanas. Como desventaja cabría señalar que está limitada por el tamaño de los intrones y que en estos intrones es frecuente la presencia de regiones altamente repetitivas que imposibilitan el aná- lisis en casos de captura por hibridación, por esto, la NGS-DNA es menos exacta para detectar genes de fusión que impliquen a grandes regiones intrónicas (21). La NGS basada en RNA (NGS-RNA) presenta algunas ventajas respecto a la basada en DNA como la posibilidad de secuenciar RNA maduro que no se ve afectado por el tamaño de los intrones o por la presencia de fusiones que afecten a múltiples genes y exones simultáneamente. En la NGS-RNA, los intrones se han eliminado en el RNA tras el proceso de splicing, de forma que se eliminan las limi- taciones técnicas de la cobertura intrónica. Este tipo de secuenciación permite estu- diar fusiones de genes y validar mutaciones somáticas detectadas por la secuencia- ción de DNA. Otra ventaja es que la detección de fusiones a nivel de RNA aporta evidencia directa de que son transcritas funcionalmente. La detección de los trans- critos de fusión en muestras tumorales de baja pureza ofrece una alta confianza. En general, la NGS-RNA es una prueba precisa, específica y de muy alta Se que per- mite estudiar múltiples alteraciones genéticas en un solo estudio. El principal incon- veniente del manejo del RNA es su naturaleza lábil, especialmente cuando se trata con muestras FFPE. Si se dañan las muestras, el RNA se podrá romper en fragmen- tos demasiado pequeños a partir de los cuales no es posible obtener información o con los que no se podrán preparar las librerías ni realizar la posterior secuencia- ción. Por ello, resulta fundamental realizar controles de calidad del RNA para evi- tar posibles FN y permitir la reproducibilidad del test. Si la calidad del RNA no es adecuada, habrá que repetir la prueba en otro bloque de parafina, bien de la misma biopsia o pieza quirúrgica o de otras, o utilizar otra segunda prueba de confirmación. Se están desarrollando nuevas plataformas híbridas, que emplean ambas librerías, de RNA y DNA, que podrían convertirse en una herramienta fundamen- tal en el análisis de múltiples biomarcadores en un futuro próximo (14). Ejemplos INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 50 de estos paneles híbridos DNA/RNA son TruSight Tumor 170 (de Illumina) y Oncomine Comprehensive Assay (de Thermo Fischer). La NGS puede realizarse sobre muestras FFPE, frescas y en tejido congelado, pero también es posible analizar el DNA tumoral circulante (ctDNA), lo que se denomina biopsia líquida. Este procedimiento representa una alternativa efectiva en pacientes oncológicos con enfermedad avanzada en los que no es posible rea- lizar biopsia tumoral, o cuando hay limitaciones en el acceso a los tumores (como en los NSCLC) donde resulta compleja la obtención de muestras tumorales; ade- más, ha demostrado ser un método no invasivo, efectivo no sólo para diagnóstico inicial sino también para monitorizar la recurrencia o la progresión tumoral y para valorar la evolución al tratamiento y el potencial desarrollo de resistencias al mismo (37,77). Por otro lado, este método permite estudiar tanto células del tumor prima- rio como de metástasis, que en muchas ocasiones tienen un comportamiento dife- rente, más agresivo que las células del tumor primario; por ello, se recomienda el estudio de alteraciones genéticas en estas células metastásicas pues es muy posi- ble la aparición de heterogeneidad en el patrón molecular. El desarrollo de las técnicas NGS ha permitido identificar los genes de fusión NTRK en un gran número de tumores. Cuando se utilizan paneles de secuenciación, es importante comprobar que se incluyen los tres genes NTRK y ver el número de parejas de fusión que consideran (la anchura del panel). Además, hay que tener en cuenta que las tres fusiones NTRK son mutuamente excluyentes entre sí y que no suelen aparecer junto a otras alteraciones tratables. Se ha informado de una Se global de la NGS-DNA para fusiones NTRK del 81% y una Sp superior al 99%. En concreto, para fusiones NTRK1 la Se resulta muy elevada (96,8%) pero, sin embargo, es claramente inferior para NTRK2 y NTRK3 (77%) por la presencia de regiones intrónicas (no codificantes) grandes y en ocasiones altamente repetitivas lo que resulta en secuencias que no pueden ser identificadas de forma adecuada (14,49). La NGS-DNA también resulta de utili- dad en la monitorización de mutaciones NTRK en pacientes que desarrollan resis- tencias al tratamiento con TKIs. La NGS-RNA podría considerarse el método gold standard para las fusiones NTRK pues se centra en las secuencias codificadoras y no depende del tamaño de los intrones. Los paneles de NGS-RNA presentan mayor Se que los de NGS-DNA; por este motivo, si tras un análisis con estos paneles de DNA el resultado es nega- tivo, es necesario utilizar una prueba de confirmación, especialmente si un estudio previo con IHQ había obtenido un resultado positivo. 51 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Los dos tests NGS-DNA que estudian un mayor número de genes son FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc) y MSK-IMPACT (Memorial Sloan Kettering Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets), ambos apro- bados por la FDA en 2017. MSK-IMPACT se basa en la captura por hibridación, presenta una gran cobertura e incluye regiones codificantes de más de 400 genes relacionados con el cáncer y algunos intrones seleccionados. Este test fue apro- bado como prueba de diagnóstico in vitro para identificar alteraciones genéticas somáticas. Puede detectar mutaciones, indels, alteraciones en el número de copias y algunos genes de fusión, entre ellos el NTRK1/2/3. FoundationOne CDx permite analizar hasta 324 genes. Se aprobó como CDx para estudio de fusiones en los tres genes NTRK en tumores sólidos antes de iniciar el tratamiento con larotrectinib o entrectinib; para valorar la presencia de fusiones ROS 1 en NSCLC previo a admi- nistrar entrectinib y para estudio de reordenamientos ALK en NSCLC antes del tra- tamiento con crizotinib, alectinib o ceritinib. Ver Tabla 6, Anexo II. Otras plataformas de secuenciación dirigidas de DNA para detectar fusio- nes de NTRK son UW Oncoplex, UCSF500 Cancer Gene Panel, y FoundationOne Heme (78). Otros tests NGS han sido aprobados como CDx por la FDA para un gen espe- cífico como Oncomine Dx Target Test (Life Technologies Corporation) para estu- diar fusiones RET en pacientes con cáncer de pulmón y cáncer de tiroides, previo al tratamiento con selpercatinib o praseltinib, y para estudiar fusiones ROS1 en NSCLC previo a tratamiento con crizotinib. Ver Tabla 6, Anexo II. Entre las plataformas NGS-RNA que ofrecen la posibilidad de estudiar fusio- nes NTRK, se incluye el panel de genes de fusión para tumores sólidos GenTrials (Knight Diagnostic Laboratories), diseñado para detectar fusiones que impliquen a 20 dianas en genes incluyendo los NTRK1/2/3; el Universal Fusion/Expression Profile (Neogenomics) capaz de detectar alteraciones en un alto número de genes, incluyendo los tres genes NTRK; OncoDEEP (OncoDNA) realiza el análisis auto- mático de NTRK en su prueba de biopsia sólida para NSCLC, glioblastomas de alto grado en población infantil y cáncer de tiroides, y dado que se trata de una secuen- ciación de RNA, minimiza la posibilidad de FN, que son frecuentes en el análisis basado en DNA. Para cada plataforma se necesita una cantidad diferente de RNA, así que la elección de la tecnología puede depender de cuánta cantidad de tejido haya disponible (13). Las plataformas para secuenciación de ctDNA parecen poco efectivas para monitorizar pacientes con fusiones NTRK (13,79). Así, Guardant360 puede identificar mutaciones en NTRK1 y NTRK3 pero sólo fusiones de NTRK1; AVENIO Extended ctDNA sólo puede detectar fusiones NTRK1; Oncomine Pan-Cancer Cell-Free, sólo INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 52 fusiones NTRK1 y NTRK3; y FoundationOne Liquid no puede estudiar ninguno de los genes NTRK ni ETV6. Además, estas plataformas también tienen una Se muy baja para detectar fusiones ALK en pacientes con cáncer de pulmón. En resumen, en la Tabla 2 se recogen las principales ventajas y desventajas de cada una de estas técnicas diagnósticas. Tabla 2. Principales ventajas y desventajas de cada técnica diagnóstica Ventajas Desventajas IHQ • Alta sensibilidad. • Disponibilidad alta. • Rapidez. • TAT (1-2 días). • Necesita poca cantidad de muestra. • Se puede realizar en tejido FFPE. • Coste bajo. • Interpretación no estandarizada. • Menor utilidad en tumores que expresan Trk de forma fisiológica (como los cerebrales y neuroblastomas). FISH • Alta sensibilidad y especificidad. • Disponibilidad alta. • Rapidez. • Puede utilizarse tejido fresco o FFPE. • Coste moderado-bajo. • Para fusiones NTRK son necesarios 3 tests FISH. • Interpretación no estandarizada. • Sólo puede identificar pares de fusión NTRK conocidos, no los nuevos. RT-PCR • Alta Se y Sp. • Disponibilidad alta. • Rapidez. • Coste bajo. • Sólo puede identificar pares de fusión NTRK conocidos, no los nuevos. • El alto número de posibles pares de fusión limita su aplicabilidad fuera de los tumores con fusiones patognomónicas. • Baja Se (del 25%) para fusiones ETV6-NTRK. NGS • Alta sensibilidad y especificidad. • Estudio simultáneo de múltiples genes y alteraciones genómicas. • Puede utilizarse tejido fresco, FFPE, congelado y ctDNA. • Identifica pares nuevos de fusión (NGS-RNA). • Preferible la NGS-RNA frente a NGS-DNA porque la primera se centra en secuencias codificantes, no en los intrones. • Sensibilidad variable de paneles DNA entre estudios. • Coste elevado. • Acceso limitado. • TAT más prolongado. • NGS-RNA está limitada por la posibilidad de degradación del RNA en muestras FFPE. • NGS-DNA está limitada por el tamaño de los intrones (dificulta la identificación de fusiones NTRK2 y NTRK3, especialmente). ctDNA: DNA tumoral circulante; FISH: hibridación in situ por fluorescencia; FFPE: fijado en formol e incluido en parafina; IHQ: inmunohistoquímica; NGS: secuenciación de segunda generación; RT-PCR: Transcriptasa inversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa; Se: sensibilidad; TAT: tiempo de respuesta. 53 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 1.4. Terapias tumor-agnósticas Los tratamientos tumor-agnósticos o independientes del tipo tumoral tie- nen como diana terapéutica determinadas alteraciones genéticas o características moleculares específicas, independientes del sitio de origen del tumor. Es decir, que la terapia no se basa en el tipo histológico de tumor ni órgano afectado sino en el perfil genético del tumor (80,81). Los tratamientos agnósticos van dirigidos a deter- minados marcadores tumorales que no son específicos de un tumor concreto sino que son compartidos por diferentes tipos de tumores, basándose en característi- cas biológicas y en las alteraciones genéticas de los mismos (82). La presencia de dichas dianas predice una buena respuesta al tratamiento, por eso se las considera como biomarcadores predictivos. En mayo de 2017, el pembrolizumab (Keytruda®, Merck & Co.) se convirtió en el primer fármaco con indicación tumor-agnóstica, al recibir la aprobación de la FDA en pacientes adultos y pediátricos para tratamiento de tumores sólidos local- mente avanzados o metastásicos con deficiencia en la reparación de los errores de emparejamiento (dMMR, deficient mismatch-repair) o con alta MSI, que hubie- ran progresado tras tratamiento previo o que no presenten alternativas terapéuticas (83,84). Los tumores con estas alteraciones moleculares tienen dificultades para reparar el daño en el DNA y debido a ello se ocasionan numerosas mutaciones que llevan a la aparición de proteínas anormales. El pembrolizumab es un inhibidor de punto de control inmune (inmune checkpoint), un anticuerpo monoclonal humani- zado frente a la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1). Con la aprobación de este fármaco se inició un cambio de paradigma en la terapia oncológica centrada en fármacos dirigidos contra determinados marcado- res agnósticos (85). En Japón se aprobó el uso de pembrolizumab para tumores sólidos dMMR avanzados o recurrentes en diciembre de 2018, convirtiéndose en el primer fármaco agnóstico aprobado en este país. En junio de 2020, la FDA aprobó otro uso de pem- brolizumab para el tratamiento de pacientes infantiles y adultos con tumores sóli- dos no extirpables o metastásicos con alta TMB. En Europa, la Agencia Europea del Medicamento (EMA) aprobó este fármaco para pacientes con CCR con inesta- bilidad de microsatélites alta (MSI-H) o con deficiencia del sistema de reparación de apareamientos erróneos (dMMR). Posteriomente, la eficacia observada de dos inhibidores del receptor quinasa de la tropomiosina (TKIs) larotrectinib y entrectinib, llevó a su aprobación tam- bién como fármacos tumor-agnósticos. Ambos tienen nivel 1C en la escala ESCAT INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 54 (ESMO Scale for Clinical Actionability of molecular Targets) (86). Ver Anexo I. Por tanto, se consideran el tratamiento estándar basado en los datos obtenidos a partir de ensayos clínicos en cesta. 1.4.1. Larotrectinib (Vitrakvi®) Larotrectinib es un inhibidor oral altamente selectivo y potente del receptor de Trk, de las tres proteínas TrkA, TrkB y TrkC. Larotrectinib fue aprobado por la FDA el 26 de noviembre de 2018 (87), con- virtiéndose, así, en el segundo fármaco agnóstico aprobado por la FDA. Por su parte, la EMA aprobó condicionalmente larotrectinib el 19 de septiembre de 2019 (88), convirtiéndose en el primer tratamiento con indicación tumor agnóstica en la Unión Europea. Dado que los resultados de eficacia y seguridad son preliminares, la apro- bación condicional está supeditada a la presentación de los datos de los estudios actualmente en curso solicitados por la EMA, que permitirán completar la infor- mación sobre farmacología, farmacocinética, eficacia y toxicidad. Está indicado en monoterapia para el tratamiento de pacientes adultos y pediátricos (a partir de un mes de edad) con tumores sólidos que presentan fusión del gen NTRK, con enfer- medad localmente avanzada, metastásica o cuya resección quirúrgica implicara con alta probabilidad una elevada morbilidad, y en ausencia de otras opciones terapéu- ticas satisfactorias (87). Su efectividad y seguridad fueron confirmadas en varios ensayos clínicos de un solo brazo y de fase I o II, incluyendo ensayos en cesta, en pacientes pediátricos y adul- tos con tumores con genes de fusión NTRK, independientemente de la edad y tipo de tumor (NCT02122913, NCT02637687 «SCOUT» y NCT02576431 «NAVIGATE», de ClinicalTrials.gov) (89-91). El análisis conjunto de estos ensayos, con 159 pacien- tes, informó de una tasa de respuesta tumoral global (ORR) (tanto parcial como com- pleta) de acuerdo a RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumours) del 75% (IC 95%: 72-85%), con una respuesta completa (CR) del 16%, respuesta par- cial (PR) del 33%, enfermedad estable (SD) en el 12% y progresión (PD) en el 6%. La respuesta global en personas adultas fue del 73% y del 92% en población infan- til. La respuesta fue independiente de la histología y tipo de fusión NTRK. El tiempo mediano de seguimiento fue de 12,9 meses, la mediana de duración de la respuesta (DoR) fue de 35,2 meses (IC 95%: 22,1-no estimable [NE]), la mediana de supervi- vencia libre de progrersión (PFS) fue de 28,3 meses (IC 95%: 22,1-NE), la mediana de superviencia global (OS) fue de 44,4 meses (36,5-NE) con un porcentaje de pacien- tes vivos a los 12 meses del 88% (IC 95%: 83-94). Por otro lado, se informó de un buen perfil de seguridad, tanto en personas adultas como en edad infantil. Los eventos 55 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA adversos (EA) más frecuentes fueron astenia, tos, incremento de enzimas hepáticas y en el 93% de los casos fueron de grados 1-2. En el 8% de las personas tratadas fue necesario reducir la dosis del fármaco debido a los EA y sólo en un 2% se tuvo que suspender el tratamiento por los EA. En un análisis posterior (92) con 218 pacientes con 21 tipos diferentes de tumo- res, portadores de fusiones NTRK, la ORR fue del 75% (IC 95%: 68-81%), con CR en 22% de pacientes, PR en 53%, SD en el 16% y progresión en 6%. El tiempo medio de seguimiento fue de 22,3 meses, una mediana de DoR de 49,3 meses (IC 95%: 27,3-NE). La mediana de PFS fue de 35,4 meses (IC 95%: 23,4-55,7) con una mediana de seguimiento de 20,3 meses, y una mediana de OS a los 36 meses del 77% (IC 95%: 69-84). Entre pacientes con metástasis cerebrales, la ORR fue de 73% (IC 95%: 45-92), en 11 pacientes se observó PR, 2 presentaron SD y 2 PD. En cuanto a los EA, el 18% fueron de grados 3-4 y sólo un 2% de las personas tra- tadas necesitó interrumpir el tratamiento por los EA. 1.4.2. Entrectinib (Rozlytrek®) El entrectinib es un potente inhibidor oral de la tirosina quinasa de TrkA, TrkB, TrkC, pero también de ROS1 y ALK. La inhibición de Trk, ALK y ROS1 lleva a la inhibición de las vías de señalización descendente, incluyendo la PLC-ɣ, MAPK y PI3K/proteína quinasa B, lo que a su vez conduce a una inhibición de la proli- feración celular. Japón fue el primer país en aprobar el uso de entrectinib, en junio de 2019. Después fue aprobado por la FDA, el 15 de agosto de 2019 (93) y por la EMA, casi un año más tarde y de forma condicional, el 28 de mayo de 2020 (94), para el tratamiento de pacientes adultos y pediátricos de 12 años de edad o mayores, con tumores sólidos que expresen fusión del gen NRTK, con enfermedad localmente avanzada, metastásica o en la que es probable que la resección quirúrgica provoque una morbilidad severa (es decir, no candidatos a cirugía), que no hayan recibido previamente terapia con un inhibidor de NTRK, y sin opciones de tratamiento acep- tables. Dado que los resultados de eficacia y seguridad son preliminares, la apro- bación condicional de la EMA de entrectinib, al igual que la de larotrectinib, está supeditada a la presentación de los datos de los estudios actualmente en curso, que permitirán completar la información sobre farmacología, farmacocinética, efica- cia y toxicidad. Además de su aprobación como tumor-agnóstico, entrectinib tam- bién recibió la aprobación como tumor-específico por la FDA para personas adul- tas con NSCLC avanzado que presentaran fusiones del gen ROS1, siempre que la persona no hubiera sido previamente tratada con inhibidores ROS1. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 56 Su aprobación para pacientes adultos con tumores sólidos con fusiones NTRK se basó en los resultados de tres ensayos clínicos multicéntricos fase I/II, de un solo brazo: ALKA-372-001, STARTRK-1 y STARTRK-2 (95-97). Para pacientes pediá- tricos, su aprobación se basó en los resultados del ensayo STARTRK-NG. Estos ensayos incluían tumores sólidos con diferentes drivers oncogénicos, es decir, que no se limitan a fusiones NTRK. Tras un seguimiento de 15,5 meses, los resultados de estos estudios confirmaron respuestas de larga duración en varios tumores sólidos con fusión del gen NRTK como sarcomas, NSCLC, tumores de las glándulas sali- vales, carcinoma secretor y no secretor de mama, CCR, tumores neuroendocrinos, cáncer de tiroides, de páncreas, de ovario, carcinoma endometrial, colangiocarci- noma, tumores gastrointestinales y neuroblastoma, así como en NSCLC ROS1 posi- tivo. Un primer análisis de eficacia con un total de 54 pacientes, ofreció los siguien- tes datos agregados: una ORR del 57,4% (IC 95%: 43,2-70,8%), con una CR del 7,4% y PR del 50%; una mediana de DoR de 10,4 meses (IC 95%: 7,1-NE), tasa de beneficio clínico (porcentaje de pacientes con CR, PR o SD ≥6 meses confirmada) del 65% (IC 95%: 51-77), mediana de PFS de 11,2 meses (IC 95%: 8,0-14,9), OS de 20,9 meses (IC 95%: 14,9-NE) y tiempo hasta la progresión (TTP) en SNC de 17,0 meses (IC 95%: 14,3-NE) (95). El entrectinib atraviesa la barrera hematoen- cefálica y se ha demostrado su efectividad para tratar tumores primarios y metás- tasis del SNC, con una PFS de 7,7 meses (IC 95%: 4,7-NE). Respecto a su seguri- dad, igual que para el larotrectinib, los EA más frecuentes (83%) fueron de grados 1-2 (anemia, astenia, aumento de peso, disnea). Los de grados 3 o 4 fueron la insuficiencia cardíaca congestiva, efectos sobre el SNC (como deterioro cognitivo y mareo) y fracturas óseas. La población pediá- trica que recibió el entrectinib tenían más probabilidad que la población adulta de presentar ciertos EA, como neutropenia, fracturas óseas y aumento de peso. En 3,9% de pacientes fue necesario suspender la medicación por los EA ocasionados. Un análisis posterior con 74 pacientes (98), tras una mediana de seguimiento de 14,2 meses, la ORR fue del 63,5% (IC 95%: 51,5-74,4), con una CR del 6,8% y PR del 57%, la mediana de DoR de 12,9 meses (IC 95%: 9,3-NE), tasa de bene- ficio clínico del 68% (IC 95%: 56-78), mediana de PFS de 11,2 meses (IC 95%: 8,0-15,7), la OS mediana fue de 23,9 meses (IC 95%: 16,0-NE) y TTP en SNC de 16,8 meses (IC 95%: 14,3-NE). En 2022 se han publicado los resultados actualizados con 121 pacientes (con 14 tumores sólidos diferentes y más de 30 tipos histológicos) tratados con entrec- tinib seguidos durante al menos 12 meses (99). El seguimiento mediano fue de 25,8 meses, el 61,2% de los pacientes presentó una CR (n=19) o PR (n=55). La DoR mediana fue de 20,0 meses (IC 95%: 13,0-38,2), la PFS mediana fue de 13,8 meses (IC 95%: 10,1-19,9). La ORR de pacientes con metástasis cerebrales 57 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA fue de 63,6% (IC 95%: 30,8-89,1) y la DoR mediana para estos mismos pacientes fue de 22,1 meses (IC 95%: 7,4-NE). En cuanto a seguridad, los EA sucedidos fue- ron en su mayoría de grados 1 o 2, y la finalización del tratamiento por EA asocia- dos al tratamiento se produjo en el 8,3% de las personas tratadas. De acuerdo con sus respectivas fichas técnicas (100,101), los efectos favora- bles de larotrectinib y entrectinib se han demostrado en base a la tasa de respuesta y la duración de la respuesta en un número limitado de tipos de tumores. El efecto podría ser cuantitativamente diferente dependiendo del tipo de tumor, así como de las alteraciones genéticas concomitantes. Por estos motivos, estos medicamentos solo debieran ser utilizados en ausencia de opciones de tratamiento satisfactorias. A pesar de que se han descrito respuestas al tratamiento de larga duración, en algunos casos se ha desarrollado resistencia a estos fármacos agnósticos de primera generación, relacionados con la presencia de mutaciones en el dominio de activi- dad de la tirosina quinasa de esta fusión génica (102) entre otras posibles causas. No existen estudios en los que se haya podido analizar la efectividad de cambiar de larotrectinib a entrectinib, o al revés. Se piensa que cuando se generan resis- tencias a uno de ellos, es muy probable que también las haya al otro, por eso es importante la decisión inicial de cuál de los dos fármacos es más adecuado en cada paciente en concreto (103). La aparición de resistencia a ambos TKIs selectivos, llevó al desarrollo de una segunda generación de inhibidores NTKR, repotrectinib (Turning Point Therapeutics), taletrectinib y selitrectinib (LOXO-195, Bayer), capaces de actuar sobre estas mutaciones de resistencia (22,104-107). El repotrectinib es un inhibidor tirosina quinasa ROS1/TRK/ALK, aprobado por la FDA en 2020, que se ha estu- diado en el ensayo TRIDENT-1 multi-cohorte en fase I/II con cohortes de pacien- tes con tumores sólidos avanzados positivos a fusiones NTRK. 1.4.3. Otros fármacos Frente al larotrectinib, que es un inhibidor selectivo de Trk, los inhibidores multiquinasa (MKIs) presentan acitividad frente a un rango amplio de dianas, no sólo la Trk. El crizotinib (Xalkori®) es un inhibidor selectivo del receptor de ALK de primera generación, que fue aprobado para tratamiento de pacientes con NSCLC con reordenamientos ALK. También fue aprobado por la FDA en 2016 (108) y posteriormente por la EMA (109) para el tratamiento de NSCLC avanzado con INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 58 reordenamientos ROS1. En pacientes ROS1 positivos, independientemente de que tengan o no un PD-L1 elevado, la ESMO recomienda el uso de crizotinib como primera línea de tratamiento o como terapia de rescate en NSCLC estadio IV con reordenamientos ROS1 (110). Presenta el perfil de toxicidad más ventajoso frente a otros MKIs (111,112). Sin embargo, la mayoría de pacientes que inicialmente res- ponden al crizotinib, con el tiempo presentan progresión de la enfermedad por resis- tencia adquirida frente a este fármaco (113,114). Tanto para estos casos como en primera línea de tratamiento del NSCLC con reordenamientos ALK, están indicados los inhibidores de segunda generación que, además, atraviesan la barrera hematoen- cefálica de manera más eficiente, como el ceritinib (también inhibe ROS1), alecti- nib (también inhibe RET pero no c-MET ni ROS1), brigatinib (con actividad anti ALK, ROS1, IGF1 y EGFR) y ensartinib, o los de tercera generación como lorlati- nib (también activo frente a ROS1), repotrectinib y taletrectinib que han demostrado gran efectividad para metástasis cerebrales (28,33). Estos fármacos se administran por vía oral; y sus principales efectos secundarios son cansancio, hipertensión, rash cutáneo, diarrea, ganancia de peso, alteraciones en la analítica como aumento del colesterol o inflamación del hígado. Para tumores con alteraciones RET, también se han empleado algunos TKIs, siendo cabozantinib y vandetanib los que han demostrado mejores resultados en cuanto a tasa de respuesta, PFS y OS pero, en cualquier caso, la actividad de estos fármacos es limitada por la falta de dianas específicas que es también motivo de mayor toxicidad (41). Nuevos inhibidores RET selectivos, como selpercatinib (LOXO-292) o pralsetinib (BLU-667) han demostrado una mayor efectividad tera- péutica y menor toxicidad que las alcanzadas con los MKIs como cabozantinib y vandetanib (44,115). Selpercatinib (Retevmo®) es un inhibidor RET altamente selectivo que fue aprobado por la FDA el 8 de mayo del 2020 para las siguientes tres indicaciones (116): 1) tratamiento de pacientes adultos con NSCLC metastásico positivo a fusio- nes RET; 2) para pacientes de edad adulta y pediátrica de ≥12 años con CMT avan- zado o metastásico positivo a mutaciones RET; 3) para pacientes de edad adulta y pediátrica de ≥12 años con cáncer de tiroides positivo a fusiones RET que requie- ren tratamiento sistémico y que son refractarios a terapia con iodo radiactivo. En el ensayo pivotal multicéntrico de fase I/II LIBRETTO-001 (identificador ClinicalTrials. gov: NCT03157128) selpercatinib presentó una ORR del 68% y del 62% en los NSCLC y cáncer de tiroides positivos a fusiones RET, respectivamente, y del 56% en los carcinomas medulares de tiroides con mutaciones RET. El tiempo mediano de DoR y la PFS fueron de 20,3 meses y 18,4 meses, respectivamente, en pacientes con NSCLC con fusiones RET. También se demostró una alta tolerancia al fármaco, requiriendo su interrupción por los EA sólo un 2% de pacientes (39,44,115,117). Recientemente se han publicado los resultados del ensayo randomizado fase 3 en 59 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA pacientes con NCSLC positivos a ROS1 tratados con selpercatinib en comparación a los tratados con QT basada en platino con o sin pembrolizumab, destacando una PFS significativamente superior [24,8 meses (IC 95%: 16,9-NE) vs 11,2 meses (IC 95%: 8,8-16,8)] y una respuesta objetiva también mayor de 84% (IC 95%: 76-90) frente a 65% (IC95%: 54-75) (118). Praseltinib (Gavreto®) fue aprobado por la FDA en 2020 para el tratamiento de NSCLC metastásicos con alteraciones RET, por presentar mejores resultados clí- nicos y un perfil de toxicidad favorable en comparación a los MKIs (119,120). La EMA aprobó su uso el 27 de septiembre de 2021 para personas adultas con NSCLC positivos a fusiones RET y unos meses después, se aprobó para personas adultas y pediátricas de ≥12 años cáncer de tiroides con alteraciones RET. El ensayo clínico sobre praseltinib, ARROW (NCT03037385), mostró una ORR de 56% para carci- noma medular de tiroides con mutaciones RET y del 58% en los NSCLC positivos a reordenamientos RET; su tolerancia fue muy alta y sólo en un 4% de pacientes fue necesario interrumpir el tratamiento por EA asociados al fármaco. En torno a un 50% de pacientes con NSCLC positivos a reordenamientos RET desarrollan metástasis cerebrales para las que no resultan efectivos los tratamien- tos con MKIs, mientras que los dos inhibidores selectivos de alteraciones RET han demostrado atravesar la barrera hematoencefálica y tener efecto antitumoral sobre las metástasis intracraneales. En algunos pacientes con NSCLC positivos a alteraciones RET, se ha obser- vado falta de respuesta a los inhibidores selectivos RET, que se ha asociado a la presencia de otros oncogenes drivers como mutaciones RAS y EGFR y amplifi- caciones MET. También se ha descrito resistencia al tratamiento en pacientes que han desarrollado mutaciones RET secundarias adquiridas (121). INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 60 2. Objetivos El objetivo de este informe es revisar la literatura científica con el fin de iden- tificar las mejores evidencias sobre estrategias adecuadas para la identificación sis- temática de los biomarcadores de fusión de genes NTRK, ALK, RET y ROS1 en patología oncológica dada su capacidad predictiva de respuesta favorable a tera- pias agnósticas. Se han revisado las diferentes propuestas y recomendaciones respecto a la uti- lización de las técnicas IHC, FISH, RT-PCR y NGS en la búsqueda de dichos bio- marcadores de fusión, en función de su efectividad diagnóstica y de la capacidad predictiva de respuesta favorable a terapias agnósticas en patología oncológica. Estos biomarcadores presentan dos características especiales: por un lado, se les califica como tumor-agnósticos porque no dependen del tipo de tumor ni del tejido tumoral de origen y, por otro, para pacientes con tumores irresecables o metastási- cos se dispone de terapias aprobadas o en fase de ensayo clínico avanzado dirigi- das de forma selectiva frente a los mismos. Las técnicas diagnósticas deberían permitir el cribado de fusiones de los genes NTRK, RET, ALK y ROS1 de forma rápida y eficiente en cualquier tumor donde estén presentes y en los pacientes que requieran tratamiento oncológico. Con este informe se quiere recopilar la evidencia científica publicada res- pecto a la validez analítica, validez clínica y utilidad clínica de las técnicas y prin- cipales estrategias diagnósticas que identifiquen la presencia de estos biomarca- dores en pacientes con tumores sólidos metastásicos o con enfermedad avanzada. Además, se revisa la información disponible sobre si estos test permiten predecir una buena respuesta al tratamiento o si son predictores de algunos resultados en salud del paciente, y si el uso de estos tests puede tener consecuencias potencial- mente adversas en la toma de decisiones terapéuticas. También, en este informe se recoge la información disponible sobre la reper- cusión económica asociada a la incorporación de estos tests en la práctica clínica. Por último, se revisa la efectividad de las terapias agnósticas administradas a pacientes en los que se hayan identificado dichos biomarcadores, y se recogen las evi- dencias sobre su efectividad comparada entre esta terapia dirigida y la terapia están- dar, en términos de resultados en salud y seguridad para las personas en tratamiento. 61 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA El objetivo final del informe es recoger toda la información publicada dispo- nible que ayude a la toma de decisiones informadas sobre el uso más beneficioso de estas técnicas en la identificación de los biomarcadores agnósticos predictivos de buena respuesta a la terapia dirigida. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 62 3. Metodología Se ha realizado una revisión de revisiones de la literatura científica con el fin de sintetizar e integrar toda la evidencia disponible. Se han considerado distintos tipos de publicaciones secundarias que analizaran la validez diagnóstica de los diferentes algoritmos, propuestas diagnósticas y recomendaciones de uso de las diferentes técnicas diagnósticas empleadas para la identificación de los biomarca- dores agnósticos de genes de fusión NTRK, ALK, RET y ROS1. Estos documentos secundarios han incluido informes de evaluación de tecnologías sanitarias (ETS), documentos de consenso con recomendaciones de las principales sociedades cien- tíficas relacionadas con las materias de interés, opiniones de expertos, guías de práctica clínica, revisiones sistemáticas y meta-análisis, propuestas de algoritmos diagnósticos de grupos de profesionales asistenciales y de investigación y revisio- nes narrativas de calidad. También se ha realizado una revisión de la literatura científica sobre efecti- vidad y seguridad de la terapia dirigida frente a dichos biomarcadores de fusión, considerando estudios que realizaran comparaciones entre esta terapia dirigida y el tratamiento convencional con inhibidores multiquinasa, inmunoterapia y/o qui- mioterapia. Para ello también se han seleccionado informes de ETS, revisiones sis- temáticas y meta-análisis, guías de práctica clínica, documentos de consenso de sociedades científicas y estudios originales de efectividad comparada. Además, se han revisado estudios sobre los costes de estas pruebas diagnós- ticas y/o los tratamientos agnósticos. Para ello, se han cosiderado revisiones siste- máticas, informes de ETS y estudios originales. 3.1. Criterios de selección de estudios Para la selección de las revisiones y demás documentos secundarios inclui- dos en el presente informe se aplicaron los criterios de inclusión que se muestran en la Tabla 3. 63 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Tabla 3. Criterios de inclusión Objetivos de los estudios incluidos Analizar la validez analítica, validez diagnóstica y validez clínica de IHQ, FISH, RT-PCR y/o NGS en el estudio de genes de fusión NTRK, ALK, RET y ROS1 en pacientes con tumores en estadios avanzados que puedan ser candidatos a terapia tumor-agnóstica. Establecer o proponer algoritmos diagnósticos para la práctica clínica que identificaran los biomarcadores de genes de fusión NTRK, ALK, RET y/o ROS1, con el fin de tomar las mejores decisiones terapéuticas en pacientes oncológicos candidatos. Elaborar recomendaciones de uso de las técnicas IHQ, FISH, RT-PCR y/o NGS para un diagnóstico más efectivo de los biomarcadores agnósticos de fusión. Estudiar la efectividad terapéutica de los fármacos tumor-agnósticos y/o su comparación con los tratamientos convencionales. Diseño de estudios • Para revisar la efectividad diagnóstica de las pruebas que identifiquen a los biomarcadores de fusión de genes NTRK, ALK, RET y/o ROS1, se seleccionaron revisiones sistemáticas y meta-análisis, documentos de consenso, opiniones de personas expertas, documentos de recomendaciones, propuestas de algoritmos diagnósticos o informes de ETS. • Para la revisión de la efectividad terapéutica de los tratamientos agnósticos y su comparación con la terapia convencional se seleccionaron revisiones sistemáticas, meta-análisis, informes de ETS, guías de práctica clínica, documentos de consenso y de recomendaciones de sociedades científicas sobre la efectividad y seguridad de los fármacos tumor-agnósticos, y estudios originales de efectividad comparada entrer los fármacos agnósticos o entrer estos y el tratamiento estándar. • Para la revisión de la condición clínica y de la tecnología se consideraron revisiones narrativas, protocolos clínicos, documentos de consenso y guías de práctica clínica. • Para la revisión de datos económicos de estas pruebas diagnósticas se seleccionaron estudios de análisis de costes, de coste-efectividad, coste-utilidad o coste-beneficio, y revisiones de evaluación económica. Idiomas de publicación Inglés, español. Años de publicación Se seleccionaron documentos publicados a partir de 2015. Para estudios sobre los tratamientos agnósticos, también se estableció esta misma fecha límite de búsqueda, aunque la autorización comercial de los mismos se produjo en los años 2019 y 2020. 3.2. Criterios de exclusión • Para estudios de efectividad diagnóstica se descartaron los estudios de un caso, los originales de pruebas diagnósticas, editoriales, resúmenes de con- gresos, cartas al director y artículos de opinión. • Estudios en animales. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 64 • Artículos que en el momento de la búsqueda estuvieran todavía en pro- ceso de publicación. 3.3. Fuentes de información Se consultaron las bases de datos bibliográficas Medline (PubMed) y Embase (Ovid), la Cochrane Library (Cochrane Database of Systematic Reviews), las bases de datos DARE, NHSEED y HTA del Centre for Reviews and Dissemination (CRD) de la Universidad de York, TripDatabase, Web of Science (WOS), Scopus, la Biblioteca Virtual en Salud. Se consultaron los sitios web de asociaciones y sociedades médicas relacionadas como la ESMO, la American Society of Clinical Oncology (ASCO), Sociedad Española de Oncología Médica (SEOM) o la EMA. También se buscó información en los sitios web de las agencias de ETS, a través de la Red Española de Agencias de Evaluación de Tecnologías Sanitarias y Prestaciones del Sistema Nacional de Salud (www.redets.es) e INAHTA (Red Internacional de Agencias de Evaluación de Tecnologías Sanitarias, https://data- base.inahta.org), EUnetHTA, además de la AHRQ (Agency for Healthcare Research and Quality»s), NICE (National Institute for Health and Clinical Excellence) y la NCCN (National Comprehensive Cancer Network). También se hizo la búsqueda en repositorios de guías clínicas y guías de práctica clínica como la Guidelines International Network (https://g-i-n.net/; https://guidelines.ebmportal.com/). Por último, se revisaron los listados de referencias de los documentos selec- cionados. 3.4. Estrategias de búsqueda Para el diseño de las estrategias de búsqueda y la realización de las búsque- das en las diferentes fuentes de información se ha contado con la colaboración de una documentalista experta. Las diferentes búsquedas y resultados se muestran en el Anexo III. Se utilizó tanto el vocabulario controlado de las distintas bases de datos consultadas como términos libres, adaptados a cada fuente de información. Los términos controlados de búsqueda fueron los siguientes: Biomarkers, Tumor; Immunohistochemistry; High-Throughput Nucleotide Sequencing; In Situ Hybridization, Fluorescence / standards; Neoplasms / diagnosis*; Neoplasms / drug therapy; Neoplasms / genetics; Oncogene Proteins, Fusion; Protein Kinase Inhibitors; 65 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Receptor Protein-Tyrosine Kinases; Receptor, trkA; Receptor, trkB; Receptor, trkC; Proto-Oncogene Proteins c-ret; Anaplastic Lymphoma Kinase. Como términos libres se utilizaron los siguientes: «agnostic biomarkers», «histology-agnostic therapy», «histology-agnostic therapeutic agents», «tumor-agnostic therapy», «tumor-agnostic treatment», «tumor-agnostic biomarkers», «tissue-agnostic approach», «tumour biomarker testing algorithm», «FISH», «IHC», «RT-PCR», «reverse transcriptase polymerase chain reaction», «reverse transcriptase PCR», «NGS», «fluorescent in situ hybridization», «DNA sequencing», «RNA sequen- cing», «inmunohistochemistry», «immunocytochemistry», «immunohistocytoche- mistry», «new generation sequencing», «massively parallel sequencing», «NTRK fusion», «NTRK gene fusions», «ALK fusion», «anaplastic lymphoma kinase fusion», «RET fusion», «ROS1 fusion», «ALK rearrangement» «RET rearrange- ment», «RET-rearranged», «RET-altered cancer», «ROS rearrangement», «selective NRTK inhibitors», «selective ALK inhibitors» «selective RET inhibitors» «selective ROS1 inhibitors», «entrectinib», «larotrectinib». Se utilizaron algunos filtros de búsqueda como el diseño de los estudios (Consensus Development Conference, Consensus Development Conference, NIH, Guideline, Meta-Analysis, Practice Guideline, Randomized Controlled Trial, Review, Systematic Review, Technical Report) y el idioma (inglés y español). Tras una búsqueda inicial de aproximación, se realizaron varias búsquedas de la literatura científica en julio y noviembre de 2011, y posteriormente se actuali- zaron en julio de 2022. 3.5. Proceso de selección de estudios El proceso de selección de estudios se inició con la lectura del título y abstract de las referencias recuperadas en la búsqueda. Aquellos estudios que parecían cum- plir los criterios de inclusión y aquellos que no podían descartarse se recuperaron a texto completo y su lectura permitió decidir sobre la selección final de los estu- dios incluidos en esta revisión. En cada etapa, se aplicaron los criterios de inclu- sión y exclusión, que habían sido establecidos a priori. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 66 3.6. Extracción de datos Se han expuesto de forma narrativa los distintos documentos de revisión y demás documentos secundarios encontrados en los que se revisaba el papel diag- nóstico de las diferentes pruebas. Se han presentado ordenados por tipo de estu- dio. De cada trabajo incluido se han recogido datos relacionados con el diseño de estudio, país en el que se ha desarrollado el estudio, población incluida (adultos y/o pacientes pediátricos), alteraciones moleculares estudiadas, tipo de tumor y sus características, técnicas diagnósticas analizadas, y se han extraído los principales resultados informados, así como los diferentes algoritmos propuestos por las per- sonas autoras y las recomendaciones basadas en opiniones de personas expertas o establecidas en guías elaboradas por distintas Sociedades Científicas sobre el uso de las distintas pruebas diagnósticas en pacientes con tumores con sospecha de fusiones de genes NTRK, ALK, RET y/o ROS1. Los estudios sobre las terapias agnósticas recogidos en este informe se han ordenado según el tipo de estudio y las metodologías empleada en cada uno, y se ha realizado una revisión narrativa extrayendo los principales datos sobre la pobla- ción incluida (pacientes de edad adulta y/o pacientes pediátricos), el tipo de tumor, sus principales características, los fármacos estudiados en cada estudio y/o consi- derados en los estudios comparativos, tipos de biomarcadores analizados o iden- tificados, y resultados como respuesta tumoral (parcial, completa, objetiva), por- centaje de control de la enfermedad, tasa de recurrencia local y/o a distancia tras cada terapia, OS, PFS, mortalidad, y los resultados comparativos entre las terapias agnósticas y convencionales. También se han presentado los datos sobre seguridad de los tratamientos, EA asociados a la terapia agnóstica informados en cada estu- dio, además de otros posibles datos sobre grado de severidad, porcentaje de casos en que fue necesario reducir la dosis del fármaco, porcentaje de pacientes en los que se tuvo que suspender el tratamiento. Por último, se han presentado los estudios sobre costes, comenzando con los infomes de agencias de evaluación y a continuación, los estudios originales selec- cionadas para el presente informe. De cada trabajo se han recogido datos relativos a la metodología de estudio, país de origen, perspectiva del estudio, tipo de análi- sis y resultados de costes o coste-efectividad y/o coste-utilidad de las técnicas diag- nósticas y de la terapia tumor-agnóstica informados en las distintas publicaciones. 67 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 4. Resultados 4.1. Resultados de la búsqueda y selección de estudios La búsqueda de la literatura permitió localizar 180 referencias sobre las prue- bas diagnósticas utilizadas para identificar biomarcadores de fusión y 164 sobre tratamientos agnósticos, en Medline (a través de Ovid), y 492 y 208, respectiva- mente, a través de Embase. En la Librería Cochrane no se localizaron revisiones Cochrane relativas al diagnóstico de estos biomarcadores ni sobre los tratamientos tumor-agnósticos y todos los artículos originales o revisiones recuperados a través de esta fuente de información, ya se habían podido recuperar en las bases de datos de Medline y Embase. La segunda búsqueda de actualización, realizada en Medline (a través de Pubmed), permitió localizar 70 nuevas referencias sobre las pruebas diagnósticas y 208 sobre las terapias. En total, se recuperaron 742 referencias sobre pruebas diagnósticas para biomarcadores y 643 sobre tratamientos tumor-agnósticos. Se eliminaron 263 duplicados. La búsqueda manual a partir de los listados de refe- rencias de algunos documentos y la búsqueda en las páginas web mencionadas en el apartado de fuentes de información, permitió localizar 9 referencias más. Se han seleccionado un total de 25 estudios sobre las diferentes pruebas diag- nósticas utilizadas para identificar los biomarcadores agnósticos de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET. De ellos, sólo dos son informes de ETS (79,122), uno es una revisión sistemática (23), seis estudios (14,21,25,63,123,124) presentan propues- tas de algoritmos diagnósticos para estudiar a pacientes con tumores susceptibles de presentar dichos biomarcadores, tres documentos de consenso de sociedades científicas españolas (9,66,125), tres documentos de recomendaciones de ESMO (13,41,126), tres guías norteamericanas (37,127,128) y siete documentos de consenso o de recomendaciones de Sociedades Científicas de otros países (34,84,129-133). En relación a los estudios sobre tratamientos agnósticos para pacientes con genes de fusión, no se han encontrado ensayos clínicos controlados y randomiza- dos sobre la efectividad de los fármacos tumor-agnósticos larotrectinib y entrecti- nib en comparación al tratamiento estándar de tumores positivos a fusiones NTRK, ALK o ROS1, ni estudios que realicen comparaciones directas entre ambos fárma- cos y/o con el tratamiento estándar. Se han seleccionado nueve estudios (134-142) de efectividad comparada con diferentes metodologías entre larotrectinib y entrec- tinib o con el tratamiento estándar; una revisión sistemática (143); tres guías de evaluación de tecnologías de NICE (144-146) y un documento de consenso (84). INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 68 Para el apartado de estudios económicos se han seleccionado siete estudios de evaluación económica relacionados con las pruebas diagnósticas para detección de biomarcadores de fusión y los tratamientos tumor-agnósticos. Estos estudios son los siguientes: un informe de coste-utilidad (147, 148) del Scottish Medicine Consortium (SMC), un estudio de micro-costes incluido en el informe de ETS de NIPH (79) y cinco estudios primarios (149-153). 4.2. Estudios sobre pruebas diagnósticas para identificar a los biomarcadores agnósticos de fusión 4.2.1. Informes de ETS 4.2.1.1. Informe de ETS del Norwegian Institute of Public Health (NIPH) (79) Con fecha de 2022, se ha publicado este informe cuyo objetivo final era ayudar en la toma de decisiones en el sistema de salud noruego respecto al uso de los tests moleculares para la detección de genes NTRK de fusión en pacientes con tumores sólidos localmente avanzados o metastásicos. En este trabajo se recoge la evidencia disponible sobre la validez analítica, validez clínica y utilidad clínica de las prue- bas diagnósticas IHQ, FISH, RT-PCR y NGS para detección de genes NTRK de fusión, y se revisan las ventajas y limitaciones de cada prueba. Se trata de la primera revisión sistemática publicada de estudios originales con resultados comparativos de efectividad diagnóstica entre dichas técnicas. En esta revisión se seleccionaron 9 artículos originales (con 6 comparaciones), publicados entre 2018 y 2021, además de 5 revisiones narrativas y 2 documentos de opinión de expertos sobre las venta- jas y limitaciones de cada prueba diagnóstica. Las personas autoras realizaron un resumen narrativo de resultados y descartaron realizar meta-análisis por la hetero- geneidad encontrada entre los estudios. Se demuestra heterogeneidad clínica, pero también entre los tests comparados y tests de referencia utilizados, en las variables de resultado y en la interpretación de las pruebas diagnósticas. De los estudios originales, cuatro estudios comparaban IHQ y FISH; uno comparaba IHQ con RT-PCR; en 6 estudios, IHQ con NGS-RNA; en 2, IHQ con NGS-DNA y en 1, NGS basada en DNA y en RNA. Además, un estudio comparaba resultados positivos de IHQ/FISH con NGS-DNA o NGS-RNA. En la Tabla 4 se muestran estos estudios. 69 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Tabla 4. Estudios incluidos en el Informe de NIPH Tests comparados N.º de estudios Tumores Resultados IHC vs FISH 4 CCR, CPT. En dos estudios, Se: 38,5-41,7% y Sp: 99,4-100%. En otro estudio, AUROC: 0,926 (0,864-0,987; p=0,001). IHQ vs RT-PCR 1 Carcinoma secretor de glándulas salivares. Concordancia casi perfecta entre ambos tests (0,938; IC95%: 0,818-1; SE: 0,061). Se: 90,9% y Sp: 100%. IHQ vs NGS-RNA 6 Varios tipos de tumores. Se: 80% en cáncer de mama a 100% en resto de tumores. Sp: 20,8% en gliomas a 100% en los demás tumores. En uno de los artículos, la concordancia entre las pruebas fue del 16,6%. IHQ vs NGS-DNA 2 Mesenquimales pediátricos. Un estudio informó de Se del 97% y Sp del 98% para pan-Trk IHQ, y Se del 100% y Sp del 63% para TrkA IHQ. NGS-DNA o NGS-RNA 1 13 tipos de tumores. Se de 96,8% para fusiones NTRK1, 0% para fusiones NTRK2 y 76,9% para fusiones NTRK3 de NGS-DNA en comparación a NGS-RNA. Se global de 81,1% y Sp de 99,86%. IHQ/FISH + vs NGS-DNA o NGS-RNA 1 17% de muestras positivas con IHQ y/o FISH fueron también positivas en NGS-DNA. 72% de muestras positivas con IHQ y/o FISH fueron también positivas en NGS-RNA. AUROC: área bajo la curva ROC, CCR: carcinoma colorrectal, CPT: carcinoma papilar de tiroides,FISH: hibridación in situ por fluorescencia, IHQ: inmunohistoquímica, NGS-DNA: secuenciación basada en DNA, NGS-RNA: secuenciación basada en RNA, RT-PCR: transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa, Se: sensibilidad, SE: error estándar, Sp: especificidad. Las personas autoras evaluaron la calidad de los artículos incluidos apli- cando la herramienta EGAPP (Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention) (154). Sólo uno de los nueve era de nivel 2 (estudios de casos y controles bien diseñados) mientras que los demás se consideraron de nivel 3 (estu- dios de casos y controles o transversales de baja calidad). Sobre la validez clínica, la evidencia aportada por 8 estudios fue juzgada como inadecuada y la de 1 artí- culo como cerca de adecuada. Ninguno de los estudios fue juzgado como de evi- dencia convincente. Además, las personas autoras utilizaron el checklist STARD y también se informó de un pobre resultado global. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 70 En resumen, los resultados presentan una gran variabilidad, con una Se de pan-Trk IHQ de 40-100% y una Sp de 20-100%. Se encuentra una consistencia muy variable entre estudios, entre los casos positivos de IHQ y NGS-RNA (rango de 0% a 60%) y una consistencia entre los casos positivos de FISH y NGS-RNA mayor que entre FISH y NGS-DNA. Entre las posibles causas de esta variabilidad, las personas autoras mencionan la diferente prevalencia de las fusiones NTRK entre los tumores sólidos incluidos, los distintos estadios del tumor en cada paciente, la forma de tratar y analizar las muestras, los diferentes puntos de corte utilizados para la interpretación de las pruebas, la falta de cegamiento en la valoración de resultados y los diferentes periodos de tiempo entre la realización de una prueba y test de referencia. Las personas autoras señalan la ausencia de revisiones sistemáticas y de meta-análisis, así como la falta de estudios sobre utilidad clínica con resultados de interés para el paciente como la OS o la calidad de vida, y de estudios sobre la capa- cidad de los tests para predecir una buena respuesta a los tratamientos. Se constata que la Se de la NGS-RNA es superior a la de NGS-DNA, especialmente para fusio- nes que impliquen regiones intrónicas amplias (NTRK2 y NTRK3). 4.2.1.1. Informe de ETS del Norwegian Institute of Public Health (NIPH) (122) Un año antes, en 2021, el mismo Instituto noruego había publicado un informe de ETS sobre los tests utilizados para detección de alteraciones en el gen ROS1 en pacientes con NSCLC localmente avanzado o metastásico. Se acepta que en torno al 1-2% de los pacientes con NSCLC presenta alteraciones en ROS1 y la impor- tancia de su identificación para seleccionar a las personas que podrían beneficiarse del tratamiento así como identificar aquellos otros pacientes sin dichas alteracio- nes ROS1 y así evitarles un tratamiento no efectivo al tiempo que ahorrar en costes. En este informe se incluyeron una revisión sistemática, 6 revisiones narrativas, una encuesta en hospitales noruegos y 2 revisiones sobre preferencias de pacien- tes en relación a los tests moleculares. Además, se contactó con personas expertas para recabar información sobre costes. Este informe presenta los siguientes resultados: la evidencia sobre la Se y Sp de los tests para detectar alteraciones ROS1 en pacientes con NSCLC es escasa, incompleta y de baja calidad; la opción de menor coste para estudiar reordenamien- tos ROS1 sería realizar el screening con IHQ y a continuación confirmar los resul- tados positivos mediante FISH u otros métodos por la posibilidad de FP en IHQ; 71 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA no es aconsejable ni factible realizar el estudio de un único gen en pacientes con NSCLC, por ello, la NGS con paneles dirigidos podría ser la prueba recomendada por su capacidad para estudiar múltiples genes de forma simultánea, que, además, ayuda a reducir o evitar la repetición de biopsias. Finalmente, en este informe se dice que el uso de NGS podría suponer una reducción significativa de costes aun- que, hasta el momento, los costes de la inversión inicial, de infraestructura y man- tenimiento son superiores a los de otros métodos diagnósticos. 4.2.2. Revisiones sistemáticas y meta-análisis Se ha localizado una revisión sistemática (23) relacionada con el diagnós- tico de genes de fusión NTRK. Se trata de una revisión exhaustiva de la literatura científica publicada hasta agosto de 2018 cuyo objetivo era estudiar la prevalen- cia, diagnóstico y tratamiento de tumores malignos con genes NTRK de fusión en población pediátrica. Se revisaron a texto completo 102 artículos (71 sobre preva- lencia de las NTRK fusiones en tumores pediátricos, 14 sobre métodos diagnósticos para fusiones NTRK y 17 sobre el tratamiento de tumores positivos a esta altera- ción genética). Tras el análisis de resultados de estos estudios, se descartó la posi- bilidad de realizar meta-análisis por la imposibilidad de obtener suficientes datos. Las personas autoras señalan la gran importancia de identificar posibles fusio- nes NTRK para establecer un manejo terapéutico adecuado. La revisión de la lite- ratura muestra que la pan-Trk IHQ ofrecía una alta Se y Sp para identificar estas fusiones NTRK, con cifras que oscilaban entre 95-97% y 98-100%, respectivamente, aunque se reconocen las limitaciones de esta tecnología para el estudio de tumores cerebrales o neuroblastomas en los que las proteínas Trk se expresan de forma fisio- lógica. En tumores con fusiones ETV6-NTRK3, el método estándar más utilizado era FISH con las sondas ETV6. En población infantil con fibrosarcomas o nefro- mas mesoblásticos congénitos, la presencia de señales FISH con sondas break-apart de ETV6 se considera confirmatorio de fusiones NTRK. Los valores de Se y Sp de FISH para reordenamientos NTRK oscilan entre 80% y 100%, respectivamente. Esta revisión permite comprobar que la RT-PCR no se utiliza de manera rutina- ria en la mayoría de los laboratorios por su baja Se para fusiones NTRK, a pesar de las mejoras en la tecnología RNA. En cuanto a la NGS, se informa de una alta Sp y una Se variable, y se evidencian las ventajas de esta prueba, como la posibilidad de utilizar paneles de secuenciación de múltiples genes y su capacidad para iden- tificar nuevas fusiones NTRK. A la vista de los resultados encontrados, las personas autoras proponen que en tumores con alta prevalencia (>75%) de fusiones NTRK se utilicen IHQ, FISH INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 72 o RT-PCR y si el resultado fuera negativo, se debe realizar una NGS. Para tumo- res de baja prevalencia (10-40%) de fusiones NTRK, como melanomas spitzoides y CPT metastásico, la propuesta más interesante podría ser realizar IHQ o NGS, mientras que en los gliomas de alto grado la recomendación es realizar directamente NGS puesto que la IHQ no es válida porque estos tumores pueden expresar Trk de forma fisiológica. Para tumores con muy baja prevalencia (<5%) o de frecuen- cia desconocida de fusiones NTRK, se considera más apropiado realizar NGS pues esta técnica permite identificar un amplio rango de alteraciones genéticas incluso en muestras tisulares pequeñas. En general, las personas autoras aconsejan utilizar la IHQ para screening de fusiones NTRK en los laboratorios con experiencia en esta técnica, dado que su Se es superior a la de otras pruebas como FISH y RT-PCR, por su coste ventajoso frente a las técnicas moleculares, su TAT y su uso sencillo. La FISH podría utili- zarse en aquellos tumores con alta prevalencia de fusiones NTRK, aunque con una Se menor que la IHQ, y dada la variabilidad de pares de fusión descritos para esta alteración, los que presentaran resultados negativos con FISH deberían ser estu- diados con NGS. Finalmente, señalan que en población pediátrica con recaídas de tumores sólidos o si estos son refractarios al tratamiento, se debe realizar screening de fusiones NTRK, bien con IHQ o NGS, como parte de un estudio más amplio de perfil molecular que permita identificar diferentes drivers oncogénicos. 4.2.3. Propuestas de algoritmos diagnósticos para identificar los biomarcadores de fusión A continuación, ordenados por fecha de publicación desde los más recientes, se presentan los seis artículos en los que, a partir de revisiones de la literatura o de la opinión de expertos, se han propuesto algoritmos diagnósticos para identifi- car los genes de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET. Además de los algoritmos, se recogen las principales reflexiones o conclusiones recogidas en estos documentos. Marchetti y cols (123) han publicado, recientemente, una revisión sobre las pruebas diagnósticas para identificar fusiones NTRK en pacientes con tumores sóli- dos. Las personas autoras reflexionan sobre la buena respuesta observada al tra- tamiento con TKIs y por ello consideran crucial definir estrategias óptimas para identificar las fusiones NTRK y en función de los resultados que se obtengan, ins- taurar el tratamiento más adecuado. Señalan la importancia de evaluar la eficien- cia y los costes de cada una de las técnicas diagnósticas puesto que la prevalencia de estas alteraciones moleculares es baja. En este sentido, señalan que la pan-Trk 73 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA IHQ resulta eficiente, fiable y rápida como prueba de screening en la práctica clí- nica habitual. En los casos en que se detectara expresión de Trk, la recomendación es realizar NGS con paneles de múltiples genes. La tinción IHQ citoplasmática difusa orientaría a sospechar reordenamientos NTRK1 mientras que una débil tin- ción citoplasmática junto con tinción focal nuclear sería más sospechosa de reor- denamientos NTRK3. En cuanto a la NGS, los autores consideran que la basada en RNA se podría considerar el gold standard, siempre que se garantice la calidad del RNA en las muestras, e incluso consideran preferible la opción combinada de realizar NGS tanto de DNA como de RNA. Partiendo de estas premisas, las per- sonas autoras proponen un algoritmo (Figura 1) en el que se dividen los tumores en dos grupos en función de la prevalencia de las fusiones NTRK, cada uno con un abordaje diferente. Figura 1. Algoritmo diagnóstico propuesto por Marchetti y cols Para tumores con alta prevalencia de fusiones NTRK (>50%) como fibrosar- coma infantil, carcinoma secretor de mama y de glándulas salivares y nefroma congénito mesoblástico, según este algoritmo, los pacientes debían ser sometidos de forma rutinaria al screening de fusiones NTRK, bien realizando FISH con son- das break-apart y/o NGS. Si se realiza FISH y el resultado es negativo, se debería continuar el estudio realizando NGS antes de descartar definitivamente que existan dichas fusiones. Si se trata de tumores con una prevalencia baja o muy baja (<5%) de fusiones NTRK, como NSCLC, melanoma, CCR o cáncer de tiroides, hay cen- tros hospitalarios en los que estos casos son analizados de manera habitual con el objetivo de identificar alteraciones genéticas específicas susceptibles de terapia INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 74 dirigida utilizando NGS con amplios paneles de genes, que incluyan los NTRK. Si por el contrario, no se realiza NGS de forma rutinaria con paneles multigenes, por ejemplo, en tumores de páncreas, entonces la prueba recomendada es la pan-Trk IHQ. En ambos casos, si el resultado con FISH o con NGS es positivo, estaría indi- cado iniciar el tratamiento con inhibidores Trk. Las personas autoras consideran que los tests para identificar las dianas de los tratamientos tumor-agnósticos, incluyendo los genes de fusión NTRK, deberían apli- carse a todos los tumores sólidos en fases tempranas del diagnóstico de modo que sea posible identificar a pacientes que se van a beneficiar del tratamiento dirigido. Sin embargo, reconocen que realizar tests a la totalidad de las personas afectadas supondría un coste inasumible en la práctica clínica hoy día. Por ello, las personas autoras presentan un método de aplicación de la pan-Trk IHQ utilizando microarrays (TMA, tissue micro arrays). Esta propuesta diagnóstica (Figura 2) ya había sido implementada por las personas autoras para favorecer la implantación de un scree- ning rutinario en la práctica clínica de biomarcadores raros (12). Figura 2. Algoritmo para screening utilizando TMA. Algoritmo propuesto para screening de biomarcadores raros y para seleccionar a los pacientes candidatos a tratamientos tumor-agnósticos. TMA: tissue micro arrays Con la aplicación de esta nueva propuesta diagnóstica, fue posible identificar una serie de dianas moleculares raras, incluyendo fusiones NTRK, para seleccionar 75 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA pacientes para recibir tratamientos agnósticos. Esta técnica de microarrays permite analizar muchas muestras de manera simultánea con una reducción considerable de costes y del tiempo invertido en el screening. Los casos que presentaran un resul- tado positivo tendrían que confirmarse mediante NGS o FISH. Las personas auto- ras informan de que a partir de los resultados del estudio piloto, la Italian Society of Pathological Anatomy and Cytodiagnostics (SIAPeC) está llevando a cabo un proyecto multicéntrico aplicando dicha propuesta de trabajo, en unas 10.000 per- sonas, especialmente centrado en pacientes jóvenes (de menos de 50 años), con el fin de identificar alteraciones moleculares raras y seleccionar a las personas candi- datas a tratamientos tumor-agnósticos. También en este año 2022, se ha publicado un documento (25) basado en la opinión de personas expertas, sobre el diagnóstico molecular de reordenamientos ALK y ROS1 en pacientes con NSCLC. En este artículo se resumen las principales características de cada técnica diagnóstica en la identificación de alteraciones ALK y ROS1. Se reconoce que la NGS es la alternativa más fiable frente a las técnicas convencionales, pero que son la IHQ y FISH las pruebas más implementadas en los laboratorios. La IHQ se presenta como la técnica indicada para screening mientras que se propone FISH para confirmar los resultados positivos o equívocos de IHQ. Aunque FISH es considerada la prueba más sensible para estudiar estas dos alte- raciones genéticas, las personas autoras señalan la importancia de seguir las indi- caciones de las guías más actuales para una correcta interpretación de sus resul- tados. En cuanto a otras técnicas, la opinión de las personas expertas era que ni la RT-PCR ni la biopsia líquida estaban todavía lo suficientemente extendidas en la práctica clínica, pero se reconocía el impacto significativo que el uso de la biop- sia líquida tiene en pacientes con cáncer de pulmón en estadios avanzados, tanto para identificar drivers oncogénicos como para detectar mutaciones relacionadas con la resistencia a la terapia dirigida y para valorar la respuesta al tratamiento. En concreto, para fusiones ALK las personas autoras recomiendan tanto IHQ como FISH; para screening de ROS1 recomiendan IHQ y confirmar los casos positivos con otras técnicas citogenéticas o moleculares; y en casos dudosos o equívocos, aconsejan verificar con otra técnica alternativa. Destacan el papel fundamental que patólogos y técnicos de laboratorio tienen en la coordinación y manejo de las mues- tras tisulares, así como la importancia de seguir controles de calidad en el labora- torio, todo ello clave para un diagnóstico correcto de los biomarcadores. También señalan la necesidad de que profesionales patológos y biólogos trabajen en estre- cha relación para que las muestras a evaluar se puedan seleccionar de la forma más correcta posible. En relación a los biomarcadores que deberían estudiarse en pacientes con NSCLC, la recomendación de las personas autoras es incluir muta- ciones EGFR y reordenamientos ALK, ambas altamente recomendadas, pero ade- más, también reordenamientos ROS1 y mutaciones BRAF. Para otros genes como RET, MET, HER2 o KRAS, los autores no recomiendan su estudio de forma aislada INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 76 pero sí dentro de amplios paneles de genes, bien al principio o si los resultados para EGFR/ALK/ROS1/BRAF son negativos. En cuanto al momento de estudiar estos genes, se puede optar por realizarlo en el diagnóstico inicial o bien en pacientes con estadios avanzados (IIIB y IV) o si la enfermedad progresa. Finalmente, y tras la revisión de las guías más actualizadas para la determinación de biomarcadores en pacientes con NSCLC, los autores respaldan las recomendaciones de la guía de College of American Pathologists (CAP), el International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC), y la Association for Molecular Pathology (AMP), que se presentan más adelante en este informe. Lim y cols (124) han publicado este año 2022, las recomendaciones alcan- zadas por un panel de personas expertas multidisciplinares, formado por pro- fesionales en oncología y patología de los sectores sanitarios público y privado de Singapur, para proponer unos algoritmos diagnósticos para personas adultas con CCR, NSCLC y sarcomas y para tumores pediátricos, con el fin de desarro- llar estrategias de estudiar fusiones NTRK y con ello optimizar el uso de las mues- tras tisulares y los recursos económicos y minimizar el tiempo de respuesta hasta obtener el resultado. Las personas autoras indican que los siguientes elementos se deben conside- rar a la hora de realizar tests para determinar si en el tumor se dan fusiones NTRK: la prevalencia de dichas fusiones según el tipo de tumor, la disponibilidad de los tests, las limitaciones económicas en el contexto concreto donde se vayan a utili- zar y el tiempo de respuesta. En NSCLC, se recomienda NGS para fusiones NTRK junto al estudio de otros drivers oncogénicos (EGFR, ALK, ROS1, MET, BRAF y PD-L1) pues consideran que así es posible optimizar la muestra de tejido para estudio de todos estos dri- vers. Se podría optar por IHQ como screening y NGS como prueba confirmatoria. En caso de que la enfermedad progrese, también se aconseja volver a realizar test para fusiones NTRK. Ver figura 8 en Anexo IV. En pacientes con CCR, se propone realizar NGS con paneles que incluyan fusiones NTRK, bien en el momento del diagnóstico o si se produce progresión tras la primera línea terapéutica. También recomiendan NGS cuando el CCR pre- senta alta MSI porque en estos casos, la probabilidad de fusiones NTRK es mayor, y especialmente si no se han detectado otras alteraciones genéticas como mutacio- nes KRAS, NRAS o BRAF. Ver figura 9 en Anexo IV. Para personas adultas con sarcomas, la identificación de pacientes con fusiones NTRK resulta de gran interés dados los malos resultados que ofrecen los tratamien- tos convencionales. Los TKIs podrían ser, incluso, la primera opción terapéutica. 77 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Por esto, las personas autoras proponen un algoritmo (ver figura 10 de Anexo IV) donde para aquellos sarcomas con mayor probabilidad de presentar fusiones NTRK, se recomienda screening con pan-Trk IHQ, seguida de NGS para confirmar los casos positivos. En caso de IHQ positiva, el tratamiento con TKIs puede iniciarse al tiempo que se realiza la NGS, dependiendo de si clínicamente es urgente comen- zar un tratamiento y no hay otras alternativas. Si la IHQ es negativa, también se recomienda NGS para excluir los FN. En sarcomas con baja prevalencia de fusio- nes NTRK, se recomienda screening con IHQ. Si ésta da un resultado positivo, es importante tener en cuenta los FP, y si el resultado es negativo, no será necesario realizar ninguna prueba más confirmatoria. En tumores pediátricos, las personas autoras señalan la utilidad de los TKIs en sarcomas y gliomas, donde los resultados con los tratamientos convencionales son muy pobres. Proponen el uso de NGS cuando no se dispone de suficiente muestra tisular para realizar otros tests. Si la NGS no se realiza de rutina, cualquiera de las otras tres pruebas podría ser utilizada y posteriormente confirmar los resultados positivos con NGS. Las personas autoras proponen un algoritmo (ver figura 11 de Anexo IV) aunque reconocen que dada la heterogeneidad en los tipos de tumores y en el manejo que se sigue con cada uno de ellos, el algoritmo no sería aplicable de la misma manera a todos los tumores ni pacientes. Zito-Marino y cols (14) realizaron una revisión para valorar el manejo óptimo de los biomateriales y las diferentes pruebas disponibles en la detección de reorde- namientos NTRK. En relación al tipo de muestras, las personas autoras consideran que la experiencia en los tests para estudiar fusiones NTRK es limitada y se basa en tejido FFPE. Para biospias pequeñas, recomiendan realizar múltiples secciones que permitan realizar tests diagnósticos y predictivos, al tiempo que minimizar los paneles IHQ con el fin de limitar el consumo de bloques de parafina. En rela- ción a muestras citológicas, se recuerda que es posible que sean las únicas mues- tras disponibles cuando se realiza citología por aspiración con aguja fina para el diagnóstico del tumor. Los autores consideran que podría ser fundamental realizar bloques celulares a partir de material citológico FFPE para estudiar los NTRK. La ventaja de utilizar estos bloques celulares frente a los frotis convencionales viene dada por la posibilidad de obtener más secciones. Aconsejan una evaluación cuida- dosa del material disponible (secciones de bloques celulares o frotis directos) por parte del patólogo y valorar su adecuación al test diagnóstico que se vaya a reali- zar. Finalmente, destacan la necesidad de llevar a cabo estudios de grandes series con los que poder generar información definitoria. Las personas autoras recurrieron a la opinión de expertos multidisciplina- res en lo referido al tratamiento de los tumores asociados a fusiones NTRK, desta- cando el impacto del entrectibnib y larotrectinib. Además, señalan la relevancia de INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 78 identificar a pacientes con tumores positivos a genes de fusión dado el beneficio clínico observado tras el tratamiento con TKIs. Por ello, proponen un algoritmo de diagnóstico diferencial basado en las características histológicas, la frecuen- cia relativa las fusiones NTRK y las diferentes técnicas disponibles. Las personas autoras sugieren estratificar según el diagnóstico histopatológico y la frecuencia de fusiones NTRK de los diferentes tumores y lo representan de forma gráfica, como se muestra en la Figura 3. Figura 3. Protocolo propuesto por Zito Marino y cols La NGS sería el método ideal para detectar fusiones NTRK, especialmente en pacientes con enfermedad avanzada y escasa cantidad de material para estudio. Recomiendan NGS en gliomas de alto grado, especialmente en población pediá- trica, puesto que la IHC no se ha validado para este tipo de tumores porque puede mostrar expresión de Trk de forma fisiológica. Por otro lado, estas personas autoras señalan que el análisis conjunto de RNA y DNA permitiría evitar errores diagnósticos de fusiones NTRK. Sin embargo, reco- nocen el coste elevado de la NGS como gran desventaja de esta técnica, además de que dicho coste no es predecible pues pueden influir numerosas variables como la preparación de librerías, la estrategia seleccionada (bien sea PCR o captura), los secuenciadores utilizados, el análisis bioinformático y la validación biológica. Por este motivo, proponen la NGS en caso de que las otras técnicas resulten negativas con el fin de identificar posibles FN. 79 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA En casos de fibrosarcoma infantil y nefroma mesoblástico congénito, en los que las fusiones ETV6-NTRK3 se dan con elevada frecuencia, se recomienda utili- zar FISH o RT-PCR (por su facilidad de uso y coste bajo) y sólo en los casos nega- tivos, se realizaría NGS de confirmación. Para los demás tumores donde esta fusión ETV6-NTRK3 no es frecuente, las personas autoras señalan que la pan-TRK IHC podría ser el método de screening de elección puesto que en un solo ensayo es posible detectar todas las fusiones Trk indiscriminadamente; después, aquellos casos IHC-positivos, se podrían con- firmar con FISH o RT-PCR mientras que en aquellos IHC-negativos se utilizaría NGS como técnica confirmatoria. Por último, en este documento se reconoce estar a la espera de los resultados de los estudios que todavía están en marcha, para definir qué pacientes pueden ser candidatos a este diagnóstico, aunque se menciona el caso de la guía NCCN sobre NSCLC en la que ya se ha incluido la recomendación de estudiar genes NTRK de fusión en pacientes con metástasis (127,155). En la revisión realizada por Wong y cols (63), se recomienda utilizar, al menos, dos tipos de pruebas con el fin de alcanzar un diagnóstico fiable, debido a la gran variabilidad que existe en los pares de fusión en el caso de fusiones NTRK y las limitaciones de los tests disponibles para su estudio. Se constata que el método empleado con más frecuencia es la NGS basada en RNA, seguida de FISH con son- das break-apart o de IHQ para confirmar los resultados. Algunos ensayos inclui- dos en esta revisión realizaban screening con IHQ con anticuerpos frente a diver- sas tirosina quinasas para detectar la sobreexpresión de TrkA, TrkB, TrkC, ROS1 y ALK, seguido de NGS basada en RNA. Esta opción de test en dos pasos se pre- senta como un método rápido y coste-efectivo para el screening de los casos nega- tivos a fusiones NTRK. Una desventaja descrita por las personas autoras es que una fuerte tinción en el estudio IHQ puede indicar, también, sobreexpresión de proteínas Trk nativas siendo necesario en estos casos realizar la validación mediante NGS. Además consideran que los buenos resultados de los tratamientos agnósticos justi- ficarían el estudio de fusiones NTRK, aunque reconocen que para gran parte de los laboratorios, la incorporación del diagnóstico de fusiones NTRK de rutina conti- núa siendo un reto. Para tumores con alta prevalencia de fusiones NTRK oncogéni- cas, señalan que el uso de plataformas NGS ha demostrado ser más coste-efectiva que los métodos tradicionales de IHC, FISH y RT-PCR, y que plataformas como Illumina Trusight y MSK-IMPACT también han demostrado su efectividad para detectar fusiones ROS1, ALK y RET. Por ello, en este documento se respalda el uso de NGS como test diagnóstico preferente de rutina frente a los otros métodos. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 80 Las personas autoras también mencionan las principales desventajas de cada técnica. Así, de la IHQ señalan la eficacia de los anticuerpos, que no siempre con- duce a detectar la presencia de fusiones. Sobre FISH, destacan que su interpreta- ción puede ser subjetiva y que es necesario un test para cada gen. De la NGS resal- tan la necesidad de experiencia en bioinformática, la variabilidad en el acceso a la prueba y el elevado coste. En resumen, concluyen que la IHQ es una técnica útil para screening con la que identificar tumores con fusiones, tras la cual se deben emplear NGS u «otras técnicas robustas» para confirmar el resultado. Solomon y cols (21) realizaron una exhaustiva revisión sobre cómo identi- ficar pacientes oncológicos con fusiones NTRK. Señalan la importancia de tener en cuenta tanto consideraciones económicas como de factibilidad de las pruebas en la elaboración de guías y algoritmos diagnósticos para identificar estas fusiones NTRK. Para realizar el screening de estos biomarcadores, indican que es funda- mental no sólo tener en cuenta el tipo de tumor y la probabilidad pre-test de dichas fusiones, sino también la disponibilidad de metodologías validadas clínicamente y sus valores predictivos positivos y negativos. Proponen el algoritmo para diagnós- tico de fusiones NTRK que se muestra en la Figura 4. Figura 4. Algoritmo diagnóstico propuesto por Solomon y cols 81 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Este algoritmo se inicia realizando un primer triaje basado en la histología del tumor, para diferenciar entre tumores raros con alta probabilidad de presentar fusiones NTRK y tumores más frecuentes con baja probabilidad de fusiones NTRK. Para los tumores con alta probabilidad de fusiones NTRK, se propone estudiar los carcinomas mediante pan-Trk IHQ como screening inicial seguido de FISH o NGS-RNA si el resultado de la IHQ era negativo. En cambio, para los sarcomas, se descarta realizar IHQ por su baja Sp en estos tumores y la propuesta es realizar FISH o NGS-RNA, incluso se recomienda realizar NGS como primer test usando amplios paneles de genes. En caso de tumores con baja probabilidad (<1%) de fusiones NTRK, para los sarcomas consideran que se deben utilizar paneles basa- dos en RNA y para el resto (gliomas, carcinomas y melanomas) proponen un triaje basado en el estudio genómico mediante NGS basada en DNA con amplios pane- les de genes que incluyeran NTRK. Los autores señalan que la presencia de otras alteraciones permite descartar las fusiones NTRK pues suelen ser excluyentes entre sí, de modo que se reduciría el número de casos en los que buscar fusiones NTRK. Cuando el resultado del panel de genes de NGS-DNA es negativo, si se trata de pacientes con cáncer de pulmón con baja TMB o de pacientes con CCR con alta MSI, el screening de fusiones NTRK mediante IHQ o NGS-RNA se considera una prioridad. También se recomienda utilizar IHQ o NGS-RNA para el resto de tumo- res cuando los paneles de genes NGS-DNA no muestran fusiones NTRK. Otra posibilidad que refieren las personas autoras para aquellos con baja pre- valencia sería realizar un screening de rutina a pacientes con NGS, que incluya la evaluación de fusiones NTRK, o bien con IHQ. Sin embargo, en opinión de las per- sonas autoras, buscar una alteración tan poco frecuente como las fusiones NTRK no es eficiente. El algoritmo diagnóstico propuesto por Penault-Llorca y cols (49) parte de la categorización de los tumores en dos grupos en función de la incidencia de las fusiones NTRK. Ver Figura 5. En aquellos tumores con alta prevalencia, se recomienda realizar FISH. En los casos que FISH ofrezca un resultado positivo a fusiones NTRK, se deben valorar las opciones terapéuticas. En entornos sin posi- bilidad de acceder a FISH, las personas autoras recomiendan la IHQ con anticuer- pos antipan-Trk. Si el resultado de la IHQ es positivo, se debe realizar NGS. Los casos negativos con FISH o pan-Trk deben confirmarse con NGS utilizando pane- les amplios de genes tanto aquellos que incluyan las alteraciones en NTRK como otras alteraciones no-NTRK. En los tumores sólidos con baja prevalencia de fusiones NTRK (entre 5-25%) se recomienda el uso de paneles NGS que incluyan los tres genes NTRK y si se trata de tumores con muy baja prevalencia (<5%) de fusiones NTRK, la recomendación es utilizar estos paneles de rutina. Si esta tecnología NGS no estuviera disponible INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 82 o si no se realiza en la práctica habitual, entonces se aconseja utilizar IHQ pan-Trk para screening. Si esta técnica da un resultado negativo, ya no estaría indicado rea- lizar más pruebas, mientras que si el resultado de la IHQ es positivo, se debe con- firmar con NGS. Las personas autoras recuerdan que no es suficiente con realizar IHQ puesto que esta prueba detecta tanto las proteínas nativas como las quiméricas de fusión, por lo que se ocasionarían FP y que la IHQ puede detectar una sobreex- presión de proteínas Trk que sean consecuencia de otras alteraciones genéticas en NTRK como amplificaciones, que pueden no ser drivers oncogénicos. En ambos escenarios, de tumores con alta o baja prevalencia, si la NGS iden- tifica fusiones NTRK se debe considerar administrar los fármacos inhibidores de Trk, mientras que si la NGS es negativa, la propuesta es no realizar más pruebas diagnósticas. En todos los casos en los que esté recomendada la NGS y en concreto si se sospecha la presencia de reordenamientos NTRK3, es la NGS-RNA la técnica recomendada frente a la basada en DNA. En resumen, los elementos que determinan las decisiones en este algoritmo son la etiología tumoral y la disponibilidad de los métodos diagnósticos. Figura 5. Algoritmo propuesto por Penault y cols 83 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 4.2.4. Documentos de consenso de sociedades científicas españolas En este apartado, presentamos tres documentos de consenso elaborados por diferentes sociedades científicas españolas relacionadas con la tecnología y la pato- logía de interés referentes al diagnóstico de biomarcadores agnósticos de fusión. 4.2.4.1. Documento de consenso sobre identificación de fusiones NTRK, de SEOM, SEAP y SEHOP Las sociedades científicas SEOM, SEAP (Sociedad Española de Anatomía Patológica) y SEHOP (Sociedad Española de Hematología y Oncología Pediátrica) constituyeron un grupo multidisciplinar de profesionales expertos para elaborar un documento de consenso, en el que se abordaron aspectos diagnósticos, clínicos y terapéuticos de pacientes oncológicos adultos y pediátricos con tumores que alber- gaban fusiones NTRK (9,156). El principal objetivo de este estudio fue optimizar la determinación de alteraciones NTRK en algunos tumores malignos sólidos. En este documento se recogen los principales desafíos que la detección de estas alte- raciones genéticas en la práctica clínica rutinaria puede implicar para en un sistema de salud mayoritariamente público como el español. Por un lado, Rojo y cols (9,156) resaltan la importancia de asegurar que la muestra sea adecuada, de suficiente cantidad y calidad con la que poder estudiar los biomarcadores, siendo fundamentales el porcentaje de tumor y la cantidad de células tumorales presentes en la muestra. Además, señalan la necesidad de esta- blecer unos «circuitos automatizados» para dar una solución cuando «el resul- tado de las técnicas sea fallido o incompleto». Con el fin de minimizar el riesgo de resultados nulos o equívocos, se resalta la importancia de mantener los siguientes requisitos preanalíticos y de priorización de las muestras ya propuestos por otros autores (50,66,157): adecuado tiempo de isquemia fría (desde que se extrae la muestra hasta su fijación temprana); correcta conservación en una solución de for- mol tamponada al 10% durante 6-12 horas para muestras de biopsias pequeñas o de 24-48 horas para las muestras de resecciones quirúrgicas; presencia de al menos 50 células viables para estudios con IHQ o FISH, de un mínimo de 5% de células tumorales para PCR y de 20-30% para NGS; e incluir controles internos positivos y negativos asociados a cada prueba. Este documento coincide con la guía de ESMO (13) en recomendar el cribado de las fusiones NTRK con IHQ y aquellos casos positivos, confirmarlos mediante INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 84 una segunda técnica, generalmente NGS. Se señala la importancia de que «los pro- fesionales implicados tengan un conocimiento suficiente de las ventajas y desventa- jas de cada tecnología» utilizada para la detección de las fusiones NTRK. Respecto a esta técnica de IHQ, Rojo y cols (9,154) recuerdan la importancia de intentar asegurar la máxima Se posible pues la prevalencia de las fusiones NTKR es muy baja y si un paciente presenta un resultado negativo con IHC, es muy poco proba- ble que se le realicen más pruebas para estudiar si presenta reordenamientos NTRK (16). Además, se señalan estos otros requisitos: 1) el anticuerpo de mayor valor es el EPR17341, 2) como tejido de control positivo se debe utilizar el apéndice, 3) el criterio de positividad sería la tinción en más del 50% de las células neoplásicas, con intensidades de al menos 2+ y 4) la IHQ no tiene ningún valor de cribado en tumores con estructuras de diferenciación neural o de músculo liso por la expre- sión intrínseca NTRK no debida a fusiones de este gen. En relación al uso de FISH para detección de fusiones NTRK, en este docu- mento se recomienda emplear sondas duales con diseño break-apart, y aunque se reconoce la ausencia de estandarización en la interpretación de resultados, se acepta el punto de corte de núcleos positivos del 15-20% en al menos 50 células neoplá- sicas. Se reconoce el papel de FISH para confirmar o descartar fusiones NTRK tras un estudio IHQ positivo, siendo necesario realizar tres procedimientos FISH, uno para cada uno de los genes NTRK. Otras dos indicaciones aceptadas de FISH serían confirmar la positividad IHQ nuclear con un FISH para NTRK3 y detectar la fusión NTRK mediante un único test FISH en una neoplasia cuya histología presupone el tipo de fusión, por ejemplo, ante un carcinoma secretor de mama se plantearía rea- lizar FISH para NRTK3. En cuanto a la NGS, los autores consideran fundamental saber si el panel de NGS que se va a emplear incluye los tres genes y qué «anchura» tiene, es decir, el número de parejas de fusión. Si se utiliza un panel basado en DNA y el resul- tado es negativo, se debe realizar una segunda prueba para confirmarlo, especial- mente si la IHQ era claramente positiva. Si se utiliza NGS basada en RNA y el resultado es negativo, se recomienda repetir la prueba en otro bloque de parafina (de la misma muestra de biopsia o de cirugía) o de una muestra distinta, o utilizar una segunda técnica de confirmación. En cuanto a la utilidad de la RT-PCR en la práctica clínica, se considera que es escasa por su menor Se, por la necesidad de conocer de antemano los pares de fusión y por la dificultad de preservar el RNA en el tejido parafinado. Como pauta general, se recomienda que la determinación de fusiones NTRK se decida en función de la probabilidad esperada según la histología del tumor así como de la disponibilidad de las técnicas diagnósticas y de los tratamientos siguiendo las siguientes pautas: 85 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA • Para tumores con baja prevalencia de fusiones NTRK pero que con frecuen- cia expresan Trk (como los tumores neuroendocrinos, gliomas, sarcomas o GIST) se aconseja utilizar, de entrada, la NGS con un panel amplio que incluya los genes NTRK. • Para los tumores con baja prevalencia de fusiones NTRK y baja expresión de Trk (como en cáncer de pulmón, de mama, colon, páncreas, tiroides), en aquellos laboratorios donde no se realicen determinaciones molecula- res de rutina, el cribado se realizá mediante estudio IHQ (pan-Trk) y los que obtengan un resultado positivo, se confirmarán con NGS, utilizando un panel amplio que incluya los genes NTRK. Por el contrario, si en el labo- ratorio se realizan determinaciones moleculares de rutina, se procederá a NGS que incluya NTRK. • Para tumores con alta prevalencia de fusiones NTRK (como el fibrosar- coma infantil, el carcinoma secretor de mama o de glándulas salivares y nefroma mesoblástico congénito) se recomienda primero realizar FISH si está disponible en el centro, para confirmar la positividad esperada, y los que tengan resultado FISH negativo, se confirmarían con NGS. Si no es posible realizar FISH, directamente se estudiarían con NGS incluyendo los genes NTRK. En el documento de SEOM, SEAP y SEHOP se recomienda realizar la bús- queda de fusiones NTRK en los siguientes casos: 1) en población adulta con cán- cer avanzado o metastásico o cuando estuvieran indicadas cirugías muy agresivas de alta morbilidad, que hayan progresado tras tratamiento o para los que no existen otras opciones terapéuticas alternativas satisfactorias; 2) en pacientes pediátricos, si se trata de tumores con alta prevalencia de fusiones NTRK, tanto en el momento del diagnóstico como en las recaídas, y tanto en tumores localizados como metas- tásicos. También en población infantil se recomienda si la prevalencia de fusiones NTRK no es alta pero el tumor es metastásico, de mal pronóstico o si la resección quirúrgica implicara una grave morbilidad, y en los tumores que han progresado o recaído tras tratamiento estándar y no tienen otro tratamiento alternativo; 3) por el contrario, si se tiene conocimiento de que el tumor presenta alteraciones que son mutuamente excluyentes con fusiones NTRK, no se recomendaría su búsqueda. El algoritmo propuesto por las sociedades científicas españolas se representa en la Figura 6. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 86 Figura 6. Algoritmo para identificar fusiones NTRK, de SEOM, SEAP y SEHOP En el caso del cáncer de pulmón, generalmente se realiza cribado molecular y debe incluirse la búsqueda de fusiones NTRK. Si no se realiza estudio de estas fusio- nes pero el análisis de otras alteraciones (KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, ROS1, ALK, RET) resulta negativo, las personas autoras consideran que sería interesante eva- luar posibles fusiones NTRK pues su presencia es excluyente con esas otras dianas. Concluyen resaltando la necesidad de establecer una estrategia de diagnóstico de las alteraciones de NTRK, en la que se deben tener en consideración otros aspectos 87 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA como los recursos y técnicas diagnósticas disponibles, el número de casos de cada centro y el tiempo hasta obtener el resultado (recomendado de 7-10 días hábiles). Además, recuerdan la importancia de anticipar el posible desarrollo de resistencias a TKIs de primera generación, como consecuencia de mutaciones secundarias. Por todo ello, proponen la articulación de una red de centros de excelencia con dispo- nibilidad de plataformas de NGS adecuadamete financiadas que garanticen la equi- dad en el acceso a estas pruebas a pacientes del territorio nacional y que dicha red fuera coordinada desde el Sistema Nacional de Salud (SNS). 4.2.4.2. Recomendaciones para identificar biomarcadores en CCR, de SEOM y SEAP En 2021 se publicó una actualización de las recomendaciones para la determi- nación de biomarcadores en CCR elaborada por estas dos Sociedades científicas, SEOM y SEAP (125). Las personas autoras de este documento de consenso reco- nocieron el interés clínico existente por la identificación de fusiones NTRK, ALK, RET y ROS1 en pacientes con CCR dado que su presencia se asocia a una peor supervivencia pero también porque serían pacientes candidatos al tratamiento con TKIs. Por eso se aconseja utilizar técnicas de diagnóstico incluso a pesar de su baja prevalencia. Especialmente consideran recomendado su estudio en el subgrupo de pacientes con presencia de alta MSI o ausencia de mutaciones RAS, siendo la IHQ con pan-TRK la técnica de cribado recomendada y en caso de resultado positivo, la confirmación se debe realizar con FISH, RT-PCR o NGS. 4.2.4.3. Recomendaciones para identificar biomarcadores en cáncer de pulmón, de SEOM y SEAP En 2023 se ha publicado la guía para el diagnóstico de biomarcadores predic- tivos en pacientes con NSCLC avanzado, respaldada por SEAP y SEOM (158), que actualizaba una previa del año 2020 (66). El NSCLC ha sido objeto de interés desde hace años porque se trata del tumor sólido con el mayor número de dianas terapéuticas potenciales, lo que supone una oportunidad para el manejo de estos tumores de tan alta prevalencia y que suelen tener mal pronóstico con los trata- mientos quimioterápicos convencionales. El primer aspecto que destaca esta nueva guía es lo referente a la muestra tumo- ral. Se insiste en la importancia de la responsabilidad compartida entre profesio- nales implicados para disponer de una muestra de suficiente cantidad y calidad, de INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 88 modo que el porcentaje de células tumorales disponibles sea el adecuado para rea- lizar estudios moleculares y de IHQ. Las muestras pueden proceder de biopsias o ser muestras citológicas (bien bloques celulares, frotis o biopsia líquida). Señalan, también, que resulta fundamental considerar el tiempo entre su obtención y su fija- ción, y que se debe fijar en formol al 10% durante 6-12 horas si procede de biopsia o entre 24-48 horas si se trata de resecciones quirúrgicas, además de haber al menos entre 50-100 células viables para estudios IHQ y FISH; y que incluya un mínimo de un 5% de células tumorales para RT-PCR y del 20% para NGS. En esta guía se considera que los reordenamientos NTRK, ALK, RET y ROS1 son esenciales para el estudio de pacientes con NSCLC, además de las mutaciones EGFR, KRAS, BRAF V600 y MET, amplificación MET y sobreexpresión PD-L1. Se recomienda estudiar la presencia de reordenamientos ALK en todos los ade- nocarcinomas, en los carcinomas sin evidencia histológica de ser no-escamosos y en los escamosos siempre que estos últimos se den en pacientes menores de 50 años y/o sin o muy bajo hábito tabáquico. El test indicado inicialmente sería la IHQ, por ser rápido, fiable y coste-efectivo, con los anticuerpos D5F3 (Ventana® ALK [D5F3] CDx Assay, Tucson, Arizona, USA) o 5A4 (Novocastra®, Leica Biosystems, Buffalo Grove, Illinois, USA). Para los casos con resultado positivo (fuerte tinción citoplas- mática granular) no sería obligatorio realizar una segunda prueba confirmatoria, pero sí se aconseja si el resultado no es concluyente. Como prueba de confirma- ción se recomienda la NGS-RNA, por su alta Sp y por haber demostrado su utili- dad para detectar fusiones cuando otras pruebas han tenido un resultado negativo. Además, esta guía recomienda el estudio de ROS1 en pacientes con adeno- carcinomas en estadio avanzado (IIIB-IV), independientemente de sus caracterís- ticas clínicas, o con carcinomas de células escamosas sólo si se trata de pacientes sin o con baja exposición al tabaco. Se respalda el uso de IHQ como test de cribado por su alta Se, tal como lo recomiendan otras guías (37), exigiendo un mínimo de 20 células tumorales en la muestra a analizar, y el uso de FISH o NGS para con- firmar un resultado positivo. También se recomienda el estudio de reordenamientos NTRK, con dos posibles estrategias: una primera estrategia mediante un panel de NGS que permita analizar los tres genes NTRK y siempre basado en RNA para evitar FN, y una segunda uti- lizando la IHQ como técnica de screening y posterior confirmación de los resulta- dos positivos con FISH o NGS siguiendo las recomendaciones de la ESMO (13). Para fusiones RET, se recomienda NGS como el método óptimo de diagnós- tico, especialmente secuenciación basada en RNA que resulta más sensible que la 89 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA basada en DNA, aunque también pueden utilizarse IHQ y FISH, reconociendo la dificultad de interpretación de FISH. Se reconoce el papel de la NGS por su papel en el estudio de múltiples genes en pacientes con cáncer de pulmón avanzado, minimizando el uso de tejido y per- mitiendo un diagnóstico en un corto periodo de tiempo. Se recomienda utilizar NGS de forma generalizada y desde el momento inicial del diagnóstico. Se señala la necesidad de seguir un correcto control de calidad en todo el proceso, además de la importancia de una adecuada colaboración multidisciplinar entre profesiona- les con el objetivo final de establecer la mejor estrategia terapéutica. 4.2.5. Recomendaciones de ESMO A nivel europeo, el grupo de trabajo de Investigación Traslacional y Medicina de Precisión de ESMO (ESMO Translational Research and Precision Medicine Working Group) ha publicado varios documentos de recomendaciones relacionadas con la medicina de precisión. En 2019, sobre métodos para la detección de fusio- nes NTRK (13); en 2021, sobre la detección de fusiones RET (41) y en 2020, sobre el uso de la NGS en pacientes con tumores metastásicos (126). 4.2.5.1. Recomendaciones sobre detección de fusiones NTRK, de ESMO. En 2019, ESMO publicó una revisión de los métodos que podían utilizarse para la detección de fusiones NTRK (13). En este documento se señala la necesidad de definir la población que debe ser estudiada y se reconocía la ausencia de un análisis sistemático de fusiones NTRK en diferentes tipos de tumores en grandes cohortes de pacientes con cáncer metastásico. En relación a los tests diagnósticos utilizados para detectar estos genes de fusión, las personas autoras señalan lo siguiente: la IHQ pan-Trk permite un scree- ning fiable y eficiente en cuanto a tiempo de respuesta, y la opción de dos pasos se debe tener en consideración en los ensayos clínicos y en la práctica clínica: si con IHQ se detecta la presencia de expresión Trk, se recomienda su confirmación mediante NGS con paneles multigenes, especialmente la basada en RNA. También se indica que en caso de disponer de una muestra de tejido limitada, la recomenda- ción sería realizar directamente NGS y usar la IHQ como técnica de confirmación. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 90 Para aquellos tumores con baja prevalencia de fusiones NTRK, proponen una aproximación más conservadora con el fin de no descartar pacientes que sí pudieran presentar estas alteraciones intervenibles. Por ello, consideran que la población que debía ser estudiada era aquella con cualquier tumor maligno en estado avanzado, en particular si se habían descartado otras alteraciones genéticas y, en especial si se tra- taba de pacientes jóvenes. Se propone el estudio IHQ para screening y los casos posi- tivos se debían confirmar con NGS-RNA. Para la interpretación de la IHQ, ESMO respaldó los criterios propuestos por Rudzinski y cols (48): una tinción citoplasmática moderada o fuerte y difusa con pan-Trk se consideraría como marcador subrogado de presencia de fusiones NTRK1/2 (siempre que en la lesión no haya diferenciación neuronal o muscular) y si la tinción es nuclear, sería indicativa de fusiones NTRK3. En el caso de tumores con una expresión de pan-TRK citoplasmática leve, la presen- cia de fusión NTRK debería confirmarse con otros métodos moleculares o citogenéti- cos en aquellos pacientes potencialmente candidatos a terapia dirigida. El propósito del screening con IHQ es diferenciar, de forma rápida, entre las muestras que son negativas a pan-Trk y las que presentan una tinción de leve a moderada, que podrían albergar estas fusiones. Sin embargo, ante el cuestionamiento del coste-efectividad de esta alternativa, por su alto coste y la baja prevalencia de tumores con fusiones NTRK (159), el screening propuesto es utilizar paneles dirigidos de NGS para identi- ficar alteraciones drivers intervenibles, incluyendo posibles fusiones NTRK, excepto para aquellos tumores raros con alta prevalencia de fusiones ETV6-NTRK3. La propuesta de ESMO, basada en la literatura, para la detección de fusiones en los genes NTRK1/2/3, se recoge en la siguiente Figura 7, tal como fue publi- cada por las personas autoras. Figura 7. Propuesta de ESMO para detección de fusiones NTRK 91 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Una primera opción basada en el tipo histológico tumoral que denominan histology-based/confirmation approach. Se refiere al caso de tener que estudiar fusiones NTRK en un tipo histológico concreto donde la presencia de fusiones NTRK es muy probable. Para esta situación, se podría utilizar cualquier método diagnós- tico, siempre que se validara en un laboratorio CLIA. El estudio mediante FISH con sondas específicas para fusiones del gen NTRK o mediante RT-PCR representan la opción más coste-efectiva; también sería factible utilizar la NGS-RNA. La segunda opción se refiere a tener que detectar fusiones NTRK en una población no seleccionada. Es lo que denominan la histology-agnostic screening approach. En este caso, consideran dos escenarios posibles: a. si no se dispone de paneles de secuenciación de múltiples genes, se reco- mienda realizar el cribado en dos fases, primero mediante estudio IHQ con pan-TRK (siempre que no exista tejido muscular liso o neuronal) y si el resultado es positivo, entonces se debe enviar la muestra a un laborato- rio externo para realizar NGS y confirmar la presencia de fusiones NTRK. b. si se dispone de plataformas de secuenciación masiva, dependiendo de la carga de trabajo y de los datos de coste-efectividad de cada centro, se puede realizar NGS desde el principio o bien un screening en dos pasos comenzando con IHQ seguido de NGS si el resultado de la IHQ es posi- tivo. Si es posible realizar secuenciación como primera prueba, el método gold standard sería la secuenciación basada en RNA, siempre que se con- firmara una óptima calidad de la muestra de RNA. Los casos positivos de NGS se estudiarían con IHQ para confirmar la expresión de proteínas Trk. No obstante, las personas autoras señalan que la opción más completa sería la siguiente: i) utilizar secuenciación dirigida basada en DNA (paneles multigenes) en todos los pacientes; ii) en los pacientes con resultado negativo, se procedería a realizar secuenciación basada en RNA (paneles multigenes); iii) se utilizaría IHQ para confirmar que existe sobreexpresión proteica de fusiones NTRK puesto que el tratamiento dirigido tiene como diana esas proteínas quinasas. En el documento de ESMO se presenta una tabla resumen que recoge las for- talezas y debilidades de cada prueba para la detección de fusiones NTRK. IHQ, FISH y NGS basadas en DNA o en RNA presentan una alta especificidad; la sen- sibilidad informada es también alta, salvo para la secuenciación basada en DNA, para la que se considera moderada. Se acepta que las tres técnicas permiten iden- tificar los tres genes de fusión NTRK aunque con FISH es necesario utilizar una prueba para cada uno de ellos; IHQ y FISH identifican al par de fusión mientras que esto no es posible con NGS; IHQ y la secuenciación RNA permiten detectar la INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 92 expresión proteica resultante de la presencia de estos genes de fusión; y, por último, a excepción de FISH, estarían indicadas para screening de genes de fusión NTRK. 4.2.5.2. Recomendaciones sobre detección de fusiones RET, de ESMO En 2021, ESMO publicó un documento sobre recomendaciones para identificar fusiones RET (41). Tanto en pacientes con CPT como NSCLC, se descartó el uso de IHQ para el estudio de reordenamientos RET pues pueden existir niveles altos de expresión de este gen sin que ello indique que se trata de reordenamientos RET. Además mencionan que la prueba habitualmente utilizada para detectar esta alteración genética es FISH, con buenos valores de Se y Sp. Se recomienda el uso de sondas break-apart en lugar de sondas de fusión puesto que estas últimas sólo reconocen fusiones con pares conocidos. Sin embargo, se reconocen algunas limita- ciones para la interpretación de resultados con esta prueba, además de la importancia de mantener las muestras en un estado óptimo para evitar la degradación del RNA. Las personas autoras formulan las siguientes recomendaciones para estudiar alteraciones RET con el fin de establecer un tratamiento dirigido anti-RET: • escenario A: pacientes con NSCLC, cáncer de tiroides no-medular u otros tumores sólidos y se dispone de muestras tumorales FFPE. Debe realizarse el estudio con NGS, y si esta prueba identifica la presencia de fusiones o mutaciones RET, se podrá establecer tratamiento con inhibidores RET. Si la NGS no está disponible, se realizará FISH o RT-PCR para estudiar fusiones y Q-PCR (quantitative-PCR) para mutaciones RET en los otros tumores sólidos, y ante un resultado negativo, se recomienda el estudio con paneles dirigidos de NGS. No obstante, los autores señalan que las recomendaciones más recientes de ESMO sugieren realizar estudio NGS multigenes en pacientes con NSCLC, incluyendo paneles para detectar fusiones RET (126). Además de fusiones RET, se recomienda valorar la presencia de mutaciones RET, preferiblemente con NGS. En ningún caso se recomienda IHQ. • escenario B: pacientes con NSCLC, cáncer de tiroides no-medular u otros tumores sólidos pero no se dispone de muestras FFPE. Para estos casos, se recomienda realizar biopsia líquida para estudiar alteraciones RET. Pacientes con resultado positivo, serán candidatos a tratamiento con inhibidores RET, 93 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA pero si no se detectan alteraciones RET, entonces sería necesario obtener una muestra tisular para descartarlas definitivamente. • escenario C: pacientes con CMT para estudiar la presencia de mutaciones RET. La recomendación es realizar Q-PCR o NGS en sangre o en esputo. Si la prueba es positiva a mutación RET, sería necesario consejo gené- tico para descartar la presencia de MEN2. En caso, de que el resultado sea negativo para mutaciones RET, se tomarán muestras de metástasis y se analizarán con NGS si esta prueba está disponible (si no lo está, se uti- lizaría la Q-PCR) y sólo si el resultado es positivo, se considerará candi- dato a terapia dirigida con inhibidores RET. Se desaconseja el uso de IHQ en este tercer escenario. 4.2.5.3. Recomendaciones de uso de la NGS en pacientes con enfermedad metastásica, de ESMO Ante la falta de recomendaciones en ese momento sobre el uso de la NGS por parte de sociedades científicas, el grupo de trabajo de medicina de precisión de ESMO publicó un documento en el que se valoraba la utilidad clínica de esta tec- nología en diversos procesos tumorales metastásicos (126). Este trabajo fue reali- zado por un grupo de personas expertas con el objetivo de responder a las siguientes preguntas: ¿debería utilizarse la NGS en la práctica clínica? Si la respuesta era sí, la siguiente pregunta era ¿deberían utilizarse grandes paneles de genes? Para ello, se utilizó la ESCAT que había sido desarrollada por ESMO en 2018 para armoni- zar y estandarizar cómo informar sobre datos genómicos clínicamente relevantes y que permite establecer el grado de concordancia entre un fármaco y una altera- ción genómica, de acuerdo a su posibilidad de ser intervenible (86). ESCAT es un marco que clasifica los targets de la medicina de precisión basados en la eviden- cia clínica para ayudar a profesionales sanitarios en la priorización de los poten- ciales targets de uso clínico basado en los resultados de paneles de secuenciación. Ver Tabla 5 de niveles ESCAT en Anexo I. Además, las personas autoras utilizaron los datos del estudio KN158, que evaluaba la eficacia del pembrolizumab en diez tumores diferentes de acuerdo a la TMB. Consideran que desde la perspectiva de la salud pública: los resultados de los paneles NGS podrían llevar a recomendar el uso de fármacos de elevado coste fuera de las indicaciones aprobadas para el mismo y consideran necesario regular el volumen de procedimientos NGS a nivel nacional. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 94 En relación a las alteraciones genéticas estudiadas en el presente informe, ESMO recomienda estudiar el perfil molecular con NGS para detectar alteraciones de nivel I de la ESCAT en pacientes con NSCLC avanzado. Además, dada la alta frecuencia de fusiones, recomiendan NGS basada en DNA o RNA como opciones más adecuadas. En casos de CCR, no recomiendan realizar NGS de forma habi- tual, aunque podría ser una alternativa a la PCR si no genera un coste extra en com- paración a las técnicas ya implementadas de rutina. Si se utilizan amplios paneles de genes, debe incluirse el estudio de fusiones NTRK. Para pacientes con cáncer gástrico metastásico, la detección de fusiones NTRK se debería realizar con los métodos estándar más económicos y no se recomienda realizar NGS; esta misma recomendación se dio para adenocarcinoma ductal avanzado de páncreas y para el carcinoma hepatocelular avanzado. En relación al estudio de fusiones NTRK, dado que su frecuencia es muy baja, se recomienda priorizar otras pruebas diagnósticas alternativas, más baratas, para el screening de pacientes con fusiones NTRK y realizar NGS sólo en tumores donde la prueba estuviera indicada por otros motivos. La NGS se utiliza en la práctica asistencial con el objetivo de secuenciar genes complejos o grandes y/o múltiples genes en muestras tumorales con el fin de iden- tificar dianas intervenibles y contribuir a la toma de decisiones terapéuticas. Las personas autoras señalan que una de las ventajas de la NGS es que requiere sólo pequeñas cantidades de tejido por lo que el estudio de múltiples genes es posible realizarlo sin necesidad de realizar múltiples biopsias. También remarcan el hecho de que algunos tumores pueden modificarse a lo largo del tiempo, hecho que debe tenerse en cuenta si el estudio genético se ha realizado al principio del diagnóstico. Finalmente, este documento recomienda que en aquellos centros hospitalarios en los que se realice investigación clínica, se deben incluir pacientes con NSCLC, cáncer de mama y CCR metastásico en programas de screening molecular y se les debe proponer el acceso a los nuevos fármacos en el contexto de ensayos clínicos. 4.2.6. Guías norteamericanas 4.2.6.1. Guía de la NCCN para diagnóstico de fusiones NTRK en NSCLC La última guía elaborada por la NCCN sobre NSCLC (127) señala el impacto que la presencia de las alteraciones genéticas tiene en la selección del tratamiento y la importancia de identificar dichas alteraciones para poder establecer una terapia 95 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA dirigida eficaz y evitar los tratamientos que probablemente no vayan a aportar nin- gún beneficio clínico. Por ello, esta guía recomienda realizar tests para determi- nados biomarcadores moleculares e inmunológicos para evaluar si pacientes con NSCLC en estadio IV (enfermedad avanzada o metastásica) son candidatos a las terapias dirigidas o a inmunoterapias. Los biomarcadores moleculares predictivos de respuesta favorable a la terapia incluyen genes de fusión NTRK1/2/3 y reorde- namientos ALK, RET y ROS1, entre otros. Se recomienda realizar un estudio mole- cular que incluya un perfil molecular amplio, con el fin de identificar las alteracio- nes de cada paciente y elegir el tratamiento más adecuado. La NCCN ya recomendaba realizar tests para detectar fusiones NTRK en pacien- tes con ncslc metastásico en su guía de 2019 (155). El estudio molecular se utiliza para identificar drivers oncogénicos para los que existen terapias dirigidas disponibles. En pacientes con NSCLC no-escamoso metastásico, esta guía recomienda estudiar la presencia de reordenamientos ALK pues sería predictiva de buena respuesta a terapia dirigida con alectinib, brigatinib o lorlatinib (para primera línea); ceritinib sería «otro recomendado» y crizotinib «sólo útil en ciertas circunstancias». Se podría realizar FISH o IHQ (ambos apro- bados por la FDA) o NGS. Esta guía reconoce las limitaciones de la NGS-DNA para identificar algunas fusiones NTRK1 y NTRK3, que podrían solventarse utilizando NGS-RNA. Las per- sonas autoras recomiendan el test para fusiones NTRK en pacientes con NSCLC no-escamoso metastásico, dada la eficacia demostrada del larotrectinib y entrecti- nib en pacientes con fusiones NTRK positivos, pero también señalan que los datos clínicos en este tumor son limitados para respaldar esta recomendación. Además, en esta guía se dice que para pacientes con NSCLC escamoso metastásico se debe- ría considerar realizar el test para evaluar la presencia de fusiones NTRK1/2/3. Este panel recomienda entrectinib o larotrectinib como primera línea de tratamiento en pacientes con NSCLC metastásico positivo a fusiones NTRK. También, si no se habían administrado larotrectinib ni entrectinib como primera opción. El panel NCCN para NSCLC recomienda testar la presencia de reordenamien- tos RET en pacientes con metástasis, dada la eficacia de diferentes fármacos, en concreto, de selpercatinib y pralsetinib, aprobados por la FDA. La detección de reordenamientos ROS1 es un requisito previo a pautar un tra- tamiento con inhibidores TKI, como el crizotinib. En esta guía se recomienda estu- diar la presencia de estos reordenamientos en pacientes con NSCLC no-escamoso metastásico y se debería considerar en aquellos con NSCLC escamoso metastá- sico. En cuanto al tratamiento de estos pacientes, se recomienda el uso de ceritinib, INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 96 crizotinib, entrectinib y lorlatinib. El entrectinib está recomendado como primera línea de tratamiento; también en pacientes tratados con crizotinib o ceritinib tras sufrir progresión de la enfermedad con metástasis cerebrales. En general, se reco- miendan entrectinib o crizotinib en monoterapia como primera línea por su efecti- vidad y mejor tolerancia; el ceritinib es considerado como «otra opción recomen- dada» y lorlatinib se indicaría cuando progresa la enfermedad en pacientes que han sido tratados con cualquiera de los otros tres fármacos. 4.2.6.2. Guía sobre biomarcadores en cáncer de pulmón, de CAP-IASLC-AMP En 2018, el CAP-IASLC-AMP publicaron la actualización (37) de una guía previa (160), con el objetivo de responder a las siguientes cinco preguntas: 1) qué genes deberían estudiarse de forma rutinaria en pacientes NSCLC no-escamoso en cualquier estadio clínico, 2) qué métodos son apropiados, 3) si hay que tes- tar a pacientes con tumores de células escamosas, de células pequeñas u otros no-adenocarcinomas, 4) qué test debería realizarse en pacientes con alteraciones dianas que hayan progresado tras haber presentado respuesta inicial con el ade- cuado tratamiento dirigido, y 5) cuál es el papel de analizar el DNA celular libre circulante en el manejo de pacientes con cáncer de pulmón. En esta guía se clasifican los biomarcadores en tres grupos: un primer grupo de obligado estudio en pacientes con adenocarcinoma de pulmón avanzado que pueden ser candidatos a tratamiento dirigido, y que son los genes EGFR, ALK y ROS1; un segundo grupo de biomarcadores que deberían testarse, que se utilizan para seleccionar a pacientes que pueden beneficiarse de participar en ensayos clí- nicos (que incluye RET, entre otros); el último grupo lo compondrían aquellos bio- marcadores que sólo se estudian en el ámbito de la investigación, pero que no son candidatos para uso clínico. La metodología empleada fue la de las revisiones sistemáticas de la literatura, con límites de fecha de búsqueda entre 2013 y junio de 2015, y las opiniones de un panel de personas expertas (técnica de grupo nominal). Se evaluó la capacidad diagnóstica de los diferentes tests y plataformas de estudio de varias alteraciones genéticas en EGFR, ALK, KRAS, ROS1, RET, MET, BRAF y ERBB2, así como la respuesta al tratamiento, único o combinado. La anterior guía del 2013 recomendaba estudiar a pacientes con adenocarci- noma avanzado la presencia de reordenamientos ALK mediante FISH, y se acep- taba cualquier algoritmo diagnóstico con adecuada Se y un tiempo de respuesta de 97 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 10 días, que se realizara bajo unos estándares de calidad de laboratorio validados. En relación a pacientes en estadio precoz de cáncer de pulmón, en esta guía se con- sideraba que cada institución debe tomar la decisión que considere más adecuada. Las recomendaciones de la nueva guía actualizada son las siguientes: • Se aconseja realizar test para ROS1 en todos los adenocarcinomas, inde- pendientemente de las características clínicas del paciente (nivel fuerte de recomendación). La IHC se puede utilizar como test de screening y los casos positivos se tienen que confirmar mediante pruebas molecula- res (RT-PCR o NGS) o citogenéticas (FISH) (recomendación basada en la opinión consensuada de expertos), mientras que pacientes con IHQ nega- tivo a ROS1 pueden darse como verdaderos negativos, dada la alta Se del test. Los reordenamientos ROS1 generan un oncogen de fusión responsable del desarrollo de un cáncer de pulmón que resulta sensible a tratamiento dirigido, por ejemplo, a crizotinib. Las características clínicas de las per- sonas enfermas (como ser no-fumador, mujer, joven) no deben tenerse en cuenta a la hora de estudiar la presencia o no de ROS1 pues no aparecen de forma constante en todos los estudios. Se propone comenzar el estudio de otras alteraciones en EGFR y ALK, y en pacientes con resultado negativo, estudiar la presencia de ROS1 pues suelen ser mutuamente excluyentes. • En cambio, recomiendan que RET sólo debe estudiarse en el entorno de ensayos clínicos y no de forma rutinaria. Se considera adecuado incluir RET en paneles amplios de genes, bien inicialmente o si el test rutinario de EGFR, ALK y ROS1 ha ofrecido resultados negativos, y no estudiarlo asiladamente. • El estudio de ALK (y también de EGFR) se recomienda (fuerte nivel de recomendación) en pacientes con adenocarcinoma de pulmón independien- temente de las características clínicas, y en otros tipos histológicos cuando los datos clínicos sugieran una alta probabilidad de alteraciones molecu- lares. Para testar ALK, se considera que el estudio IHQ es una alternativa equivalente a FISH y, por tanto, aceptable, y se acepta que las decisiones terapéuticas se deben realizar cuando los resultados del estudio IHC sean claramente negativos o positivos, mientras que ante resultados dudosos, se recomienda realizar FISH, RT-PCR o NGS. • La guía señala que hasta el momento de su elaboración, la FDA no había aprobado el uso de RT-PCR ni NGS como tests de primera opción para seleccionar pacientes que pudieran ser candidatos a inhibidores ALK, a pesar de que presentan un rendimiento similar al análisis IHC, con una Sp muy alta para detectar la mayoría de las fusiones ALK. Así, se reconoce INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 98 que pacientes con resultado positivo, se deberían tratar con inhibidores ALK, pero en el caso de resultado negativo deben ser estudiados mediante un método más sensible para excluir otras posibles fusiones. • La NGS permite estudiar de forma simultánea los tres genes de obligado estudio, es decir, EGFR, ALK y ROS1. Los paneles de secuenciación de múltiples genes son preferibles (opinión consensuada de los expertos) a los tests de un solo gen para identificar otras opciones terapéuticas más allá de EGFR, ALK y ROS1. Además de mutaciones, con esta tecnología es posible detectar fusiones/reordenamientos y alteraciones en el número de copias en los genes diana. Por otro lado, se reconoce que la NGS basada en cap- tura híbrida es preferible para el estudio inicial de pacientes con NSCLC para detectar reordenamientos ALK y ROS1 y otros posibles marcadores genéticos, mientras que para la monitorización y estudio de resistencias secundarias la secuenciación por amplicones sería la técnica preferible. • En tumores sin componente histológico de adenocarcinoma, se podría rea- lizar el test de biomarcadores moleculares cuando las características clíni- cas del paciente hagan sospechar con alta probabilidad la existencia de un driver oncogénico (opinión de expertos), por ejemplo, el estudio en meno- res de 50 años sería una «estrategia razonable». • En cuanto a las muestras tisulares, se recomienda utilizar las muestras FFPE, o muestras frescas congeladas o fijadas en alcohol. • Por otro lado, se considera que existe una evidencia insuficiente para res- paldar el uso de biopsia líquida basada en DNA libre circulante en plasma para el diagnóstico de adenocarcinoma de pulmón primario, por lo que no se recomienda su estudio. Sólo se recomienda en casos de progresión o resistencia a inhibidores tirosina quinasa EGFR (opinión consensuada de los expertos). • En relación al momento de realizar el estudio de biomarcadores, se acepta que puede ser en el momento del diagnóstico, o en pacientes en estadios avanzados (IIIB y IV) o si se produce progresión de la enfermedad. • Se recomienda que el tiempo hasta obtener los resultados sea de 2 sema- nas (10 días laborables). 99 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 4.2.6.3. Guía sobre diagnóstico de biomarcadores en cáncer de pulmón, de ASCO En 2018, ASCO respaldó (128) la guía anteriormente comentada de la CAP-IASLC-AMP de ese mismo año 2018 tras ser revisada por un panel de per- sonas expertas y sólo añadieron pequeñas modificaciones y recomendaciones. En esta guía ASCO se considera que cualquier muestra con adecuada celularidad y bien preservada puede servir para el estudio de alteraciones genéticas, no sólo los bloques celulares. Los métodos diagnósticos para estudiar biomarcadores permi- ten el análisis en muestras que contengan incluso sólo un 20% de células tumora- les. Como recomendaciones nuevas en comparación a la guía del 2013 (160), se dice que en pacientes con adenocarcinoma de pulmón avanzado se debe estudiar el gen ROS1, independientemente de las características clínicas del paciente. La IHQ para ROS1 se puede utilizar para screening, pero todos los casos positivos debe- rán se confirmados mediante métodos moleculares o citogenéticos. También, como diferencia a la anterior guía, se recomienda estudiar alteraciones BRAF en todos los adenocarcinomas en estadios avanzados, independientemente de sus caracte- rísticas clínicas. RET, ERBB2, KRAS y MET aisladamente sólo se deben estudiar en el contexto de ensayos clínicos o si se incluyen dentro de amplios paneles, bien en el estudio inicial o si el estudio de rutina de los genes EGFR, ALK, BRAF y ROS1 ha sido negativo. También el panel de personas expertas de ASCO llega a la conclusión de que el estudio de biomarcadores moleculares se debía realizar en todos los tumores que fueran adenocarcinomas, o si su histología fuera no-escamosos no de células peque- ñas y en todos los carcinomas de células no pequeñas en pacientes con caracterís- ticas clínicas que indicaran alta probabilidad de drivers oncogénicos. Por otro lado, las personas expertas reconocen la falta de evidencia científica para respaldar el estudio de mutaciones ALK en pacientes que hayan sufrido pro- gresión de la enfermedad tras tratamiento con TKI dirigidos a ALK. También reconocen una evidencia insuficiente para utilizar métodos de estu- dio de DNA libre (cfDNA) en adenocarcinomas primarios de pulmón y que sólo puede indicarse esta prueba cuando la cantidad de tejido dispone es muy limitada para estudiar mutaciones EGFR. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 100 4.2.7. Documentos de consenso, guías y/o recomendaciones de otras Sociedades Científicas 4.2.7.1. Consenso canadiense sobre estudio de marcadores y tratamiento de adultos y niños con tumores positivos a fusiones NTRK En 2021 se publicaron sendos documentos de consenso, para adultos (129) y pacientes en edad pediátrica (130). El referido a personas adultas (129) se centró en pacientes con los siguientes cinco tipos de tumores malignos: cáncer de tiroides, CCR, NSCLC, SPB y carcinoma de glándulas salivares. Y el de población pediátrica (130), estudiaba el fibrosarcoma infantil, carcinoma diferenciado de tiroides y glio- mas. En Canadá se habían aprobado el larotrectinib, en julio de 2019 para población adulta y pediátrica, y el entrectinib, sólo para población adulta, en febrero de 2020. En tumores de tiroides, se recomienda realizar test de rutina para estudio de fusiones NTRK1-3 en el momento del diagnóstico si el tumor no es resecable o en estadio avanzado/metastásico para todos independientemente del tipo histoló- gico. Si el tumor es resecable, se estudiaría en casos de recurrencia y en todos los refractarios a la terapia con iodo radiactivo. Como test, se recomienda IHQ pan-Tkr seguido de NGS para confirmar los casos positivos o equívocos de IHQ. Además, se recomienda utilizar TKIs como primera opción de tratamiento sistémico para pacientes con fusiones NTRK, dados los resultados de tolerabilidad y de tasas de respuesta en comparación al tratamiento estándar. En pacientes con CCR recomienda realizar test para identificar fusiones NTRK en todos los tumores RAS/BRAF no mutado (wild-type) y con alta MSI o dMMR. Se estima que menos de un 5% de pacientes con CCR metastásico requerirá el estudio de genes de fusión NTRK. En cuanto al tratamiento, por consenso se deter- minó que los TKIs se indicarían en pacientes para los que no existan otras opcio- nes alternativas satisfactorias, incluso que sería razonable su utilización como pri- mera línea terapéutica. En cuanto al NSCLC, este documento de consenso considera que sería acepta- ble realizar el screening con IHQ para valorar la expresión de ALK, ROS1, pan-Trk y PD-L1. Para confirmar los casos positivos pan-Trk y ROS1 se recomienda realizar NGS. Otra opción sería estudiar los genes EGFR, ALK, ROS1, NRG1 y RET, pues la presencia de mutaciones en esos genes es excluyente de genes de fusión NTRK. Las personas autoras recomiendan la implementación como test de rutina en la práctica asistencial para estudiar la presencia de genes de fusión NTRK1-3 en 101 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA todos los tumores en estadio III/IV con enfermedad localmente avanzada o metas- tásica. En los tumores no-escamosos se recomienda realizar IHQ para PD-L1 y tests moleculares para estudiar mutaciones en EGFR, genes de fusión ALK, ROS1, NRG1, NTRK y RET, así como para otros genes con conocidos drivers oncogé- nicos. El estudio molecular exhaustivo se recomienda para seleccionar pacientes con carcinomas escamosos con histología mixta o en caso de pacientes fumado- res o fumadores leve. Para los NSCLC positivos a fusiones NTRK se recomienda el tratamiento con TKIs. Este documento también recomienda realizar screening con NGS y no pan-Tkr IHQ en pacientes con GIST sin mutaciones KIT/PDGFRA porque el estudio IHQ se asocia a una leve tinción difícil de interpretar, y dado que el número de pacien- tes estimado es pequeño, se considera factible utilizar NGS para estos casos. Para los demás subtipos de SPB localmente avanzados o metastásicos se recomienda pan-Trk IHQ con posterior NGS para confirmar los casos positivos o no concluyentes. Para los carcinomas secretores de glándulas salivales se recomienda NGS para estudiar fusiones NTRK1-3 y RET, aunque respaldan la posibilidad observada en algunos centros de comenzar estudiando si el tumor es HER2 negativo o recep- tor androgénico negativo, pues serían excluyentes de fusiones NTRK, lo que redu- ciría en más de un 90% de pacientes que tendrían que ser estudiados para NTRK. Cuando no está claro cuál es el tipo histológico, se recomienda realizar NGS inclu- yendo el estudio de genes de fusión NTRK1-3 y no se recomienda el uso de pan-Trk IHQ para screening. Para pacientes con tumores positivos a genes NTRK de fusión se recomienda terapia de primera línea con TKIs. En población pediátrica con cáncer diferenciado de tiroides no resecable o en progresión y que no responde a la terapia estándar de cirugía y radioiodo, se recomienda utilizar amplios paneles de genes para NGS, incluyendo genes de fusión NTRK1-3, RET y ALK, mutaciones BRAF, y mutaciones o sobreexpresión MET. Si el tumor es un glioma, el estudio dependería de la localización e histo- logía tumorales y la edad del paciente. La pan-Trk IHQ no está indicada pues es normal la expresión de Trk en el tejido del SNC, y se debe realizar NGS-RNA o NanoString. Y para los fibrosarcomas infantiles, la recomendación es realizar a todos NGS-RNA dado que el número de pacientes al año es muy escaso y el estu- dio resulta factible económicamente. Tanto para pacientes adultos como para pacientes en edad pediátrica, en el caso de tumores con alta prevalencia de genes de fusión NTRK, especialmente de ETV6-NTRK3, se puede utilizar una técnica específica para esta alteración gené- tica, bien FISH o RT-PCR, y ante un resultado positivo para fusiones ETV6-NTRK y los que tengan resultados negativos, se estudiarán con NGS-RNA de confirmación. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 102 Para los tumores con prevalencias intermedias o bajas de fusiones NTRK se reco- mienda realizar directamente NGS-RNA para todos los drivers oncogénicos cono- cidos, incluyendo los genes NTRK1-3. No obstante, los autores reconocían que esta opción no está extendida en Canadá y para aquellos centros donde no es factible, recomiendan screening con pan-Trk IHQ y posterior NGS de confirmación si la IHQ da un resultado positivo o equívoco. Respecto al tratamiento, se recomienda el uso de los TKIs como primera opción de terapia sistémica para pacientes sin otras alternativas efectivas o posibles. Las personas autoras finalizan el documento reconociendo que en el futuro la tecnología diagnóstica a utilizar sería la secuenciación masiva paralela mediante grandes paneles NGS, pero que esta opción no es todavía posible en Canadá. Por ello, señalaron la necesidad de establecer un protocolo para realizar el screening de tumores con fusiones NTRK de una manera metodológica que puediera resultar económicamente factible para un sistema sanitario público. No obstante, reconocen la variabilidad encontrada en los diferentes centros de Canadá, tanto en el tipo de tests como en su disponibilidad y sus procedimientos. Por esto, este documento de consenso fue presentado con la intención de ofrecer unos principios generales que debían ser adaptados a las circunstancias concretas de cada laboratorio. 4.2.7.2. Guía sobre el diagnóstico de NTRK en tumores sólidos, de JSCO y JSMO En el año 2020 se publicó la guía elaborada por las Sociedades japonesas de oncología clínica (JSCO) y oncología médica (JSMO) y hematología/oncología pediátrica en relación al diagnóstico de tumores sólidos en estadio avanzado posi- tivos a genes NTRK de fusión y al tratamiento recomendado (131). Para ello, se formularon varias preguntas clínicas y se recogió la evidencia científica existente para cada una de ellas a partir de una búsqueda de literatura en PubMed y la base de datos Cochrane, desde enero de 1980 a agosto de 2019. Tras la revisión sistemá- tica realizada para cada pregunta clínica, profesionales del comité de la guía esta- blecieron unos niveles de recomendación para cada una de las preguntas de inves- tigación. En el momento de desarrollar esta guía, en Japón sólo estaba aprobado el uso de entrectinib. Respecto a estudiar la presencia de fusiones NTRK, en esta guía no se reco- mienda realizarlo en pacientes con tumores sólidos en los que se hayan identificado otras alteraciones genéticas mutuamente excluyentes de fusiones NTRK; en cam- bio, se considera altamente recomendable su estudio en tumores con alta prevalen- cia de fusiones NTRK; y también se recomienda en pacientes con tumores sólidos 103 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA metastásicos o recurrentes, no incluidos en los dos supuestos anteriores, con el fin de valorar la administración de tratamiento con TKIs. Igualmente, se recomienda en tumores con alta frecuencia de presencia de fusiones NTRK, incluso cuando sean personas candidatas a tratamiento radical y para pacientes con tumores sóli- dos en estadio precoz, no incluidos entre los anteriores, para determinar la aplica- bilidad de los TKIs. Es altamente recomendado que los test para estudiar fusiones NTRK se reali- cen antes de iniciar el tratamiento estándar o durante el mismo. En cuanto al tipo de tests a realizar, la NGS es altamente recomendable para estudiar si pueden administrarse TKIs; no se recomienda utilizar FISH para scree- ning de fusiones NTRK; y para algunas fusiones (como ETV6-NTRK3) puede rea- lizarse FISH o PCR sólo en tumores con alta prevalencia de fusiones NTRK. La IHQ se recomienda como test de screening pero no para determinar la aplicabili- dad de los TKIs. Respecto al tratamiento, se considera altamente recomendable utilizar los TKIs en tumores sólidos con fusiones NTRK cuando no son resecables o son metastási- cos o recurrentes. Y se recomienda su utilización desde el inicio del tratamiento, aunque las personas autoras reconocen la ausencia de estudios comparativos entre estos fármacos y la terapia estándar por lo que aconsejan tomar decisiones de forma individualizada. En resumen, en esta guía se considera altamente recomendable estudiar la pre- sencia de fusiones NTRK al comenzar del tratamiento. También, estudiar mutacio- nes NTRK en pacientes inicialmente sensibles al tratamiento con TRKIs pero que con el tiempo desarrollaron resistencias al mismo, para quienes, además, se con- sidera razonable administrar TKIs de segunda generación, aunque se reconoce la necesidad de más investigación sobre este aspecto. 4.2.7.3. Documento de consenso sobre diagnóstico de fusiones NTRK en tumores sólidos, de JSCO, JSMO, ESMO, ASCO y TOS En 2020, se publicaron las recomedaciones (84) establecidas por consenso de un grupo de 19 personas expertas internacionales reunidos por JSCO en octubre de 2019. Además de profesionales de esta sociedad científica, también participa- ron otros de JSMO, ESMO, ASCO y de la sociedad de oncología de Taiwan (TOS). El objetivo era estudiar la efectividad de la inmunoterapia anti PD-1/PD-L1 y la INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 104 presencia de fusiones NTRK como predictora de eficacia frente a los fármacos tumor-agnósticos larotrectinib y entrectinib en pacientes con tumores sólidos. Para este segundo objetivo, el grado de acuerdo entre personas expertas alcanzó el 100% para las siguientes preguntas clínicas: 1) pacientes con tumores sólidos avanzados (no resecables o metastásicos) sin mutaciones/fusiones/amplificaciones drivers deberían ser estudiados para determinar si presentan fusiones NTRK; 2) pacientes con tumores sólidos avanzados (no resecables o metastásicos) con alta probabili- dad de presentar fusiones NTRK deberían ser estudiados para determinar si las hay, especialmente, las ETV6-NTRK3; 3) pacientes con tumores sólidos avanzados (no resecables o metastásicos) fuera de los dos casos previos deberían ser considerados para hacerles tests de fusiones NTRK; 4) pacientes con tumores localmente avan- zados y alta incidencia de fusiones NTRK se deberían someter a estudio de estas fusiones si se planteara terapia neoadyuvante antes de la resección. Las tres prime- ras preguntas recibieron un grado de recomendación A y la cuarta, B. En cuanto al momento oportuno para realizar el test para fusiones NTRK, se acepta que se debe estudiar antes o durante el tratamiento estándar de tumores sólidos avanzados y siempre en el contexto de paneles amplios de NGS que inclu- yan las fusiones NTRK. Para esta recomendación hubo un acuerdo del 100% y un grado de recomendación B. Respecto a los tests recomendados para estudiar las fusiones NTRK, se alcanzó un grado de acuerdo del 100% en las siguientes recomendaciones: 1) no se reco- mienda IHQ para confirmar fusiones NTRK, sino que esta técnica sólo se acon- seja para screening; 2) no se recomienda FISH de rutina pero sí para fusiones ETV6-NTRK3 en pacientes con alta probabilidad de albergar fusiones NTRK; 3) se recomienda la RT-PCR para fusiones ETV6-NTRK3 si el tumor tiene alta probabi- lidad de presentar fusiones NTRK; 4) se recomienda NGS con paneles que detec- ten fusiones NTRK. El grado de recomendación para las 3 primeras técnicas fue B y para la NGS fue C. Las personas expertas consideran que tanto las muestras frescas como FFPE pueden ser apropiadas para los tests, siempre que hayan sido adecuadamente fija- das y preservadas. Se señala el especial cuidado que debe tener el RNA por su labi- lidad. Además, están de acuerdo en que la NGS se convertiría en el futuro en la herramienta fundamental para informar las decisiones clínicas dado que se preve un incremento progresivo en el número de biomarcadores predictivos de buena respuesta al tratamiento. 105 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 4.2.7.4. Recomendaciones de la red mundial de sarcomas sobre diagnóstico y manejo de sarcomas con fusiones NTRK Demetri y cols (132) publicaron en 2021 un documento para recoger las reco- mendaciones de un panel de personas expertas en oncología y patología, con el que guiar el manejo de pacientes con sarcomas positivos a genes NTRK de fusión. Proponen un algoritmo diagnóstico teniendo en cuenta el estadio de la enfermedad y los subtipos histológico y molecular del tumor. Dados los buenos resultados de eficacia y el buen perfil de seguridad de los TKIs en pacientes con sarcomas positivos a genes NTRK de fusión, señalan que el estudio de esta alteración genética debe incorporarse en el manejo clínico de pacien- tes con sarcomas. Se señalan algunos retos como el bajo número de sarcomas con fusiones NTRK, los problemas con el tamaño de las muestras, el coste económico de las pruebas diagnósticas, los recursos limitados y la complejidad de integrar las nuevas técnicas moleculares en los algoritmos habituales de diagnóstico. Pero a pesar de todo ello, se reconoce el beneficio de realizar este estudio. La NGS y RT-PCR son las técnicas más recomendadas, pero en este documento se indica que la IHC puede utilizarse como test rápido y más económico para realizar el screening. El estudio de las fusiones NTRK podría no ser necesario en pacientes con sarcomas primarios o resecables, pero en casos de alto riesgo de recurrencia sí se aconsejan puesto que aportan una información muy relevante para el manejo tera- péutico posterior. También se recomienda en casos localmente avanzados, o si son tumores no resecables o metastásicos que no responden al tratamiento convencional. En este documento se propone una estrategia diagnóstica en función de la fre- cuencia de fusiones NTRK en los sarcomas. Si ésta es alta, se recomienda FISH, IHQ o NGS. Un resultado negativo de FISH o de IHQ se deberían confirmar mediante NGS mientras que un resultado positivo de FISH o de IHQ se debería confirmar con NGS al tiempo que se administra el tratamiento. Para aquellos tumores de baja frecuencia de fusiones NRTK, sólo debería realizarse el screening si se sabe que el tumor es negativo para otras alteraciones genéticas que sean mutuamente exclu- yentes con fusiones NTRK. Se reconoce la necesidad de poner en marcha un estudio prospectivo de pacien- tes con sarcoma dada la falta de información que todavía se tiene sobre las altera- ciones genéticas asociadas a estos tumores que engloban un conjunto de procesos malignos altamente heterogéneo. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 106 Respecto a la terapia con larotrectinib o entrectinib, constataron la falta de estudios comparativos con el tratamiento estándar y que tampoco existen estudios de seguridad a largo plazo. La IHQ y la secuenciación dirigida con paneles que incluyan a los genes NTRK de fusión, serían las herramientas de mayor valor diag- nóstico en sarcomas. 4.2.7.5. Documento de consenso australiano sobre detección de ROS1 en NSCLC Las personas autoras desarrollaron este trabajo con el objetivo de describir la mejor aproximación para identificar reordenamientos ROS1 en la práctica clínica en pacientes con cáncer de pulmón, de modo que se les pudiera suministrar el trata- miento más específico y a tiempo (34). Se analizaron seis artículos que presentaban la información generada de varios ensayos clínicos realizados entre 2017 y 2019 en los que se administraron TKIs a pacientes con NSCLC avanzados positivos a ROS1. IHQ sería la técnica de screening de elección para detectar incrementos en los niveles proteicos de ROS1. La revisión realizada confirmaba que la IHQ es efectiva para identificar reordenamientos ROS1 en pacientes con NSCLC, con valores de Se del 100% y de Sp que oscilaron entre 92-100%. En los casos positivos, estaría indicado realizar FISH, por tanto, FISH se considera la prueba estándar para con- firmar estos reordenamientos, mientras que un resultado positivo de IHQ no se con- sidera predictivo de buena respuesta a inhibidores ROS1. Además, recuerdan que en Australia, el sistema de salud sólo reembolsa el test FISH en casos de NSCLC no-escamosos en los que la IHQ haya dado un resultado 2+ o 3+ de positividad. Para FISH, la recomendación es utilizar sondas break-apart para estudiar reor- denamientos ROS1 en muestras FFPE de cáncer de pulmón. De hecho, para poder acceder a tratamiento con crizotinib, es un requisito imprescindible tener la con- firmación de reordenamiento ROS1 por FISH. Se considera positivo si al menos un 15% de las células tumorales, con un mínimo de 50 células tumorales, mues- tra un patrón de separación entre la señal roja y verde de al menos una vez su diá- metro o un patrón de señal aislado 3´. Se han descrito algunos FN de FISH, por lo que aconsejan que cada laboratorio debe establecer sus propios cut-offs. Además, se reconoce la importancia de realizar el estudio de las alteraciones genéticas en paralelo y no en serie, y que esta pauta va a resultar aún más necesaria en un futuro próximo cuando la detección de determinadas alteraciones genéticas sea impres- cindible para establecer la terapia dirigida. 107 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Sobre la NGS recuerdan que es capaz de detectar mutaciones somáticas, indels, fusiones y alteraciones en el número de copias en una muestra de biopsia con una cantidad escasa de células tumorales (tan baja como del 5%). Además, a diferen- cia de FISH, la NGS permite identificar algunas mutaciones de valor pronóstico como son ALK V3 o CD74-ROS1 cuya presencia en pacientes con cáncer de pul- món presupone mayor probabilidad de metástasis cerebrales. Dada la buena repuesta a la terapia con TKIs observada en los NSCLC posi- tivos a ROS1, respaldan el uso de estos fármacos como primera línea en casos de tumores en estadio avanzados, y se recomienda la incorporación de los tests para estudio de los reordenamientos ROS1 entre las primeras pruebas a realizar en los NSCLC no-escamosos. 4.2.7.6. Documento de consenso sobre diagnóstico molecular en NSCLC de India Se trata de un documento de consenso basado en la evidencia cuyo obje- tivo era guiar el diagnóstico molecular de NSCLC avanzado, con el fin de redu- cir la complejidad del análisis de múltiples genes y minimizar las variaciones en la práctica clínica, y así conseguir un screening coste-efectivo que permita orien- tar el tratamiento personalizado para alcanzar los mejores resultados en salud de estos pacientes en India (133). Las recomendaciones de este documento se generaron a partir de la evidencia encontrada en la literatura, pero para los casos de una evidencia publicada inade- cuada, las recomendaciones se basaron en la experiencia del panel de expertos que elaboró este documento. En relación a los reordenamientos ALK y ROS1, reconocen su presencia en un 3-7% y 1-2% de pacientes indios con NSCLC, respectivamente, y las fusiones RET, también se presentaban en un 1-2%. La fusión más prevalente de ALK se da con el gen que codifica la proteína EML4, apareciendo sobre todo en pacientes no fumadores con adenocarcinoma. Los reordenamientos ROS1 con los genes CD74, EZR, SLC24A2 y FIG se dan especialmente en mujeres, jóvenes, no fumadoras y con adenocarcinoma. El panel de personas expertas concluye que en todos los pacientes con NSCLC de tipo adenocarcinoma se debe realizar el estudio de biomarcadores moleculares. No se alcanzó consenso respecto a los pacientes con tumores escamosos, aunque sí aceptaron que para aquellos con tumores adeno-escamosos o escamosos pero con INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 108 características clínicas de alto riesgo de presentar algunas de estas alteraciones, se podía tomar la decisión de realizar su estudio de forma individualizada. En cuanto a los biomarcadores que deberían estudiarse, se acepta que se deben incluir mutaciones EGFR, reordenamientos ALK y ROS1 y sobreexpresión PD-L1, bien de forma simultánea o secuencial según el criterio del oncólogo y dependiendo de las posibilidades económicas, pues se reconoce que el elevado coste del estudio supone una limitación en el acceso a estos tests. No obstante, se recomienda reali- zar este estudio genético por su relevancia clínica y porque en casos de progresión ofrece una alternativa terapéutica. Por el contrario, concluyen que no se debían incluir otros genes (BRAF, MET, RET, HER2 y KRAS) para los que no hay terapias dirigidas, y que sólo debían estu- diarse en caso de progresión tumoral tras haber estado sometido a tratamientos diri- gidos frente a EGFR, ALK o ROS1. Sí se admite la opción de incluir el estudio de ciertos genes a medida que se vayan desarrollando terapias dirigidas frente a ellos. Respecto al momento adecuado para realizar el test de biomarcadores molecu- lares, los expertos señalan que debe ser una decisión individualizada. Los momentos más habituales son 1) en el diagnóstico inicial, 2) en estadíos precoces del tumor o 3) cuando se dan recidivas o progresiones tumorales. En los estadíos precoces, en pacientes que se someten a cirugía, la toma de una muestra adecuada de biopsia es una buena opción por si sufre progresión tumoral con el tiempo. En el caso de pacientes que se someterán a resección radical, no sería obligatorio realizar estu- dio de biomarcadores. Para pacientes que sufren una recurrencia tardía, las perso- nas expertas recomiendan interpretar cuidadosamente muestras previas, pudiendo ser necesario repetir la biopsia. Para el estudio de reordenamientos ALK, se recomienda el uso de IHC con el anticuerpo D5F3, mientras que para los de ROS1 se recomienda FISH. En entor- nos con limitación de recursos, se puede emplear IHC como screening, seguido de FISH para confirmar los casos de resultado incierto o negativos en pacientes con alta probabilidad clínica. Además, se recomienda un tiempo de respuesta de ambas técnicas inferior a 7 días. El panel de personas expertas señala el papel crucial del personal de anatomía patológica en la fase preanalítica, en el almacenamiento y procesamiento de las muestras, dada la importancia que el aislamiento de DNA y la adecuada cantidad de carga tumoral tienen para el correcto resultado de los tests. La forma más habitual de conservar las muestras tumorales de biopsia es como FFPE. Consideran que el tiempo entre la obtención de la muestra y su fijación no debe exceder de 30 minu- tos, y que ésta debe realizarse entre 6-48 horas antes de su inclusión en parafina 109 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA para asegurar la adecuada preservación del DNA. Si se realiza una microdisección manual, se debe garantizar que al menos un 20-30% de tejido tumoral sea extraído para análisis molecular. También se insiste en que deben seguirse cuidadosamente los procedimientos operativos estándar de cada laboratorio para asegurar la mejor calidad de la muestra. 4.3. Estudios sobre los tratamientos agnósticos 4.3.1. Estudios estimativos de efectividad comparada Ya se han descrito las limitaciones de los ensayos clínicos realizados en huma- nos con inhibidores de NTRK, debido al número limitado de casos. Se han realizado algunas aproximaciones metodológicas para intentar comparar la efectividad del larotrectinib y el entrectinib, así como entre estos fármacos agnósticos y el trata- miento estándar. El objetivo de estos estudios fue superar las limitaciones de tras- ladar a la clínica los datos de los ensayos en cesta y facilitar la incorporación de estos fármacos a la práctica habitual. Algunas personas autoras (134) han realizado comparaciones indirectas entre los datos de series históricas de pacientes con tumores sólidos que recibieron trata- miento convencional en estados avanzados o metastásicos (sin información sobre la presencia o no de fusiones NTRK) sometidos al tratamiento convencional, frente a los datos agregados de los ensayos clínicos de larotrectinib. A pesar del número pequeño de pacientes, se observa que la ORR del larotrectinib es superior a los tratamientos históricos. Otras limitaciones que deben señalarse de este estudio son la ausencia de ajuste por variables demográficas o clínicas y que no se dispone de confirmación de fusiones NTRK en las series históricas. García-Foncillas y cols (135) han realizado un estudio con la metodología de comparación indirecta ajustada con emparejamiento (matching-adjusted indi- rect comparison, MAIC) entre larotrectinib y entrectinib en pacientes oncológicos con fusiones NTRK. Se identificó la población adulta tratada con uno u otro fármaco en los ensayos clínicos y el emparejamiento se basó en las variables que podían ser predictivas de algunos resultados como la edad, ECOG, fusiones NTRK, enfermedad metastásica, etc. Los resultados muestran que el larotrectinib se asocia a una mayor OS en comparación al entrectinib y que la DoR del larotrectinib es significativa- mente mayor (mediana de 32,5 vs 12,9 meses, respectivamente; p<0,05). La PFS del larotrectinib es mayor, aunque sin alcanzar significación estadística (mediana de 19,3 vs 11,2 meses; p=0,07). La ORR es similar para ambos fármacos (67,3% INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 110 vs 63,5%; p=0,63), aunque la CR es significativamente mayor con larotrectinib (20,3% vs 6,8%: p<0,05). Ambos fármacos han demostrado ser bien tolerados por las personas tratadas; la reducción de dosis e interrupción del tratamiento debido a los EA se ha dado en un 8% y 2%, respectivamente, de pacientes tratados con laro- trectinib, y en un 27% y 4%, respectivamente, de pacientes tratados con entrectinib (89,95). El MAIC ha ofrecido los siguientes resultados: EA serios ocasionados por larotrectinib del 6,2% y por entrectinib del 10%, y una interrupción del tratamiento en el 0,5% y 4% pacientes tratados con larotrectinib y entrectinib, respectivamente. Otros estudios (136-138) han realizado estudios de efectividad comparada intrapaciente entre los fármacos agnósticos y el tratamiento previo, teniendo como control al propio paciente, con el objetivo de poder realizar dichas comparaciones y la ventaja de no necesitar realizar ensayos clínicos, dada la limitación para reclu- tar una población adecuada para ese tipo de estudios. Para ello utilizaron el deno- minado GMI (growth modulation index). El GMI es una nueva medida de resul- tados, que puede utilizarse en ensayos de un solo brazo para realizar análisis de comparación intrapaciente. El GMI es el cociente entre la PFS con el nuevo fár- maco y el TTP (o fallo del tratamiento) con el tratamiento previo en la misma per- sona, de modo que permite estudiar el beneficio aportado por el nuevo fármaco en comparación al anterior. Se acepta un punto de corte para GMI de ≥1,33 que indi- caría que se produce un 33% de mejoría en la PFS en comparación al tratamiento previo y se considera que existe actividad clínica significativa (161). Otra ventaja del GMI es que se relaciona con la progresión del tumor, que puede ser más rele- vante como variable de resultado que la respuesta tumoral. El estudio publicado en 2020 por Italiano y cols (136) incluye un análisis exploratorio y retrospectivo de las bases de datos de los ensayos clínicos inicia- les con los que se había decidido la aprobación del larotrectinib por la FDA y EMA (NCT02122913; SCOUT (NCT02637687) y NAVIGATE (NCT02576431). Se comprueba que el larotrectinib mejora la PFS en la mayoría de pacientes con tumores positivos a fusiones NTRK en comparación a la terapia previa. Entre los 72 pacientes considerados para el análisis, el GMI mediano es de 2,68 (rango de 0,01-48,75), teniendo el 65% de pacientes un GMI ≥1,33 y el 26%, un GMI ≥5. El análisis de Kaplan-Meier estima un GMI mediano de 6,46; la PFS mediana para larotrectinib es mayor que el TTP mediano del tratamiento previo (no estimable [NE] vs 3,0 meses; hazard ratio [HR]: 0,220; IC 95%: 0,146-0,332). Entre pacien- tes con metástasis (n=53), el TTP mediano del tratamiento previo es de 4,4 meses (IC 95%: 2,8-6,1) y la PFS del larotrectinib es de 19,3 meses (IC 95%: 10,9-NE), con un HR de 0,228; IC 95%: 0,146-0,357. Un año más tarde, Hong y cols (137) publica los resultados de un nuevo aná- lisis de las bases de datos ampliadas de estos mismos ensayos clínicos, con un total 111 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA de 140 pacientes. El estudio de supervivencia de Kaplan-Meier estima un GMI mediano de 8,9 (IC 95%: 6,2-17,4). El 74% de estos pacientes presenta un GMI ≥1,33, el 5% presenta valores de GMI entre 1 y 1,33 y en el 21% de pacientes el GMI es <1. El TTP mediano con el tratamiento previo es de 3,0 meses (IC 95%: 2,1-3,5) y la PFS mediana con larotrectinib es de 33,0 meses (IC 95%: 16,6-34,9), con un HR: 0,22; IC 95%: 0,16-0,30. Las personas autoras concluyen que el estu- dio en un periodo de tiempo más largo permite observar que casi tres cuartas partes de pacientes tratados con larotrectinib tienen una PFS superior a la que se alcanza con el tratamiento previo más reciente, lo que lleva a validar el uso de este fármaco en pacientes con cáncer positivos a fusiones NTRK. Krebs y cols (138) publicaron en 2021 un estudio de comparaciones intrapa- ciente de la eficacia del entrectinib basado en los datos de 71 pacientes con tumo- res positivos a fusiones NTRK del ensayo STARTRK-2. Entre pacientes que habían progresado tras tratamiento (n=38), el GMI mediano es de 2,53, de quienes el 65,8% tienen un GMI ≥1,3. La ORR es de 60,5% para entrectinib vs 15,8% para el tra- tamiento previo, y la PFS mediana del entrectinib es superior a la del tratamiento previo (11,2 vs 2,9 meses). En ausencia de estudios comparativos directos o de meta-análisis entre ambos fármacos tumor-agnósticos en cáncer de pulmón, algunos autores (139) han uti- lizado un modelo de supervivencia particional para proyectar la efectividad com- parada a largo plazo del larotrectinib (n=12) frente a entrectinib (n=10) como tra- tamientos de segunda línea en pacientes con NSCLC metastásico. Tras 13 meses de seguimiento, se estima que el larotrectinib alcanza mejores resultados: en el caso base, la mediana de años de vida (LYs) pre-progresión es de 5,4 tras trata- miento con larotrectinib y de 1,2 con entrectinib; y la mediana de LYs totales es de 7,0 y 1,8, respectivamente. La media de LYs y años de vida ajustados por calidad (QALYs) pre-progresión es de 7,5 y 5,0, respectivamente, para larotrectinib y de 1,9 y 1,2 para entrectinib. La media de LYs y los QALYs totales son de 9,2 y 5,8, respectivamente, para larotrectinib y de 4,4 y 2,4 para entrectinib. Suh y cols (140) también utilizaron un modelo de supervivencia particional, con tres estados de salud mutuamente excluyentes: libre de progresión, progresión y muerte, para realizar un estudio comparativo entre la efectividad del larotrectinib vs entrectinib en CCR, SPB y metástasis cerebrales con fusiones NTRK. Con este modelo estimaron la PFS, la OS, los LYs y QALYs. La proporción de pacientes en cada estado de salud se determinó extrapolando las curvas de PFS y OS. A los LYs y QALYs obtenidos del modelo se les aplicó un descuento del 3%. Se hizo un aná- lisis de sensibilidad de una vía (one-way) para determinar la influencia de los pará- metros en el modelo y un análisis de sensibilidad probabilístico con 10.000 simula- ciones para obtener los intervalos de credibilidad al 95% (ICr 95%) alrededor del INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 112 estimador de LYs y QALYs. Se observan mejores resultados en salud en aquellos pacientes que habían recibido larotrectinib frente a pacientes tratados con entrec- tinib, aunque la magnitud del beneficio es diferente en función del tipo de tumor. Con larotrectinib se consiguen 1,58 LYs (1,17 QALYs), 5,81 LYs (2,02 QALYs) y 1,01 LYs en el CCR, SPB y metástasis cerebrales. Por todo ello, las personas auto- ras concluyen que en el caso de pacientes que sólo tienen una oportunidad para elegir un TKI, se debería optar por el larotrectinib para maximizar los resultados en salud, en años de vida ganados. Esta decisión es particularmente relevante en pacientes con metástasis cerebrales porque su pronóstico es peor. Estos mismos autores también han publicado en 2022 otro estudio (141) de efectividad comparada a largo plazo entre larotrectinib y la terapia estándar en población adulta con tumores metastásicos de CDT, CCR y SPB positivos a genes NTRK de fusión, utilizando la misma metodología de modelo de supervivencia particional. Se realiza una actualización de datos a julio de 2020 en 19 pacientes con CDT, 8 pacientes con CCR y 23 con SPB. Pacientes tratados con larotrectinib presentan una mayor supervivencia y QALYs en comparación a los pacientes que habían recibido el tratamiento estándar (datos tomados de la literatura publicada). Pacientes con CDT, tratados con larotrectinib muestran una media de LYs totales de 12,62 (ICr 95%: 5,19-16,12) y una media de QALYs totales de 9,05 (ICr 95%: 4,26-12,17). En comparación al tratamiento con lenvatinib, el larotrectinib consi- gue 8,26 LYs adicionales y 6,12 QALYs adicionales; y en comparación al sorafe- nib, de 7,15 y 5,87, respectivamente. Los resultados con larotrectinib en pacien- tes con CCR son los siguientes: unos LYs totales de 2,11 (ICr 95%: 0,84-5,10) y QALYs totales de 1,60 (ICr 95%: 0,71-3,60). En comparación al regorafenib, el larotrectinib incrementa a 1,26 LYs y 1,00 QALYs y en comparación a trifluridine/ tipiracil, 1,27 LYs y 1,00 QALYs. En pacientes con SPB, la media de LYs totales es de 7,07 (ICr 95%: 3,31-12,34) y la media de QALYs totales es de 2,59 (ICr 95%: 1,45-4,25); lo que supone 5,56 LYs y 1,99 QALYs adicionales en comparación a los tratamientos convencionales. Las personas autoras reconocen las limitaciones metodológicas del análisis realizado además del escaso número de pacientes consi- derados, y destacan la necesidad de realizar estudios comparativos entre el larotrec- tinib y el tratamiento habitual y que se debe incluir un seguimiento a largo plazo. Ante la ausencia de estudios comparativos directos de tratamientos en NSCLC positivos a fusiones ROS1 y ALK, Chu y cols (142) publicaron un estudio de comparaciones indirectas ajustadas por emparejamiento, utilizando un propensity score, entre entrectinib y crizotinib en pacientes con NSCLC positivos a fusiones ROS1 y ALK. Para ello, realizaron dos revisiones sistemáticas: una sobre pacien- tes con NSCLC y fusiones ROS1 (búsqueda de literatura hasta marzo de 2019, de la que se seleccionaron 11 ensayos no comparativos y estudios observacionales de 38 referencias) y otra revisión sobre NSCLC positivo a ALK (búsqueda de literatura 113 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA hasta octubre de 2018, de la que fueron seleccionados 8 estudios en 20 referencias). El análisis ha permitido demostrar que el entrectinib presenta respuestas signifi- cativamente mejores, con una ORR significativamente superior a la del crizotinib, que oscila entre 2,43 y 2,74 en tres escenarios diferentes analizados. También el entrectinib se asocia a supervivencia más prolongada, la HR sugiere que el entrec- tinib reduce el riesgo de muerte en comparación al crizotinib, con resultados de HR que oscilan entre 0,47 y 0,61 en los tres escenarios contemplados de presencia de metástasis cerebrales. También la HR alcanzada con entrectinib es superior a la de los otros fármacos estudiados (pemetrexed con platino seguido de pemetrexed de mantenimiento). En cuanto a la necesidad de interrumpir el tratamiento por EA, es menor con entrectinib que con crizotinib (los valores de OR oscilan entre 0,79 y 0,90, aunque estas estimaciones se consideran inciertas pues los IC 95% de las OR eran muy anchos) y también es menor que con QT, aunque en este caso sin alcan- zar significación estadística. En resumen, el entrectinib permite mayores respuestas tumorales y un incremento en la OS en comparación a los demás fármacos, por lo que las personas autoras consideran que sería la alternativa terapéutica más reco- mendada para pacientes con NSCLC positivos a fusiones ROS1, incluyendo aque- llos con metástasis cerebrales en los que sería la mejor opción por su capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica. 4.3.2. Revisiones sistemáticas En 2020, Chu y cols (143) publicaron una revisión sistemática y meta-análisis sobre efectividad clínica y evidencia económica de los inhibidores multiquinasa TRK e inhibidores TRK selectivos (entrectinib y larotrectinib), y sobre la calidad de vida de pacientes con tumores positivos a fusiones NTRK tratados con estos fár- macos. La búsqueda de la literatura se realizó en octubre de 2018 (para recuperar artículos sobre evaluación clínica, económica y de calidad de vida) y se amplió en enero de 2019 (para artículos de costes o uso de recursos). Se escrutaron Medline, Medline Epub Ahead of Print, Embase y EBM Reviews, además de abstracts de congresos de los 3 años anteriores a la fecha de búsqueda, listados de referencias de las publicaciones incluidas, informes de ETS y registros de ensayos clínicos. Se seleccionaron tanto TKIs como los inhibidores selectivos entrectinib y larotrectinib. Tras el proceso de selección de estudios, finalmente incluyeron 27 de efectividad clínica. No se localizaron estudios de evaluación económica ni de calidad de vida. Los 27 estudios clínicos eran ensayos de un solo brazo, 14 de ellos sobre larotrec- tinib (de 4 ensayos clínicos), y 7 sobre entrectinib (de otros 4 ensayos clínicos). La eficacia clínica y seguridad sólo se encontró disponible para larotrectinib, entrecti- nib y ropotrectinib. Chu y cols (143) intentaron realizar un meta-análisis de com- paraciones indirectas para estimar la efectividad de los diferentes fármacos, pero INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 114 resultó imposible por la heterogeneidad entre las poblaciones incluidas y el escaso número de pacientes, que tampoco permitió estratificar los resultados por tipo de tumor. Además, las personas autoras señalan el reto que suponía realizar análisis robustos en este entorno tumor-agnóstico con el fin de comparar la efectividad de estos fármacos dirigidos frente a la terapia estándar. Aunque la evidencia encon- trada sugiere que ambos fármacos son efectivos, se pone de relieve algunos aspec- tos a considerar, como el desarrollo de resistencia adquirida a dichos fármacos, o la dificultad para determinar el fármaco gold standard con el que comparar la nueva terapia, pues en el caso de tratamientos tumor-agnósticos existen múltiples terapias estándar disponibles dependiendo del origen del tumor; además, habitualmente se aceptan como variables de respuesta la OS y PFS, pero es posible que ninguna de ellas esté disponible en estos estudios. El análisis conjunto de los artículos sobre efectividad clínica del larotrecti- nib (n=55 pacientes) muestra una ORR de 75% (IC 95%: 61-85) y después de un año, el 55% de pacientes se mantiene libre de progresión de la enfermedad y el 90% están vivos. Los EA más frecuentes (93%) son de grados 1/2 y los de grados 3/4 no se relacionan con el fármaco. Los EA llevaron a una reducción de dosis en el 15% de pacientes y en ningún paciente ha sido necesario suspender la medicación. La ORR para los estudios de entrectinib (n=54 pacientes), tras 15,5 meses de seguimiento, es del 57,4% (IC 95%: 43,2-70,8) y se informa de una CR en el 7,4%. La mediana de DoR es de 10,4 meses (IC 95%: 7,1-NE) y la mediana de OS de 20,9 meses (IC 95%: 14,9-NE). La mediana de PFS global es de 11,2 meses (IC 95%: 8,0-14,9), mayor que en pacientes con metástasis en SNS (7,7 meses [IC 95%: 4,7-NE]). En cuanto a seguridad, los EA surgidos son de grados 1/2 y rever- sibles; los EA relacionados con el tratamiento llevan a una reducción de dosis en el 27,3%, a la interrupción de dosis en el 25,4% y es necesario finalizar el trata- miento en 3,9% de pacientes. 4.3.2. Guías de evaluación de tecnología, de NICE En el año 2020, NICE publicó tres Technology appraisal guidances, dos sobre larotrectinib y entrectinib para el tratamiento de tumores sólidos positivos a fusiones NTRK (144,145) y una tercera sobre el entrectinib para el tratamiento de pacientes con NSCLC avanzado positivo a ROS1 (146). En la guía para estudiar el larotrectinib (144), las personas autoras reconocen la efectividad de este fármaco en estos tumores con fusiones del gen NTRK, aunque señalan la ausencia de comparaciones con otros fármacos en los ensayos clínicos. 115 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA También señalan que sólo se ha demostrado su efectividad para determinados tipos de tumores con fusiones NTRK pero no para otros. Por último, consideran que las estimaciones de coste-efectividad para larotrectinib son muy inciertas porque los datos estudiados proceden de poblaciones diferentes a las que se presentan en la práctica clínica en el National Health System (NHS) y, además, porque existe gran incertidumbre sobre la supervivencia a largo plazo cuando la enfermedad progresa. El larotrectinib podría ser un recurso potencialmente coste-efectivo en el NHS con el coste que presentaba en el momento de realizar el estudio, y por ello recomien- dan su utilización a través del Cancer Drugs Fund mientras se dispone de nuevos datos para recomendarlo para la práctica rutinaria. Por otro lado, en esta guía se señala que no existe evidencia sobre si la presen- cia de las fusiones NTRK supone un pronóstico diferente en comparación al pro- nóstico de tumores sin estas alteraciones. La evidencia clínica recogida para esta guía procede de poblaciones con dife- rentes tipos de tumores que habían sido sometidos a diferentes tratamientos previos; la mayoría, a terapias sistémicas, pero otros a ningún tratamiento previo. Además, recuerdan que todos los tumores sólidos pueden tener, potencialmente, fusiones NTRK, aunque estas alteraciones no son habituales en los tumores más frecuentes, por lo que sería necesario un screening en muchas personas para identificar a pocos pacientes que se beneficiarían del tratamiento con larotrectinib. Cuando se realiza este informe, en el NHS no se realizaban tests para estu- diar las fusiones NTRK de forma rutinaria para todos los tumores sólidos, pero sí para los carcinomas secretores de mama y los análogos de mama, y este screening se realizaba mediante técnicas de IHC. La secuenciación del genoma completo sí estaba disponible para población pediátrica con cáncer y sarcomas aunque para la confirmación del resultado es necesario un test DNA o RNA, por ejemplo, la NGS. Se señala que la Sp del test para identificar la presencia de las fusiones NTRK debe ser muy alta para descartar su presencia y concluir que pacientes no se iban a beneficiar del tratamiento con larotrectinib. Esto es especialmente importante en tumores muy frecuentes en los que las fusiones NTRK tienen baja prevalencia, donde el número de resultados FP podría superar los VP si el test no es lo suficien- temente específico. Recogen la opinión de personal clínico experto que conside- raban que la NGS-DNA y NGS-RNA con un test confirmatorio de DNA o RNA o un estudio IHC cuando el resultado es positivo, sería adecuado y minimizaría el número de resultados FP. Además, realizan un análisis agregado de tres ensayos clínicos (NAVIGATE, SCOUT y LOXO-TRK-14001), de un solo brazo, sin grupo control y con un total INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 116 de 102 pacientes (9 con tumores del SNC y 93 con otros tumores). Señalan el sesgo de selección de pacientes de estos ensayos, cuya distribución por tipos de tumor no es representativa de la distribución en la práctica clínica del NHS, con un número muy alto de tumores con alta prevalencia de fusiones NTRK, probablemente con un bajo número de resultados FP. Debido a este sesgo de selección de pacientes y los tipos de tumores detectados y a la falta de datos respecto a los tratamientos recibi- dos, se considera que la evidencia clínica no es generalizable a la población aten- dida por el NHS y que son necesarios más datos, especialmente sobre los tipos de tumor y la distribución de pacientes. La falta de datos lleva a las personas autoras de este informe NICE a conside- rar que no es posible estimar de forma fiable el beneficio del larotrectinib a largo plazo. Otra limitación señalada se refiere a la ausencia de evidencia respecto a si la respuesta al larotrectinib es similar en todos los tipos de tumores o si algún tipo de tumor podría no responder al fármaco. Además, el tipo histológico del tumor puede afectar al tipo de fusión NTRK e implicar la presencia de otras mutaciones. Se informa de una baja tasa de respuesta si la fusión era en NTRK2 mientras que alcanzaba el 82% si se trataba de NTRK3. Por otro lado, se informa de una tasa de respuesta diferente en función del par de fusión. La fusión más frecuente es la ETV6-NTRK3, con una respuesta global del 84%, superior a las demás, aunque no se ha constatado que esta respuesta sea similar para los diferentes tipos de tumores, por lo que se concluye que no es apropiado asumir que la respuesta va a ser simi- lar en todos los casos. También se señala que la respuesta de los tumores del SNC al larotrectinib es muy inferior a la respuesta de otros tipos de tumores. Para eva- luar la respuesta de estos tumores se emplean los criterios RANO (response assess- ment in neuro-oncology), en vez de utilizar los criterios RECIST, pero la cirugía y radioterapia (RT) pueden ocasionar cicatrices e inflamación local que dificultan la evaluación mediante dichos criterios. Esto podría explicar la baja tasa de respuesta en comparación a la de otros tumores. Otras posibles causas de la baja respuesta de estos tumores del SNC podrían asociarse a una baja dosis de larotrectinib que alcanza al SNC, a que los tumores primarios del SNC respondan menos al fármaco o a la alta proporción de fusiones en el gen NTRK2 presentes en estos tumores. Adicionalmente, señalan los siguientes motivos por los que dichos estudios no se deben generalizar a la población atendida por el NHS: la sobre-representación de tumores raros y con alta prevalencia de fusiones NTRK que se asocia a mayor respuesta al fármaco, la supervivencia estimada se refiere a los tipos de tumor con mayor tasa de respuesta y algunos tipos de tumores están sobre-representados en el cálculo de los valores de utilidad, lo que implica mayor incertidumbre en las estimaciones de coste-efectividad y todos los modelos utilizaban análisis agrega- dos no-ajustados que no pueden modelizar una población generalizable a la prác- tica clínica del NHS. 117 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA En uno de los ensayos considerados (SCOUT), se analizaba población infan- til con tumores que son potencialmente curables, pero se incluyeron en una pro- porción muy superior a la observada en la práctica clínica y, además, señalaron otras limitaciones al análisis de supervivencia y de curación de pacientes como un periodo muy corto de seguimiento, la ausencia de análisis con un brazo control, el escaso número de pacientes y la elevada censura de datos, lo que resultaban en un modelo fuertemente sesgado en favor del larotrectinib y, por ello, en una marcada incertidumbre respecto a la curación de pacientes. En los ensayos analizados en este informe de NICE, los datos de PFS y OS son incompletos. También se considera que la evidencia de los valores de utilidad post-progresión del larotrectinib es débil, basada en la evaluación de un escaso número de pacientes, la mayoría población pediátrica. Se considera que el larotrec- tinib cumplía los criterios NICE para ser considerado un tratamiento que alarga la vida al final de la vida, pero se reconoce la incertidumbre en su definición, que los datos existentes son escasos y analizados a muy corto plazo, y que existe hetero- geneidad entre los diferentes tipos de tumores. En esta guía se hace referencia a un ratio de coste-efectividad incremental (ICER) de £16,155 por QALY ganado con el larotrectinib en comparación a la práctica clínica. En cuanto a los tests diagnósticos para detección de fusiones NTRK, se sugiere que la IHC debería ir seguida de NGS para confirmar los resultados positivos. La NGS es necesaria para establecer que una persona es o no candidata a larotrecti- nib. Las personas autoras mencionan que el NHS se encontraba en un momento de cambio hacia la implementación de la NGS para enfermedades localmente avanza- das o metastásicas y estiman que en uno o dos años, el NHS dispondría de suficien- tes laboratorios a pleno rendimiento donde realizar la NGS a pacientes con tumor sólido localmente avanzado o metastásico. Por toda la incertidumbre existente, se concluye que el larotrectinib no se puede recomendar para uso rutinario y que se necesitan nuevos ensayos para analizar a más largo plazo la supervivencia asociada a este fármaco e incluir pacientes adi- cionales con tumores sólidos de otros sitios no incluidos en ensayos previos, que permitan aportar más datos para resolver dicha incertidumbre, analizar la hetero- geneidad en la respuesta, así como su seguridad y eficacia. Se reconoce la incertidumbre clínica respecto a la población, a la modeliza- ción de los tratamientos de comparación, la estimación de supervivencia y los valo- res de utilidad. Sin embargo, se considera que los datos de los ensayos son prome- tedores con buenas tasas de respuesta y que el larotrectinib podría mejorar la OS INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 118 y la PFS. Además, que posiblemente sea coste-efectivo, aunque esto debe confir- marse con nuevos datos. En agosto de 2020, NICE publica un documento sobre el entrectinib para el tratamiento de tumores sólidos positivos a fusiones NTRK (145). Este trabajo reconoce que estos tumores responden al entrectinib (disminuye el tamaño tumo- ral) pero que su efectividad frente a otros fármacos no se ha comparado en ensa- yos clínicos, que se había observado su efectividad para algunos tipos de fusiones NTRK pero no había evidencia de si también lo era para otros tipos. Se reconoce la falta de datos de seguimiento a largo plazo y la incertidumbre en cuanto a su posi- ble coste-efectividad por la escasez de datos económicos. Por ello, se concluye que no se puede recomendar el uso de entrectinib en la práctica rutinaria en el NHS. También en la misma fecha, NICE publica otro documento de evaluación sobre entrectinib en NSCLC positivos a fusiones ROS1 (146). Las recomendaciones sur- gieron de un estudio pequeño (STARTRK-2) con una mayoría de pacientes que habían recibido tratamiento previo y donde no se comparaba al entrectinib con otros fármacos. El comité de evaluación considera que el subgrupo de pacientes positivos a ROS1 de este estudio es representativo de la práctica clínica del NHS. La eviden- cia sugiere que el entrectinib resulta efectivo para reducir el tamaño tumoral (alta tasa de respuesta global) y para enlentecer la progresión de la enfermedad. También se informa de una alta tasa de respuesta global para metástasis intracraneales. En otros dos estudios (ASCEND-4 y PROFILE 1014) se observó que entrectinib era clínicamente efectivo, pudiendo alargar la vida más de 3 meses en comparación a pemetrexed y QT con platino. Además, se considera como coste-efectivo pues el coste-efectividad estimado para el entrectinib estaba dentro del rango que NICE considera como uso aceptable de recursos del NHS para «tratamientos al final de la vida», por debajo de £50,000 por QALY ganado. Por todo ello, la conclusión es recomendar el uso de entrectinib como tratamiento de pacientes con NSCLC posi- tivos a fusiones ROS1. 4.3.4. Documentos de consenso En el documento anteriormente mencionado de las recomendaciones de la JSCO, JSMO, ESMO, ASCO y TOS (84), en lo referente a las preguntas relacio- nadas con el tratamiento, las personas expertas consideran que los TKIs son alta- mente recomendables en pacientes con fusiones NTRK y que deben utilizarse cuando no existen otras opciones alternativas satisfactorias (grado de acuerdo del 100% y grado de recomendación A para ambas recomendaciones). 119 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 4.4. Estudios económicos 4.4.1. Informe de Scottish Medicine Consortium En el informe realizado por el Scottish Medicine Consortium (SMC) para el NHS de Escocia se recoge la autorización de uso del entrectinib en población adulta o pediátrica de ≥12 años con tumores sólidos positivos a fusiones NTRK que no hubieran recibido tratamiento con inhibidores NTRK o no tuvieran otras opcio- nes terapéuticas satisfactorias. El requisito previo a su administración, es disponer de una prueba validada para identificar las fusiones NTRK y así poder seleccionar a pacientes candidatos al tratamiento. En este informe se presenta el análisis de coste-utilidad realizado por Roche que comparaba el uso de entrectinib con el mejor tratamiento de soporte (BSC, best supportive care) (148) (147). Se utilizó un modelo de supervivencia particionado con tres estados de salud (pre-progresión, progre- sión y muerte) y se adoptó un horizonte temporal de 30 años. Para las estimacio- nes clínicas se tomaron los datos agregados de los estudios ALKA, STARTRK-1 y STARTRK-2, y STARTRK-NG en población pediátrica. Se encontró una PFS media y OS media para entrectinib de 15,96 meses y 33,12 meses, respectivamente, y para el BSC de 3,59 meses y 16 meses, respectivamente. Los costes incluyeron aquellos relacionados con la adquisición y administración de los fármacos, el tratamiento de EA y los cuidados terminales. Los costes del diagnóstico de fusiones NTRK se basaron en la estimación del número necesario a cribar para identificar pacientes candidatos al tratamiento. Generalmente, el cribado se realizaba con IHQ seguido de NGS como prueba de confirmación. También el coste de los tests diagnósticos se asignó a pacientes tratados con BCS basados en el uso estándar de IHQ. Se estimó una media ponderada de coste del diagnóstico por paciente elegible, basada en la proporción de pacientes con cada tipo de tumor para los estudios de entrectinib. Para el caso base se estimó un ICER de £37,398/QALY. Tanto a los costes como a los QALYs se les aplicó una tasa de descuento del 3,5%. El análisis de sensibili- dad de una vía de entrectinib versus BSC fue más sensible a la variación de ±20% en los valores de utilidad de PFS, costes de diagnóstico de la enfermedad y OS. El ICER estimado inferior (£26,498) correspondía a un escenario donde se excluían los tests diagnósticos para ambas ramas, y el ICER superior (£59,906) se observó en el caso de incluir los tests diagnósticos sólo en la rama del entrectinib. Respecto al posible impacto presupuestario, se estimó que podría haber un número total de 47 nuevos pacientes al año con tumores avanzados o metastási- cos positivos a fusiones NTRK en Escocia. De ellos, se estimó que sólo 22 serían candidatos a terapia dirigida con entrectinib en el primer año y que ascendería a 30 pacientes a los 5 años. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 120 4.4.2. Informe de ETS del Norwegian Institute of Public Health (NIPH) El objetivo final del informe de ETS elaborado por NIPH (79) fue establecer el tratamiento agnóstico más adecuado y estudiar los resultados en salud de pacien- tes. Ningún estudio encontrado para este informe analizaba la utilidad clínica de los tests, por ello, se estimaron los costes asociados a las técnicas diagnósticas en el ámbito noruego utilizando un modelo de micro-costes. Los costes relevan- tes fueron expresados en coronas noruegas, en 2021. Se estimó que, al año, entre 10.000-11.100 pacientes con tumores sólidos en estadio avanzado podrían ser elegi- bles para estudio de fusiones NTRK y de ellos, unos 520 podrían presentar fusiones NTRK con alta prevalencia. Se consultó con varios centros hospitalarios los costes directos, que incluían consumibles y los costes asociados al personal sanitario. Se estimaron los costes de IHQ, de FISH y de un panel de NGS que pudiera detectar los tres genes NTRK, ROS1, ALK y RET. No se incluyeron datos sobre RT-PCR porque, según los expertos consultados, esta prueba no se utilizaba en Noruega para estudiar estos genes. También estas mismas personas expertas consideraron que la realización de los tests de forma simultánea en muestras de varios pacientes podía ahorrar recursos y, por tanto, reducir los costes asociados a dichos tests. En este informe se presentan resultados de costes para 1 paciente y para 10 pacientes, para cada una de las tres técnicas. Para IHQ y FISH los costes son los de estudiar un solo biomarcador, pero lo habitual es tener que hacer tests sucesivos en los que se estudie un gen diferente cada vez, lo que implica más tiempo de estudio y dis- poner de suficiente muestra para cada test, que no siempre es factible. Además, se señala que la presencia de genes de fusión NTRK puede no ser la única mutación oncogénica driver y que algunas personas puedan ser candidatas a más de una tera- pia dirigida al mismo tiempo. Se consideraron dos escenarios, ambos en pacientes con NSCLC avanzado. En uno de esos escenarios, se presentan los costes de los diferentes métodos para detectar ROS1 y NTRK y en el segundo, para ROS1, NTRK y ALK. Los costes de NGS se estimaron para el panel Oncomine Focus que permite estudiar hasta 6 bio- marcadores de forma simultánea. Este estudio muestra que la NGS es, probablemente, la prueba de mayor coste si se utiliza en una sola persona enferma, debido a los costes de los reactivos. Sin embargo, como esta técnica permite realizar una secuenciación masiva en para- lelo de varios biomarcadores y para varios pacientes de forma simultánea, los cos- tes se reducen significativamente. Se estima que la NGS suponía un coste de unas 16.000 coronas noruegas por muestra, pero cuando esta prueba se realiza para estu- diar varios genes y varias muestras (de NTRK, ROS1, RET y ALK en pacientes con 121 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA NSCLC) los costes se reducen a unas 2.000 coronas por paciente. A pesar de esto, se reconoce que, por el momento, la NGS sigue siendo la técnica de mayor coste en comparación a las otras tres. Al estimar unos 520 pacientes anuales candidatos para estudio de fusiones NTRK en tumores con alta prevalencia de estas fusiones, los costes anuales ascen- derían a unos 1,2 millones de coronas. En tumores con baja frecuencia de estas fusiones NTRK, se debería utilizar primero IHQ y después NGS-RNA de confirma- ción, y el coste estimado oscilaría entre 16,1-18,0 millones de coronas. Dado que los costes dependen en gran medida del número de pacientes que vayan a ser estudiados y que el análisis de una sola alteración genética resulta total- mente ineficiente, se señala que en la estimación de costes para identificar fusio- nes NTRK con NGS, se debe tener en cuenta que el estudio no se va a realizar de forma aislada, sino analizando muchas alteraciones simultáneamente. Y para fina- lizar, indican que se preve la inclusión de la NGS como parte del proceso diagnós- tico de rutina de ciertos tumores, como el NSCLC. 4.4.3. Estudios originales sobre costes de las pruebas diagnósticas y tratamientos agnósticos Entre las publicaciones primarias, cabe mencionar el estudio de Marino y cols (149), realizado en Francia, sobre el coste asociado al uso en la práctica clínica de paneles dirigidos de NGS en el diagnóstico de cáncer. Se recogieron datos de 15 labo- ratorios de referencia en genética molecular, y se calculó el coste medio total de la NGS por paciente. Este coste fue estimado mediante un método de micro-costes con los recursos consumidos recogidos in situ en cada laboratorio, desde la pers- pectiva de proveedores en salud. También se consideraron los costes de otros pasos post-secuenciación como los del análisis bioinformático, la validación técnica, la validación biológica y otros costes adicionales no-específicos. El coste total de los paneles dirigidos de NGS para diagnóstico de tumores genéticos somáticos (datos de 7 laboratorios) osciló entre 376 € a 968 € por paciente, siendo el coste medio total de 607 € (± 207). Estos mismos resultados para tumores genéticos germinales (de 8 laboratorios) osciló entre 322 € y 727 €, con un coste medio total de 550 € (± 140). La generación de las librerías de DNA resultó ser el paso que consume el mayor coste y también el que conlleva más tiempo de trabajo. Los costes más elevados en el proceso de secuenciación fueron los relativos a los consumibles, que supusieron el 48% del coste en los tumores somáticos y 41% en INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 122 los germinales, y en segundo lugar, los costes adicionales que supusieron el 30% y 32%, respectivamente, del coste total. Se señala que era esperable que los costes de consumibles, de validación técnica y los costes adicionales, se vean reducidos con el tiempo, mientras que los costes más relevantes serán los relacionados con el aná- lisis bioinformático de los resultados y no los de su generación mediante la NGS. El análisis de sensibilidad permitió observar que una reducción del 25% de los consumibles conducía a un descenso del 15% en el coste total de la NGS en los tumores somáticos y del 13% en los germinales. Por el contrario, otros costes, como los de compra de los equipos, no modificaban los costes totales. En 2019 Pages y cols (150) publicaron un estudio prospectivo sobre el coste de la terapia oncológica dirigida basada en los resultados del diagnóstico molecu- lar a partir de los datos del ensayo MOSCATO (Molecular Screening for Cancer Treatment and Optimization). El estudio analiza 529 pacientes y el diagnóstico molecular incluye varias etapas, desde la biopsia del tumor al trabajo del comité de tumores multidisciplinar. Se hizo un análisis de micro-costes incluyendo los costes directos desde la inclusión del paciente hasta la progresión, desde la pers- pectiva del French National Health Insurance. La NGS se realizó utilizando el IonTorrente (Life Technologies); las librerías se generaron utilizando Ion AmpliSeq Library kit 2.0. El coste total del diagnóstico molecular fue de 2.396 €. Se encon- traron 220 (42%) pacientes con blancos intervenibles, 105 (20%) fueron tratados con terapia dirigida. El coste de esta terapia basada en el estudio molecular fue de 31.269 € por paciente. Sólo un 6% del coste se imputa al diagnóstico mientras que los fármacos antitumorales suponen el 54% del total y las hospitalizaciones, el 35%. Beresford y cols (151) analizaron los elementos clave que deben considerarse cuando se evalúan los costes de los tests genómicos para identificar a pacientes can- didatos a ser estudiados mediante tecnologías histología-independientes (HI) en un entorno de evaluación de tecnologías sanitarias. Estas técnicas diagnósticas se uti- lizan en tumores malignos avanzados o metastásicos que expresan biomarcadores agnósticos. El hecho de identificar a estos tumores conlleva importantes repercu- siones en el coste-efectividad de la tecnología. El coste de los tests para identificar a personas candidatas a tecnologías HI afecta al coste-efectividad del tratamiento. De hecho, la identificación de estas personas supone un reto considerable pues de su presencia depende la administración posterior del tratamiento. Las pruebas para estudiar la presencia o no de los biomarcadores deben realizarse en pacientes con tumores sólidos avanzados o metastásicos (144,145). Por este motivo, consideran imprescindible que el uso de estos tests se extienda y, al mismo tiempo, que se incre- mente la inversión en los centros diagnósticos que llevan a cabo dichos tests. En el caso de tumores con fusiones NTRK, consideran que los elementos clave a tener en cuenta en la evaluación de los costes de las tecnologías HI son los siguientes: las 123 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA diferencias en la prevalencia del biomarcador, el tipo de test, las estrategias diag- nósticas adoptadas, la disponibilidad de los tests y la línea de tratamiento en la que se decide realizar el test. En este estudio, se estima que el coste de una NGS-RNA para identificar a 1 individuo con fusiones NTRK oscila entre £377 y £282,258. Este coste fue calculado a partir del número necesario a cribar (NNS) que es el inverso del producto de la sensibilidad por la prevalencia de las fusiones NTRK, y asumiendo que el coste de una NGS basada en RNA es de £350 (coste obtenido de un centro de genómica de UK). El NNS para NGS-RNA y para IHQ oscila entre 1,1 y 1,2 del carcinoma secretor de mama a 806,5 y 917,5 del NSCLC, respectiva- mente. Se estima que para la estrategia diagnóstica propuesta por ESMO (screening con IHQ y confirmación de los casos positivos con NGS), el coste de identificar a 1 individuo positivo a fusiones NTRK oscila entre £540 del carcinoma secretor de mama y £198.585 del NSCLC. Dado que la prevalencia de las fusiones NTRK varía considerablemente (de <0,1% a >90%) según el tipo de tumor, los costes para iden- tificar pacientes con estas alteraciones, también varían de forma significativa. Por este motivo, de cara a tomar decisiones en cuanto a reembolso, una opción podría ser priorizar la realización de los tests en aquellos tumores con alta prevalencia de dichas alteraciones o aquellos que pudieran beneficiarse más del tratamiento. Puesto que los paneles de genes de NGS permiten identificar un alto número de alteraciones genéticas en un solo test, será posible identificar pacientes candidatos a diferentes terapias dirigidas compartiendo costes al realizar una sola prueba, contribuyendo de esta manera a mejorar el coste-efectividad de los tests genómicos y pruebas HI. En 2022, se ha publicado un estudio de coste-efectividad (152) del larotrec- tinib frente al comparador tratamiento estándar que incluía múltiples tipos de trata- mientos. Los principales resultados son un incremento de 5,61 QALYs e incremento de 7,48 años de vida, un coste incremental de 232.260 €, lo que genera un ICER de 41.424 €/QALY (sustancialmente por debajo del punto de corte de 80.000 €/QALY considerado en Los Países Bajos para patologías con alta carga de enfermedad). El análisis probabilístico indica que el larotrectinib es coste-efectivo frente al compara- dor en el 88% de las iteraciones. Este análisis de coste-efectividad permite concluir que el tratamiento de estos pacientes con larotrectinib ofrece unos resultados muy ventajosos, tanto en la mejora en años de vida ganados como en calidad de vida. Este estudio no incluyó los costes asociados de los tests para determinar NTRK. Otro estudio de coste-efectividad se ha realizado para comparar el entrectinib frente al tratamiento estándar en pacientes oncológicos, en Países Bajos (153). Se comparó una estrategia en la que se realizaban tests para determinar la presencia de fusiones NTRK y posterior tratamiento con entrectinib en los positivos y tratamiento estándar para los negativos a dichas fusiones frente a la estrategia de no realizar test para fusiones NTRK y administrar el tratamiento estándar a todos los pacien- tes. Las personas autoras utilizaron un modelo de árbol de decisión (para reflejar INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 124 la fase de diagnóstico) y de microsimulación (para reflejar el tratamiento). Se rea- lizó el estudio desde la perspectiva social de Holanda y se utilizaron unas tasas de descuento para los efectos del 1,5% y del 4% para los costes. Los tests realizados fueron IHQ y/o NGS-RNA. El análisis del caso base ofrece los siguientes resulta- dos: el diagnóstico de fusiones NTRK y tratamiento con entrectinib de pacientes positivos y con terapia estándar de los negativos se asocia a una ganancia de QALY de 0,0043 con un incremento en costes de 732 € por paciente en comparación a la segunda estrategia de no hacer tests y aplicar tratamiento estándar a todos. El ICER resultante es de 169.957 €/QALY y el beneficio monetario neto incremental es de -388 €. Si se excluyen del análisis tanto los costes como los efectos en salud asociados al test de NTRK, el ICER se reduce a 38.563 €/QALY. Esta diferencia tan grande se debe a la baja prevalencia de las fusiones NTRK en general, lo que supone que un elevado número de pacientes se somete a los tests pero tan sólo un porcentaje muy pequeño (0,29%) de pacientes resultan positivos al test y después reciben el entrectinib. Se concluye que con la evidencia disponible, el entrectinib no resulta coste-efectivo en comparación al tratamiento estándar, pero que si los tests genéticos para identificar a pacientes candidatos a este fármaco se incluyeran en la práctica clínica habitual (como era el caso con el larotrectinib) entonces, el entrectinib podría ser coste-efectivo. 125 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 5. Discusión 5.1. En relación al diagnóstico de biomarcadores de fusión El estudio de las características genéticas y moleculares de los tumores ha supuesto un cambio significativo en el manejo terapéutico de personas con pato- logía oncológica, convirtiéndose en uno de los pilares de la denominada medicina de precisión. La disponibilidad de tratamientos agnósticos efectivos, con un claro beneficio clínico y con un buen perfil de tolerabilidad, para los tumores con fusio- nes de NTRK, ALK, ROS1 y RET, ha llevado a que la identificación de estos bio- marcadores sea una necesidad asistencial. Es imprescindible la correcta selección de pacientes que pueden beneficiarse de estos fármacos para conseguir la mayor efi- ciencia de los tratamientos, al tiempo que se garantice la sostenibilidad del sistema sanitario. Por esto, las estrategias utilizadas cumplen una doble finalidad, diagnós- tica y terapéutica, pues la identificación de los biomarcadores agnósticos de fusión se realizaría con la finalidad de apoyar la toma de decisiones informadas respecto al uso de fármacos dirigidos frente a las dianas biológicas presentes en cada caso. En este informe se ha realizado una revisión de las principales propuestas de algoritmos diagnósticos, guías y recomendaciones de diferentes sociedades cien- tíficas o grupos de interés implicados, de diferentes países y contextos sanitarios, sobre el uso de las pruebas diagnósticas IHQ, FISH, RT-PCR y NGS para el scree- ning los biomarcadores predictivos de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET, con el fin de realizar una correcta selección de pacientes candidatos a los tratamientos perso- nalizados más adecuados. Además, se han revisado estudios estimativos de efecti- vidad comparada entre los fármacos agnósticos para tratar a pacientes portadores de estos biomarcadores y estudios sobre costes de las pruebas diagnósticas nece- sarias para identificar a los candidatos a terapia agnósticas y/o de estos tratamien- tos tumor-agnósticos. En estos estudios se han empleado diferentes metodologías como revisiones y revisiones sistemáticas de la literatura o reuniones de personas expertas de dis- tintas disciplinas relacionadas, que han derivado en propuestas diagnósticas para la identificación correcta de biomarcadores de fusión y han permitido alcanzar reco- mendaciones para la práctica clínica. También se han encontrado diversos méto- dos cualitativos y cuantitativos con los que se ha evaluado la efectividad terapéu- tica de los fármacos agnósticos y el coste-efectividad de las pruebas diagnósticas y los tratamientos. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 126 Sólo se han localizado dos informes de ETS (79, 122) sobre el uso de tests moleculares, uno para detección de genes de fusión NTRK en tumores sólidos y el otro, para identificación de reordenamientos ROS1 en pacientes con NSCLC. En estos dos informes de ETS así como en la revisión sistemática de Albert y cols (23) se ha podido informar sobre la baja calidad metodológica de los artículos encon- trados, la existencia de escasos datos y resultados incompletos, y se reconoce una evidencia limitada procedente de grupos pequeños de pacientes, además de una gran heterogeneidad tanto clínica (diversos tipos de tumores, estadios tumorales, tratamientos recibidos, etc) como metodológica. Por todo ello, en estos estudios se descartó la posibilidad de realizar meta-análisis, que hubiera permitido generar una evidencia más sólida. Actualmente, todavía el diagnóstico correcto de las alteraciones moleculares sigue siendo un reto para la mayoría de los sistemas sanitarios. Las técnicas diag- nósticas deberían permitir el cribado de dichos biomarcadores de forma rápida y eficiente, pero teniendo en cuenta la baja prevalencia de estas alteraciones mole- culares, es preciso considerar no sólo la efectividad clínica sino los costes de los métodos diagnósticos que pueden utilizarse para identificar biomarcadores agnós- ticos (123). Hasta ahora, no parece factible ni sostenible realizar este tipo de prue- bas a todas las personas enfermas en el momento del diagnóstico inicial del tumor. Incluso la IHQ, que es la prueba más económica, no se puede realizar de manera rutinaria en todos los tumores (123). En la literatura seleccionada para este informe destaca la existencia de nume- rosos algoritmos que combinan diferentes tests y recomendaciones para la detección de genes de fusión respaldados por diferentes sociedades científicas. Algo común a todos ellos es que la elección de las pruebas para identificar estas fusiones se basa en aspectos diferentes como el tipo de tumor, la frecuencia esperada de cada bio- marcador, la calidad y cantidad de material tumoral disponible, la capacidad diag- nóstica de cada prueba, la accesibilidad a las distintas técnicas, la experiencia que se tenga con ellas y los recursos económicos del contexto clínico concreto, además de ser importantes la cantidad de muestra disponible y del tiempo que sea posible esperar hasta tener el resultado. En general, los documentos revisados coinciden en que la NGS es la técnica más efectiva para determinar las fusiones NTRK y reordenamientos ALK, ROS1 y RET (14,25,63). El desarrollo de la NGS ha supuesto un cambio fundamental en el abordaje del diagnóstico oncológico y ha permitido aportar gran cantidad de información sobre el perfil molecular de los tumores, por la posibilidad de estu- diar de forma simultánea muchas alteraciones genéticas en una sola prueba y la ventaja sustancial de alcanzar una alta efectividad incluso en muestras de pequeño tamaño. Se acepta que la NGS se convertirá en la herramienta clave para informar 127 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA las decisiones clínicas sobre terapia de precisión en oncología dado el incremento progresivo previsto a corto y medio plazo en el número de biomarcadores predic- tivos de buena respuesta al tratamiento. Sin embargo, hasta el momento, su uso viene limitado por su diferente implementación y por los recursos económicos de cada contexto sanitario. Por ello, dado que no es posible realizar NGS a la totalidad de personas enfermas, la mayoría de las estrategias prefieren comenzar con un test de screening de bajo coste, seguido de otra prueba de mayor exactitud diagnóstica (y, generalmente de coste más elevado) para confirmar el resultado del primero. Para poder realizar el estudio de varios biomarcadores agnósticos simultá- neamente, se podría recurrir bien a la NGS o bien mediante IHQ o FISH aunque estas dos últimas técnicas requieren de una determinación para cada biomarcador. Probablemente ninguna de las dos estrategias sería adecuada; en el primer caso por tratarse de una tecnología no totalmente accesible y por los costes asociados, y en el segundo por la carga de trabajo y porque en algunos casos no se dispone de sufi- ciente muestra de tejido (49). En ocasiones es preciso utilizar varias técnicas, lo que supone un incremento considerable en costes, o es posible que no resulte factible para el cribado de rutina, siendo necesario buscar un procedimiento de screening coste-efectivo, con tecnologías sencillas, robustas y accesibles para poder reali- zar un cribado de los principales biomarcadores agnósticos sin tener que secuen- ciar todos los casos. Todos los estudios coinciden en que para asegurar la validez diagnóstica de estas pruebas es necesario realizar controles de calidad en el manejo de las mues- tras tisulares, de ahí la importancia de estandarizar todo el proceso de las muestras desde el momento de ser obtenidas. Son varios los parámetros que deben especificarse en el informe de resultados de estas pruebas diagnósticas, entre ellos, el diagnóstico anatomopatológico, tipo de muestra (de biopsia, citológica), forma en que se recibe (muestra fresca, con- gelada, fijada en parafina), fecha de la muestra, porcentaje de células tumorales, número y porcentaje de células analizadas y de las que muestren la alteración estu- diada, concentración y pureza del DNA, calidad del RNA, test utilizado, incluso se debe mencionar si la muestra era o no adecuada para alcanzar un diagnóstico fiable. En las muestras tisulares de biopsia, algunos factores son claves, como el tiempo desde la toma de la muestra hasta su preservación, el tiempo total de fijación o el tamaño de la muestra. Un retraso en el tiempo hasta que es preservada la muestra puede ocasionar errores en IHQ y FISH. Se recomienda un tiempo de isquemia fría de menos de 1 hora. Las muestras histológicas se deben fijar por inmersión en formalina al 10% y después fijarse más de 6 horas pero menos de 24 h para man- tener la antigenicidad y la integridad del DNA, o entre 24-72 horas si se trata de INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 128 piezas quirúrgicas. Las muestras citológicas no-FFPE como frotis directos o cito- logía líquida, permiten obtener buenos resultados, siempre que se cumplan ciertos requisitos de calidad en la fijación, tinción, en los cortes o en la forma de prepara- ción (25). Los bloques celulares en parafina suelen ser el material preferido para estudiar biomarcadores tumorales porque permiten obtener múltiples secciones para poder realizar varios análisis. El método de procesamiento preferido de estos bloques es la fijación con formalina y posterior inclusión en parafina porque estos bloques se podrán manejar de forma similar a las muestras histológicas y aplicar los mismos protocolos de análisis de biomarcadores. La desventaja es que algu- nos de estos bloques celulares contienen muy pocas células tumorales o incluso, ninguna, y diferenciar entre células tumorales y células reactivas resulta más com- plejo que en el estudio citológico convencional, especialmente si se realiza FISH. Generalmente se utilizan muestras FFPE de 4 micras de grosor tanto para IHQ como para FISH. Para IHQ es necesario un mímino de 20 células tumorales para detectar reordenamientos ROS1 (aunque existen discrepancias entre autores) y de al menos 50 células tumorales para FISH (34). Para los estudios moleculares, es importante evitar áreas de necrosis tumoral o de fibrosis marcada y seleccionar la zona de mayor porcentaje de células tumorales. La NGS es el test de elección en pacientes con enfermedad avanzada o cuando no se dispone de suficiente muestra. Sin embargo, su coste y una implementación limitada, hacen que la prueba de screening más utilizada hasta el momento sea la IHQ. La RT-PCR y la biopsia líquida son pruebas poco utilizadas en la práctica clínica (25), aunque la biopsia líquida tendría ventajas en pacientes con NSCLC u otros tumores en los que sea complicado obtener muestras de biopsia, o cuando la cantidad disponible sea insuficiente para aplicar otras técnicas diagnósticas, o cuando se ha producido progresión de la enfermedad y ya no es posible volver a realizar biopsias. La mayor parte de los estudios sobre pruebas para detectar fusiones NTRK se han realizado en tumores sólidos, pero considerando tipos de tumores muy dife- rentes y con diferentes prevalencias de biomarcadores predictivos, mientras que los estudios para diagnóstico de reordenamientos ALK y ROS1 se han realizado, fundamentalmente, en pacientes con NSCLC. El screening de las fusiones NTRK es un proceso complejo por el hecho de que se trata de tres genes NTRK diferentes y porque existe una elevada cantidad de posibles pares de fusión y de puntos de unión a estos pares de fusión. En general, se acepta que este screening no es una prioridad en pacientes oncológicos en esta- dios precoces con enfermedad localizada puesto que el tratamiento en estos casos no va a incluir inhibidores Trk. Sin embargo, sí se recomienda realizar el screening en población adulta con tumores con una elevada prevalencia de fusiones NTRK o si 129 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA presentan tumores avanzados o metastásicos (123,131). En la población pediátrica, se recomienda su estudio en tumores con alta prevalencia, tanto en el momento del diagnóstico como en casos de recaídas, y en tumores de baja prevalencia pero si presentan progresión o enfermedad metastásica (9,23,156). La mayoría de los estudios revisados considera que la NGS es la metodolo- gía más apropiada y precisa para detectar las fusiones de NTRK. Representa un método útil para detectar estas fusiones, con una alta Se y Sp, así como para definir el par de fusión, incluso permite identificar fusiones nuevas del gen NTRK, a dife- rencia de otras técnicas. Y especialmente lo son las basadas en RNA por su capa- cidad para evitar las regiones intrónicas grandes de NTRK 2 y 3, difíciles de ana- lizar con la NGS-DNA. También la NGS es la prueba indicada cuando se dispone de una muestra escasa donde hacer el diagnóstico (13,16). Igual que ocurre con FISH, la NGS-DNA identifica los reordenamientos genó- micos a nivel de DNA, pero estos pueden o no llegar a convertirse en proteínas de fusión funcionales, es decir, que muchas de las fusiones NTRK detectadas por NGS-DNA tienen un significado incierto y deben ser confirmadas por otros tests, bien NGS-RNA o IHQ (50). De hecho, la sobreexpresión de Trk, que es posible detectar mediante IHQ, podría predecir de forma más adecuada la respuesta a los TKIs, pues en algunas personas no respondedoras se habían detectado reordena- mientos NTRK mediante NGS pero la IHQ no demostraba expresión de Tkr, lo que indicaría que la expresión Trk en IHQ resulta necesaria para que el tumor responda a dicho tratamiento (90,162). No obstante, si se detecta sobreexpresión Trk con IHQ, habría que confirmar esta positividad por técnicas moleculares, pues podría deberse a otras alteraciones genéticas pero no a fusiones NTRK (163). En general, y dado los costes de la NGS y que todavía no tiene una implan- tación universal, se recomienda el screening de fusiones NTRK con IHQ, que ha alcanzado valores de Se y Sp en torno al 95% y 100%, respectivamente, aunque la Se de la IHC es considerablemente menor en el caso de fusiones NTRK3 (54,5-79%) (9,51,53), de modo que si se sospechan fusiones ETV6-NTRK3, estaría más indicado realizar FISH (14,23) o NGS directamente (16). La Sp de la IHQ varía dependiendo del tipo histológico del tumor pues la tinción de fondo en algunos tejidos normales impide el diagnóstico correcto de algunos tumores como los gliomas. Estos tumo- res expresan la proteína Trk de forma fisiológica, por ello, se descarta utilizar IHQ y se recomienda realizar directamente NGS. También pueden darse FP en carcino- mas secretores de mama y análogos de secretores de mama (53). Se ha constatado que la pan-Trk IHQ es una prueba eficiente, rápida, fiable y que está ampliamente implementada en la mayoría de los laboratorios por lo que el acceso a la misma en la práctica clínica suele ser fácil. Los estudios revisados INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 130 han confirmado que para la interpretación de IHQ no existen unos criterios de pun- tos de corte aceptados por la comunidad científica y que los patrones de tinción, tanto en intensidad como en localización, son muy variados (79). En caso de que se detecte esta expresión proteica, se recomendaría realizar una NGS con paneles de múltiples genes para confirmar o descartar la alteración genética sospechada. Algunos de los algoritmos más aceptados para detección de fusiones NTRK son los propuestos por SEOM/SEAP/SEHOP (9,156) y ESMO (13). Cuando se espera una prevalencia muy alta de algunas alteraciones genéticas en un determi- nado tumor, o si incluso su presencia sea patognomónica, probablemente cualquier prueba podría ser útil, pero las mejores opciones para confirmar el diagnóstico serían FISH, RT-PCR y paneles de NGS-RNA. Si, por el contrario, se quiere realizar el estudio en una población no seleccionada, la mejor prueba sería la NGS, siendo la basada en RNA el gold standard, siempre que la calidad del RNA sea óptima. Cuando se detecte un caso positivo a fusiones NTRK, entonces habría que confir- mar la expresión proteica de dichas fusiones con IHQ. Otra estrategia alternativa para tumores con baja prevalencia (<5%) de fusiones NTRK, es la basada en dos fases: primero screening con IHQ y después, NGS-RNA como prueba de confir- mación de los casos positivos. Sin embargo, también se han planteado propuestas diferentes (130) como la de realizar FISH si la prevalencia esperada es alta e ini- ciar el tratamiento con fármacos agnósticos si resultado es positivo, mientras que se recomienda IHQ sólo en aquellos laboratorios que no dispongan de FISH, y para tumores de baja prevalencia de fusiones NTRK, directamente se propone hacer NGS. En cuanto al momento más adecuado para realizar el estudio de los bio- marcadores, se han recomendado distintas opciones: desde hacerlo en el momento del diagnóstico inicial, con el fin de poder establecer el tratamiento cuanto antes (123), a realizarlo sólo en casos de progresión de la enfermedad cuando la única alternativa terapéutica son los fármacos agnósticos (9,156). Progresivamente se está extendiendo el uso de los paneles de NGS porque per- miten el estudio simultáneo de un número alto de genes, de modo que se va conso- lidando como prueba de screening en muchos laboratorios para adenocarcinomas. Para pacientes con NSCLC avanzado se acepta que el gold standard para diagnós- tico de biomarcadores es la NGS, tal como recomienda la SEOM (158). También ESMO recomienda la NGS en pacientes con NSCLC avanzado (126) y cuando no se dispone de suficiente muestra para realizar otros estudios (13). Una ventaja muy señalada de la NGS es su capacidad para identificar alteraciones genéticas en muestras de pequeño tamaño, como las obtenidas a partir de aspiración con aguja fina o de biopsias con aguja gruesa, que suelen ser las utilizadas para diagnosticar a pacientes con NSCLC. 131 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA En todos los pacientes con NSCLC no-escamoso resulta obligado realizar un estudio de los biomarcadores ALK, ROS1, NTRK y RET predictivos de buena res- puesta a terapia. En carcinomas de células escamosas, metastásicos en no-fumadores o levemente fumadores o exfumadores desde hace mucho tiempo, estaría indicado el estudio de ROS1, NTRK, ALK y RET (127,128). Se considera (163) que en pacientes con NSCLC la estrategia más coste-efectiva para el screening de fusiones NTRK sólo debería aplicarse en los casos en que la incidencia esperada sea alta (pues el número de casos con fusiones NTRK real- mente es muy bajo) y cuando la intención sea administrar terapia dirigida inhibi- dora de NTRK. En pacientes con cáncer de pulmón, el estudio de otros genes como ERBB2, MET o KRAS, todavía no se recomienda de forma aislada pero sí dentro de amplios paneles de genes, tanto en el momento del diagnóstico inicial como después de des- cartar alteraciones en EGFR, ALK, BRAF, ROS1 y RET (25) dadas las implicaciones pronósticas y terapéuticas que supone la presencia de alteraciones en estos genes (77). Otras guías y documentos de recomendaciones se han referido a otros tumo- res como CCR, cáncer de tiroides o SPB (124,129,130). En pacientes CCR estaría indicado realizar estudio de biomarcadores de fusión en casos de alta MSI y cuando se han descartado mutaciones RAS, siendo la IHQ y la NGS las técnicas recomen- dadas (13,124,125). Para pacientes con cáncer de tiroides se recomienda estudiar la presencia de fusiones NTRK si se trata de un tumor no resecable, o tras recurren- cia tumoral o si es refractario a iodo radiactivo, utilizando IHQ como prueba de screening seguido de NGS para confirmar los resultados positivos. Para pacientes diagnosticados de GIST (129), se recomienda hacer NGS como primera prueba, igual que para SPB en los que se recomienda el estudio de fusiones NTRK (132). Para la identificación de reordenamientos RET, la guía de ESMO descartaba utilizar IHQ y recomienda FISH para fusiones RET. No obstante, si se dispone de muestras FFPE, aconsejan realizar NGS e inciar el tratamiento cuando el resultado es positivo, mientras que para aquellos laboratorios sin acceso a NGS, se recomen- daría FISH o QT-PCR para estudiar fusiones o mutaciones, respectivamente. Y en casos de no disponer de muestras FFPE, dan como alternativa el estudio mediante biopsia líquida (41). En pacientes con NSCLC metastásico, la guía NCCN reco- mendaba estudiar la presencia de reordenamientos RET por la gran efectividad de los inhibidores RET selectivos en tumores positivos a estas alteraciones (127). Debemos señalar que para este informe no se han localizado documentos que sigan el proceso de evaluación de tests genéticos propuesto por Pitini y cols (164). A través de una revisión sistemática, pusieron de manifiesto que el marco más INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 132 utilizado para la evaluación de tests genéticos era el modelo ACCE (que consi- dera aspectos de validez analítica, validez clínica, utilidad clínica y revisión de las implicaciones éticas, legales y sociales). Sin embargo, consideran que este marco de evaluación resulta insuficiente para el ámbito de la medicina de precisión, al no considerar aspectos relacionados con la implementación y posibles cambios orga- nizativos adaptados al contexto concreto donde se quieran aplicar las nuevas tec- nologías, especialmente en el entorno de sistemas de salud de financiación pública donde la equidad y las limitaciones de recursos son elementos clave (165). Por este motivo, Pitini y cols. desarrollan un nuevo marco de evaluación de los tests genéticos que pueda ayudar en la toma de decisiones sobre coberturas sanitarias. Este nuevo marco integra los dos de mayor uso, el modelo ACCE y el core model de EUnetHTA (166), que analizan de un modo más sistemático aspectos organi- zativos y de desarrollo. Para los tests genéticos, se propone una primera sección, con una introducción donde se define la condición clínica y el test en estudio. La sección segunda se centra en el acceso de las personas candidatas y familiares al test genético, incluyendo algunos factores de interés como los aspectos organiza- tivos (los programas de salud, el nivel asistencial, el acceso del paciente), la eva- luación económica, las implicaciones éticas, legales y sociales, y la perspectiva del paciente. La tercera sección recoge las prioridades en investigación y áreas para las que no se haya identificado evidencia científica. Por último, una cuarta sección que resume la evidencia generada para respaldar el proceso de toma de decisiones respecto al uso del test; se recogería el beneficio neto, coste-efectividad y factibi- lidad del programa de utilización del test genético en la práctica asistencial (165). 5.2. En relación a los tratamientos agnósticos El desarrollo de la medicina de precisión en oncología y la traslación y uso de fármacos dirigidos en la práctica clínica ha cambiado de forma sustancial el manejo terapéutico de pacientes en los que se demuestra la presencia de determinadas alte- raciones genéticas susceptibles de responder a algunos fármacos, especialmente, en el caso de pacientes con enfermedad avanzada o metastásica. Los tratamientos con entrectinib y larotrectinib están aprobados para cuando «no existen otras opciones terapéuticas satisfactorias» y, por lo tanto, el momento en que un paciente será candidato a uno de estos fármacos será muy variable, depen- diendo del tipo de tumor y de las opciones terapéuticas existentes para cada caso. Para la evaluación de estos fármacos, así como de los tests para identificar a pacientes con alteraciones genéticas tan poco frecuentes, los habituales ensayos 133 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA clínicos randomizados no son factibles. En su lugar, los ensayos en medicina de precisión incluyen dos grandes grupos: 3. Ensayos estratificados cuyo objetivo final es evaluar la eficacia de un fár- maco, es decir, determinar si un fármaco concreto tiene actividad sobre un subgrupo de pacientes con determinadas características moleculares o histológicas. Se diferencian dos tipos: estratificación molecular (ensayos paraguas, umbrella trials) y estratificación histológica (ensayos en cesta, basket trials). Los ensayos clínicos en cesta incluyen pacientes con tumo- res de diferentes tipos histológicos pero con la misma alteración genética y que son tratados con un mismo medicamento para estudiar su efectivi- dad. Estos ensayos permiten obtener resultados finales de respuesta tumoral incluso con tamaños muestrales pequeños, que de otra manera necesitarían tiempos muy prolongados hasta obtener evidencias y se han convertido en una importante herramienta para generar información dentro de la medi- cina de precisión (80). Por el contrario, los ensayos paraguas seleccionan pacientes con tumores del mismo tipo histológico, los estratifican en fun- ción de la alteración genética que presenten, y les administran un medica- mento diferente según dicha alteración. 4. Ensayos para analizar la eficacia de los algoritmos de tests diagnósticos que permitirían analizar si el uso de una tecnología aplicada para guiar el tratamiento de acuerdo a un protocolo terapéutico específico, mejora los resultados en salud del paciente. Estos ensayos para algoritmos diagnós- ticos consideran diferentes alteraciones moleculares, diferentes fármacos y, generalmente también, diferentes tipos de tumores (167,168). A su vez, pueden ser no-randomizados y randomizados. Con ellos es posible deter- minar la efectividad de las pruebas. Así, la NGS se ha evaluado a través de ensayos clínicos en los que se utiliza esta prueba como guía para esta- blecer el tratamiento. Su valor predictivo vendría dado por su capacidad para mejorar los resultados en salud de un paciente, es decir, por su uti- lidad clínica. Por ejemplo, el ensayo multicéntrico randomizado de fase II SHIVA no permitió confirmar que la NGS mejorara los resultados en salud del paciente, mientras que otros ensayos de algoritmos diagnósticos no-randomizados han sugerido resultados contrarios (169-171). Tanto el larotrectinib como el entrectinib se aprobaron a partir de ensayos en cesta, que por el hecho de ser ensayos de un solo brazo presentan algunas limitacio- nes, como no permitir las comparaciones directas entre tratamientos y la dificultad para generar evidencia de suficiente rigor con la que respaldar su incorporación a la práctica clínica. Además, otra limitación viene dada por la gran heterogeneidad encontrada entre estudios, surgida de diferentes fuentes: pacientes con diferentes INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 134 características, tumores de diversos tipos histológicos y diferentes pronósticos. Por otro lado, el uso de los fármacos tumor-agnósticos requiere un estudio diagnóstico previo que confirme la presencia de determinados biomarcadores y por ello, en la evaluación de coste-efectividad de estos nuevos fármacos será necesario incluir esas pruebas diagnósticas que identifiquen y ayuden a selecionar a los pacientes candidatos. Un problema añadido para la evaluación de estos fármacos es que habi- tualmente se requiere un comparador o gold standard, pero en el caso de estos fár- macos tumor-agnósticos existen multitud de terapias estándar en función del tipo histológico y de la localización del tumor. Además, algunas variables de resultados como la OS o PFS, que suelen ser las más utilizadas para revisiones sistemáticas o informes de ETS, en el caso de estas terapias agnósticas no suelen estar disponi- bles. Algunos estudios en los que se han comparado variables de resultados como ORR o OS, han realizado ajustes en función de algunas características demográ- ficas u otras variables y los resultados se comparan con una población con trata- miento basado en el tipo histológico de la que no se tiene información sobre la pre- sencia o no de genes de fusión. Además, estos ensayos suelen tener un tiempo corto de seguimiento, de modo que no se conocen los resultados a largo plazo o no han podido ser estimados. Otra limitación es que la autorización de comercialización y uso de estos fármacos tumor-agnósticos se ha basado en la presencia de fusiones NTRK, ROS1, ALK o RET, asumiendo que la efectividad de los fármacos similar entre los distintos tipos histológicos (172). La incorporación de nuevos fármacos a la cartera de servicios y su uso en la práctica clínica debería basarse en estudios sólidos de efectividad y seguridad y de coste-efectividad, pero la baja prevalencia de los biomarcadores cuya presencia debe identificarse previamente a la administración de los fármacos tumor-agnósticos, limita de forma notable la realización de estudios con resultados sólidos. Sin embargo, si se decide esperar a disponer de evidencia sólida para respaldar su uso, pacientes candidatos al tratamiento no se podrían beneficiar de ellos. Por esto, se ha propuesto (153) que sean utilizados bajo ciertos controles y que tras un periodo de estudio, se debería re-evaluar el coste-efectividad con los nuevos datos generados (173,174). Una mayor efectividad terapéutica debe ir acompañada de un perfil de segu- ridad correcto y de un incremento en la calidad de vida, de modo que los pacientes vivan más tiempo pero también mejor. La mejora en la calidad de vida depacientes oncológicos y el mantenimiento de esta mejora a lo largo del tiempo suponen uno de los objetivos clave del tratamiento del cáncer. En otros documentos (175) se ha demostrado una mejoría en la calidad de vida de pacientes adultos y pediátricos con tumores con fusiones NTRK tratados con larotrectinib, asociada a una rápida y potente respuesta observada tras el uso de larotrectinib, además de observar una buena tolerancia al mismo y un favorable perfil de toxicidad. Son estas variables de resultado de supervivencia y calidad de vida las más interesantes. Sin embargo, 135 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA no siempre se pueden estudiar, especialmente cuando los periodos de seguimiento son cortos, y hay que recurrir a variables subrogadas como PFS o las tasas de res- puesta tumoral, que no necesariamente son predictivos de los resultados finales. La ausencia de estudios comparativos directos entre larotrectinib y entrectinib ni entre estos y el tratamiento estándar supone un inconveniente para incorporar los nuevos tratamientos agnósticos a la práctica de rutina (103). Algunas investiga- ciones (134) han realizado comparaciones indirectas entre larotrectinib y el trata- miento estándar y otros (135), una comparación indirecta ajustada con empare- jamiento entre larotrectibnib y entrectinib para estudio de pacientes con fusiones NTRK. Otra metodología utilizada en otros estudios (136-138)es la de las compa- raciones intrapaciente utilizando el GMI como instrumento para aportar mayor evidencia sobre la efectividad de los TKIs frente a terapia convencional y permi- tiendo superar algunas de las limitaciones de los ensayos de un solo brazo. El GMI ofrecería información intrapaciente, tomando al paciente como su propio control. Esta segunda opción ha sido respaldada por la EMA para tumores muy raros (176). En general, se han observado resultados más favorables del larotrectinib en comparación al entrectinib y a los demás tratamientos estándar, y esta mayor efec- tividad se ha reflejado en prácticamente todas las variables de resultado analizadas como OS, ORR, PFS o DoR, y en mayor tolerancia al fármaco. En otros estudios la metodología utilizada para generar datos comparativos ha sido la modelización basada en simulación (139-141) mediante modelos de super- vivencia particionados para generar datos a partir de estudios de pequeño tamaño muestral con el fin de ayudar a la toma de decisiones de clínicos y gestores de los sistemas sanitarios. Estos estudios han demostrado mayor efectividad terapéutica del larotrectinib frente al tratamiento estándar, en términos de esperanza de vida y QALYs, lo que respalda la importancia de determinar si el tumor presenta genes de fusión NTRK, requisito para decidir administrar este fármaco. Pero también, estos estudios sugieren mejores resultados del larotrectinib frente al entrectinib. No obs- tante, es necesario señalar las limitaciones que estos estudios presentan como el pequeño número de pacientes y la escasez de datos disponibles sobre si pacientes tratados con terapia convencional presentaban o no fusiones NTRK, por lo que las conclusiones deben considerarse con cautela en espera de nuevos datos que aña- dan evidencia más sólida. En pacientes con NSCLC positivos a fusiones ROS1, el entrectinib parece mejorar la OS e incrementa de manera significativa la ORR en comparación a cri- zotinib (142). En espera de la finalización del ensayo clínico (NCT04603807) que ofrezca resultados sobre efectividad y seguridad comparada entre estos dos fárma- cos, los datos hasta el momento sugieren que no habría diferencias en cuanto a la INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 136 PFS ni a la necesidad de interrumpir el tratamiento por los EA asociados a los fár- macos. En comparación a la QT convencional, el entrectinib sí ofrecería un benefi- cio terapéutico superior, con mejores resultados en las variables de OS, PFS y ORR, y una menor toxicidad. Por todo ello, se respaldaría el uso de entrectinib en pacien- tes con NSCLC portadores de fusiones ROS1, incluyendo pacientes con metástasis cerebrales en los que su efectividad es claramente superior. Las revisiones y otros documentos incluidos en este informe muestran que estos fármacos agnósticos ofrecen resultados prometedores para pacientes con tumores sólidos y fusiones NTRK, pendientes de confirmación con los datos de los estudios en curso solicitados por la EMA. Se necesitan estudios cuantitativos de calidad que permitan comparar la eficacia relativa de estos agentes terapéuticos y que faciliten su traslación a resultados clínicamente significativos. Debido a la baja prevalencia de estas fusiones NTRK, para poder generar datos en un periodo de tiempo razonable, la opción posiblemente más factible sería utilizar bases de datos de RWE con los que estudiar los tiempos de diagnóstico de fusiones NTRK y la modificación potencial en la toma de decisiones terapéuticas en los tumores positivos a dichas alteraciones genéticas. 5.3. Aspectos económicos y organizativos A pesar de que los tratamientos agnósticos están autorizados para pacientes con cáncer avanzado o metastásico cuando se identifican algunos biomarcadores, tanto el uso de tests genéticos para su determinación como la terapia con esos fármacos dirigidos supone una inversión económica considerable, por lo que resulta nece- sario estimar el coste-efectividad del diagnóstico para seleccionar pacientes candi- datos al tratamiento agnóstico. En algunos sistemas sanitarios, la implementación y el reembolso de ciertas tecnologías diagnósticas y terapéuticas depende de los resultados de análisis de coste-efectividad. En el caso de los fármacos agnósticos, la identificación de pacientes candidatos a dicha terapia supone un importante reto pues, en principio, pacientes con tumores sólidos en estadios avanzados o metas- tásicos deberían ser estudiados por si presentaran algún biomarcador. En este informe se han revisado varios estudios económicos que contemplaban distintas metodologías de análisis (estudios de micro-costes, de coste-utilidad y de coste-efectividad) y con objetivos diferentes comparando el entrectinib o larotrec- tinib con el tratamiento estándar o bien se trataba de estudios centrados en el aná- lisis de costes de las técnicas diagnósticas, en especial de la NGS. 137 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Entre las tecnologías diagnósticas, la NGS y los distintos paneles de genes pre- sentan un coste elevado todavía, y no tanto el coste de la propia tecnología sino el asociado al almacenamiento de datos y a la necesidad de personal altamente cuali- ficado. En la última década, estos costes de la NGS se han visto reducidos de forma considerable, hasta 5 veces según se recogía en una de las publicaciones revisadas (150), de manera que en ciertos contextos sanitarios se ha convertido en una tec- nología asumible. En este documento se estimó que el coste de la terapia dirigida utilizando NGS era de unos 31.000 € por paciente, siendo el coste más elevado (54%) el del tratamiento y las hospitalizaciones (35%). Sin embargo, en general se acepta que, aunque las plataformas NGS ofrecen un resultado más rápido y menos costoso que en los primeros años de su desarrollo, todavía el coste y el proceso téc- nico que conllevan, desde la preparación de las muestras y análisis posterior hasta la interpretación de los resultados y el almacenamiento de la información, pueden comprometer los potenciales beneficios de la NGS. Además, el uso de estas tecno- logías genómicas para identificar biomarcadores puede suponer un consumo con- siderable de recursos económicos puesto que se aplican sobre un elevado número de pacientes pero sólo una pequeña proporción va a obtener beneficios clínicos. Marino y cols (149) estimaron un coste medio total de la NGS con paneles diri- gidos de 607 € (± 207) para tumores genéticos somáticos y de 550 € (± 140) para tumores germinales, en comparación a los calculados en otras investigaciones de 100 € del coste medio de pan-TRK IHC, 100 € de RT-PCR y 300 € de los tres test FISH para NRTK1/2/3. En el informe noruego (79) se estimó un coste anual para identificar fusiones NTRK muy diferente según la prevalencia de estas alteraciones en los tumores, con valores que oscilaron de 1,2 a incluso 18 millones de coronas, entre los tumores de alta y baja prevalencia, respectivamente. Los resultados del informe del SMC (148) comparando entrectinib frente a terapia estándar, mostraron una gran variación en el ICER estimado, según si se excluían los tests diagnósticos en ambas ramas del estudio (unas £26,500) o si se incluían sólo en la rama del entrectinib (casi £60,000). Se ha estimado que la estrategia propuesta por ESMO de cribado con IHQ seguida de NGS como prueba de confirmación (13) supondría que el coste de identificar a un paciente positivo a fusiones NTRK oscilaría entre los 540 si el tumor era un carcinoma secretor de mama a casi 200.000 si se trataba de un NSCLC, de ahí que sea importante priorizar el estudio en pacientes con una prevalencia esperada alta y en los pacientes que más se podrían beneficiar del tratamiento dirigido. Los dos estudios de coste-efectividad realizados en Países Bajos estimaron un ICER de casi 41.500 €/QALY del larotrectinib frente a la terapia estándar, muy por debajo del umbral considerado para patologías con alta carga de enfermedad (80.000 €/ QALY) (152), mientras que el entrectinib no resultaba coste-efectivo (ICER de casi 170.00 €/QALY) frente a la terapia estándar, aunque podría llegar a serlo si se incluyeran los tests genéticos en la práctica rutinaria (153). En otras publicaciones INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 138 (63) se considera que la NGS es la prueba más coste-efectiva para detectar fusio- nes NTRK pero también para ROS1, ALK y RET. Para una correcta implementación de los algoritmos diagnósticos para biomar- cadores oncológicos con mayor aceptación y respaldo por parte de los diferentes profesionales implicados, resultan fundamentales varios aspectos organizativos. Por un lado, es necesario disponer de las técnicas diagnósticas en el centro hospita- lario o poder remitir las muestras a otro centro para su determinación. Por otro lado, se requiere de profesionales expertos en el análisis genético y bioinformático que apliquen las mejores pruebas diagnósticas e informen de sus resultados, así como de un aprendizaje por parte de especialistas implicados en el manejo de pacientes oncológicos para tomar las mejores decisiones a partir de la información genética obtenida. Además, es preciso contar con la infraestructura y equipamiento tecno- lógico suficientes para soportar estas tecnologías diagnósticas. En la etapa final de interpretación de resultados de las pruebas moleculares y toma de decisiones tera- péuticas basadas en los mismos podría ser interesante establecer los denominados comités moleculares de tumores (MTB, molecular tumor board) constituidos por profesionales multidisciplinares de los campos de la oncología, biología molecu- lar, patólogos y radiólogos. En el año 2022, Klink y cols (177) han publicado un estudio sobre el uso de tests diagnósticos y de tratamientos con TKIs realizado a través de cuestionarios dirigidos profesionales de oncología de EEUU (de la Oncology Provider Extended Network, OPEN). Entre los resultados obtenidos destaca que el 68% solicitaba el test para identificar posibles fusiones NTRK en pacientes (todos adultos) con tumo- res sólidos avanzados o metastásicos antes de iniciar el tratamiento, pero menos de la mitad (46%) pautaba TKIs en los casos confirmados de presentar dichas fusio- nes NTRK. Por otro lado, un 96% declaraba no tener dificultades para interpretar los informes del test de fusiones NTRK. Entre los 73 pacientes estudiados por estos profesionales, la NGS fue la prueba más solicitada para identificar fusiones NTRK (en el 83,6%) seguida de IHQ para confirmar los casos positivos con NGS, y en segundo lugar la FISH pero con una frecuencia muy inferior (15,1%). El fármaco más indicado para pacientes positivos a fusiones NTRK fue el larotrectinib (56%) y entrectinib el segundo en frecuencia (25%). El acceso a los nuevos biomarcadores no se ha generalizado todavía en la práctica hospitalaria en España tal como refleja el estudio del 2020 de la SEOM sobre las condiciones de acceso a los fármacos oncológicos y a los biomarcado- res predictivos necesarios para seleccionar a personas candidatas a determinados fármacos (178). Este estudio se llevó a cabo a través de cuestionarios enviados a 146 hospitales españoles para preguntar sobre 11 fármacos y 5 marcadores predic- tivos. En relación a los biomarcadores considerados en este informe, el estudio de 139 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA la SEOM incluía la translocación ROS1 y los reordenamientos ALK como biomar- cadores predictivos de respuesta en pacientes con NSCLC. Se encontraron grandes diferencias de acceso a ambos. Los cuestionarios informaron de que en el 96% de estos centros era posible solicitar la determinación de estos biomarcadores; pero era necesario derivar a otros centros externos el 37% de los análisis para ALK y 47% de los de ROS1; se encontraron grandes diferencias en la financiación de las pruebas para su determinación; y el tiempo hasta obtener el resultado también varió sustancialmente entre los diferentes centros. Por otro lado, con el fin de responder a la demanda clínica, los laboratorios han ido implementando estrategias de secuenciación dirigida para identificar mutacio- nes en diferentes genes en un único análisis. Sin embargo, esta NGS no está dispo- nible de forma general para el cribado de estas alteraciones moleculares agnósticas predictivas de respuesta a terapias específicas. En el año 2022, se conocieron los resultados de una encuesta realizada por la SEOM y SEAP para conocer la situa- ción actual de los hospitales españoles sobre el acceso a la NGS (179). Los princi- pales resultados de este estudio fueron los siguientes: 1) el tumor sólido donde más se utilizaba esta prueba era el cáncer de pulmón; 2) la NGS no estaba disponible en gran parte de los centros hospitalarios, sino tan sólo en el 38% de los Servicios de Anatomía Patológica, pero además, los que disponían de esta tecnología la emplea- ban en un número pequeño de casos al año (unos 50 casos anuales); 3) aquellos cen- tros que externalizaban la realización de NGS, tenían un acceso limitado a la prueba. También disponemos de datos más recientes sobre el uso en España de biomar- cadores en pacientes con cáncer de pulmón. En el Congreso Europeo del Cáncer de Pulmón de 2022, se presentaron los resultados del Registro de Tumores Torácicos (https://www.gecp.org/), que cuenta con la participación 182 hospitales. Se trata de un registro observacional prospectivo, que ha incluido datos de 9.239 pacien- tes diagnosticados de NSCLC en estadio IV desde 2016 hasta marzo de 2022. Los resultados mostraron que sólo entre el 15-20% de hospitales españoles dispone de tecnologías de plataformas de secuenciación; que se realizaron pruebas de biomar- cadores tumorales en el 85% de pacientes con tumores no epidermoides (no esca- mosos) y en el 56,3% de pacientes con tumores epidermoides (escamosos); y que casi la mitad (44,5%) de los pacientes que se sometieron a las pruebas presentaron un resultado positivo en EGFR, ALK, KRAS, BRAF, ROS1 o PD-L1. SEOM ha manifestado su preocupación por la marcada variabilidad encon- trada en la práctica clínica entre Comunidades Autónomas e incluso entre hospita- les dentro de la misma Comunidad Autónoma. Considera necesario reducir estas diferencias en el acceso a los fármacos y a los marcadores predictivos, y mejo- rar las condiciones de acceso a los mismos, con el fin de buscar la mejor calidad de los cuidados en salud y la equidad en el acceso. Por ello ha propuesto algunas INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 140 pautas de mejora, partiendo de la necesidad de desarrollar una Estrategia Nacional de Medicina de Precisión. Consideran necesario desarrollar unos procedimientos estandarizados y un marco regulatorio para la implementación y financiación de biomarcadores en España, planificar la determinación de estos biomarcadores en los diferentes centros, reducir los tiempos entre la fecha de aprobación de un fár- maco para su comercialización y la aprobación de prescripción a los pacientes. Proponen la creación de una red de centros que garanticen homogeneidad y con- sistencia en la realización de las pruebas y para promover la elaboración de guías de práctica clínica a nivel nacional. La propia ESMO ha reconocido la dificultad de trasladar la investigación a la práctica clínica diaria dentro de la medicina de precisión. En su documento de recomendaciones de uso de la NGS (126), se comprometía a «hacer de puente entre ambos ámbitos, investigación y asistencia sanitaria, desarrollando guías basadas en la evidencia sobre el uso de NGS para contribuir a la equidad en el acceso al mejor tratamiento de pacientes con cáncer». El Ministerio de Sanidad junto con las comunidades autónomas ha identificado situaciones de inequidad en el acceso a las distintas pruebas genéticas en el terri- torio nacional por lo que se ha puesto en marcha un Grupo de trabajo dependiente de la Comisión de prestaciones, aseguramiento y financiación en el que participan representantes de las Comunidades Autónomas y las sociedades científicas impli- cadas que han trabajado en la actualización y concreción de la cartera común de servicios en el área de la genética a través del desarrollo de un catálogo de pruebas genéticas, presentado en enero de 2024, que pretende garantizar a todas las perso- nas que lo precisen un acceso más homogéneo y equitativo en el marco del SNS a las mismas. La primera parte de catálogo de pruebas genéticas, que incluye el área de la oncología, fue aprobada por el Consejo Interterritorial del Sistema Nacional de Salud el 23 de junio del 2023 y presentada en una jornada en el Ministerio de Sanidad en enero de 2024, junto a la aplicación informática que da soporte al catá- logo (https://cgen.sanidad.gob.es)». 141 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA 6. Conclusiones La posibilidad de acceder a fármacos tumor-agnósticos dirigidos frente los genes de fusión NTRK, ALK, ROS1 y RET ha modificado sustancialmente el manejo tera- péutico y los resultados en salud de pacientes oncológicos en los que se demuestre su presencia. Por este beneficio terapéutico, resulta fundamental identificar correc- tamente la presencia de estos biomarcadores agnósticos de fusión en algunos pro- cesos tumorales para seleccionar a pacientes candidatos a dichos tratamientos. Dado que en los tumores más prevalentes en la población general, la presencia de genes de fusión es muy baja, el screening no puede extenderse a toda la pobla- ción sino a grupos concretos de pacientes con enfermedad avanzada o no candi- datos a otros tratamientos y con opciones de ser susceptibles a la terapia dirigida. Las pruebas diagnósticas IHQ, FISH, RT-PCR y NGS han demostrado su uti- lidad para identificar fusiones en los cuatros genes contemplados en este informe. Las numerosas iniciativas, traducidas en diversas propuestas de algoritmos diag- nósticos y/o recomendaciones, reflejan el interés existente en este ámbito de la medicina de precisión a la vez que demuestran la falta de un consenso generali- zado sobre su mejor utilización. Las indicaciones de uso de las técnicas diagnósticas vienen determinadas por diversos factores como el tipo de tumor, la edad del paciente, el tipo de alteración genética, la prevalencia esperada de dichas alteraciones, la cantidad y calidad de la muestra disponible, la accesibilidad a las pruebas y tratamientos agnósticos y posibilidades de financiación de los mismos en cada contexto sanitario concreto. Todos los documentos revisados coinciden en que no resulta factible realizar un estudio de cada gen de forma secuencial, y menos aún lo será a medida que el número de biomarcadores conocidos se vaya incrementando. El conjunto de profesionales que trabaja en el departamento de Anatomía Patológica resulta esencial para garantizar la idoneidad de las muestras donde se realizará el estudio de los biomarcadores moleculares. El manejo pre-analítico de las muestras es clave para un correcto diagnóstico molecular por lo que se debería estandarizar todo el proceso desde la obtención de dichas muestras con el fin de evitar la variabilidad en la técnica. El objetivo es dis- poner de suficientes células tumorales con una adecuada calidad. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 142 Para detectar fusiones NTRK, la NGS basada en RNA se considera el gold standard. Se acepta que la NGS es la técnica de elección, pero en aquellos cen- tros en los que no está disponible o si no se practica de rutina en tumores malig- nos avanzados, la opción más aceptada es realizar IHQ como método de screening por su sensibilidad y eficiencia para detectar la expresión de proteínas Trk, ade- más de un rápido tiempo de respuesta y bajo coste en comparación a otras técni- cas como FISH y NGS. Se discute el papel de la IHQ en el screening de tumores con baja prevalencia. Para los casos positivos con IHQ, existe un acuerdo gene- ralizado de que deben ser confirmados con otro método molecular, y así descartar los posibles FP de la IHQ. Es posible que un resultado positivo de IHQ (expresión de Trk en el tumor) permita predecir con más fiabilidad una buena respuesta a inhibidores Trk que la sola presencia de reordenamientos NTRK detectados por NGS. FISH es una prueba de alta Se y Sp para la detección de genes de fusión, como ALK, ROS1 y RET. Para NTRK se requiere realizar un test FISH para cada gen. RT-PCR y la biopsia líquida no son pruebas muy extendidas en la práctica clínica. El limitado acceso a la NGS supone un problema para que se implemente su uso a nivel mundial a pesar del respaldo de las distintas Sociedades Científicas. Existen grandes diferencias en cuanto a su nivel de incorporación y experiencia de uso entre países pero también entre unos centros y otros dentro del mismo país. La incorporación de paneles NGS en los laboratorios, asociado a un descenso en los costes, podría facilitar que esta tecnología se convirtiera en la prueba de elec- ción para el diagnóstico de fusiones NTRK y reordenamientos ALK, ROS1 y RET. Además, se preve que el aumento esperado en el número de biomarcadores predic- tivos de buena respuesta al tratamiento junto al desarrollo en paralelo de nuevos fármacos dirigidos, convierta a la NGS en la herramienta fundamental para infor- mar las decisiones clínicas en el contexto de la oncología de precisión. Para identificar reordenamientos ALK y ROS1, las guías recomiendan IHQ como método de screening por su elevada sensibilidad y posterior confirmación de los casos positivos mediante pruebas citogenéticas, en concreto se recomienda usar FISH, o por pruebas moleculares como RT-PCR o NGS, mientras que para reordenamientos RET, posiblemente sea más efectivo utilizar directamente la NGS. Los fármacos tumor-agnósticos larotrectinib y entrectinib han demostrado resultados prometedores en pacientes con tumores sólidos y fusiones NTRK. Sin embargo, resulta difícil cuantificar y valorar el posible beneficio clínico de estos medicamentos en los diferentes tumores evaluados, al tratarse de un pool de tumores 143 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA diferentes con diferentes expectativas de vidas y con algunos tipos de tumor esca- samente representados. Por estos motivos, su traslación a la práctica clínica supone un reto para los decisores de los sistemas de salud. A pesar de que estos tratamientos inhibidores frente a genes de fusión se apro- baron con finalidad agnóstica, resulta muy importante tener en consideración los aspectos clínicos, histológicos y moleculares de cada tumor. En pacientes con tumores positivos a fusiones NTRK, los fármacos tumor-agnósticos larotrectinib y entrectinib han demostrado mayor efectividad tera- péutica, en términos de respuesta tumoral y supervivencia del paciente, que los trata- mientos no-dirigidos. La aplicación de ciertas metodologías de análisis ha llevado a sugerir que el larotrectinib tendría mejores resultados de supervivencia que el entrec- tinib, aunque es necesario recopilar un mayor número de pacientes tratados con estos fármacos para poder confirmar estos datos con evidencia más sólida dado que la elec- ción inicial de uno u otro fármaco tiene gran relevancia (si se generan resistencias, no será posible utilizar el otro fármaco). Para NSCLC positivos a fusiones ROS1, entrectinib parece ofrecer mejores resultados que crizotinib y que la QT convencional, aunque estas conclusiones se han generado a partir de estudios de comparaciones indirectas en espera de los resultados del ensayo en fase 3 que está en marcha actualmente. Los tumores con reordenamientos RET muestran una buena respuesta a inhibidores RET selectivos, superior a la de otros quimioterápicos. La baja prevalencia de los biomarcadores agnósticos en la población oncoló- gica y, por ello, el reducido número de pacientes que pueden ser estudiados, limita la posibilidad de diseñar ensayos clínicos aleatorizados. Se acepta que estas prue- bas diagnósticas y los fármacos tumor-agnósticos sean evaluados a partir de los datos generados en ensayos en cesta, de un solo brazo, y que para su análisis se empleen metodologías rigurosas contrastadas. No obstante, en la interpretación de los resultados de estos ensayos deben tenerse en cuenta sus potenciales limitaciones. Se espera un desarrollo continuado de nuevos fármacos agnósticos y con ello, el screening de biomarcadores posiblemente será parte del proceso diagnóstico habitual en la práctica clínica. Se dispone de pocos estudios de evaluación económica sobre pruebas diag- nósticas de cribado de los biomarcadores de fusión. Los datos aportados hacen referencia a precios y costes propios de los sistemas sanitarios y países donde se han desarrollado esos estudios, por lo que la generalización de los resultados debe hacerse con cautela. La NGS-RNA para el estudio de fusiones NTRK en pacientes INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 144 con tumores de alta prevalencia podría resultar económicamente interesante siem- pre que se realice la secuenciación de múltiples muestras y de varios pacientes de forma simultánea. 6.1. Para futuras investigaciones Sería interesante planificar estudios de cohortes de gran tamaño con poblacio- nes bien definidas de pacientes oncológicos, en edad adulta y pediátrica, que com- paren la efectividad diagnóstica de las distintas pruebas según el tipo de tumor y los biomarcadores predictivos, y que sean estudiados en diferentes etapas, inclu- yendo el momento de la realización de los tests, la toma de decisiones terapéuti- cas y la evolución del paciente tras el tratamiento, con un seguimiento clínico, a corto y a largo plazo. Son necesarios más estudios sobre la efectividad terapéutica y utilidad clínica y seguridad de estos fármacos, donde se incluya un número elevado de pacientes y que permitan analizar variables de resultado de interés clínico pero también de interés para pacientes como la supervivencia global y calidad de vida, y no sólo variables subrogadas como la respuesta tumoral. También deben incluirse variables de seguridad sobre el tratamiento con estos fármacos, estudiando posibles even- tos adversos consecuencia de la aplicación de un tratamiento u otro en función de los resultados de las pruebas diagnósticas y también analizando los casos de pro- gresión de la enfermedad por desarrollo de resistencias a los mismos. Si para estos pacientes se decide administrar tratamiento con fármacos de nuevas generaciones, se analizará la efectividad y seguridad de estos tratamientos. También se necesitan estudios comparativos entre los diferentes fármacos agnósticos y entre estos y los tratamientos convencionales, a corto y largo plazo, que ayuden en la toma de deci- siones para elegir el tratamiento más efectivo. Igualmente se necesitan estudios de evaluación económica que permitan el análisis completo desde la aplicación de las pruebas diagnósticas, los tratamien- tos escogidos en función de los resultados de dichas pruebas, la efectividad tera- péutica y los costes de los eventos adversos y otras consecuencias del tratamiento. Sería interesante poder concentrar el conocimiento más avanzado y combinar los resultados de estudios con metodología rigurosa en un meta-análisis con el fin de aumentar el nivel de evidencia y grado de confianza en los resultados, de modo que sea posible aplicar dicho conocimiento y los recursos disponibles de forma efi- ciente a todos los pacientes que potencialmente se puedan beneficiar de estos tests y de los tratamientos personalizados. 145 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA La creación de grandes bases de datos de pacientes de diferentes centros hos- pitalarios, incluso de países distintos, para recoger en un periodo de tiempo corto los resultados relacionados con el diagnóstico de los diferentes biomarcadores y con los tratamientos utilizados, permitirá en el futuro analizar un mayor número de resultados en tiempos más cortos con los que generar información y evidencia basada en el mundo real. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 146 7. Referencias 1. 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ESCAT evidence tier Required level of evidence Clinical value class Clinical implication Ready for routine use I: Alteration-drug match is associated with improved outcome in clinical trials I-A: prospective, randomised clinical trials show the alteration-drug match in a specific tumour type results in a clinically meaningful improvement of a survival end point I-B: prospective, non-randomised clinical trials show that the alteration-drug match in a specific tumour type, results in clinically meaningful benefit as defined by ESMO MCBS 1.1 I-C: clinical trials across tumour types or basket clinical trials show clinical benefit associated with the alteration-drug match, with similar benefit observed across tumour types Drug administered to patients with the specific molecular alteration has led to improved clinical outcome in prospective clinical trial(s) Access to the treatment should be considered standard of care Investigational II: alteration-drug match is associated with antitumour activity, but magnitude of benefit is unknown II-A: retrospective studies show patients with the specific alteration in a specific tumour type experience clinically meaningful benefit with matched drug compared with alteration-negative patients II-B: prospective clinical trial(s) show the alteration-drug match in a specific tumour type results in increased responsiveness when treated with a matched drug, however, no data currently available on survival end points Drug administered to a molecularly defined patient population is likely to result in clinical benefit in a given tumour type, but additional data are needed Treatment to be considered ‘preferable’ in the context of evidence collection either as a prospective registry or as a prospective clinical trial INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 166 Tabla 5. Niveles ESCAT. ESCAT evidence tier Required level of evidence Clinical value class Clinical implication Hypothetical target III: alteration-drug match suspected to improve outcome based on clinical trial data in other tumour type(s) or with similar molecular alteration III-A: clinical benefit demonstrated in patients with the specific alteration (as tiers I and II above) but in a different tumour type. Limited/absence of clinical evidence available for the patient-specific cancer type or broadly across cancer types III-B: an alteration that has a similar predicted functional impact as an already studied tier I abnormality in the same gene or pathway, but does not have associated supportive clinical data Drug previously shown to benefit the molecularly defined subset in another tumour type (or with a different mutation in the same gene), efficacy therefore is anticipated for but not proved Clinical trials to be discussed with patients IV: pre-clinical evidence of actionability IV-A: evidence that the alteration or a functionally similar alteration influences drug sensitivity in preclinical in vitro or in vivo models IV-B: actionability predicted in silico Actionability is predicted based on preclinical studies, no conclusive clinical data available Treatment should ‘only be considered’ in the context of early clinical trials. Lack of clinical data should be stressed to patients Combination development V: alteration-drug match is associated with objective response, but without clinically meaningful benefit Prospective studies show that targeted therapy is associated with objective responses, but this does not lead to improved outcome Drug is active but does not prolong PFS or OS, probably in part due to mechanisms of adaptation Clinical trials assessing drug combination strategies could be considered X: lack of evidence for actionability No evidence that the genomic alteration is therapeutically actionable There is no evidence, clinical or preclinical, that a genomic alteration is a potential therapeutic target The finding should not be taken into account for clinical decision ESCAT: ESMO Scale for Clinical Actionability of molecular Targets. 167 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Anexo II. Companion Diagnostic (CDx) En septiembre de 1998, la FDA aprobó el primer companion diagnos- tic (CDx) test, con la aprobación simultánea del trastuzumab y el test HER2 de IHQ, HercepTest. El concepto de CDx se refiere a un modelo de codesarrollo fármaco-diagnóstico. La FDA ha aprobado varios CDx (180), bien in vitro (IVD) o de imagen, que aportan información esencial para un uso seguro y efectivo de la terapia correspondiente. La utilización de los IVD se recoge en las instrucciones de uso del dispositivo diagnóstico y en el etiquetado del correspondiente fármaco o grupo específico de fármacos oncológicos indicados. A partir de 2014, la FDA hace obligatorio el uso de un test CDx concreto y debe realizarse siempre antes de prescibir el correspondiente fármaco a un paciente. Los test CDx más frecuentes habían sido IHQ y FISH, pero en 2011 se aprobó el primer CDx basado en PCR, denominado cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test (de Roche Molecular System), indicado para la detección de la mutación BRAF V600E en pacientes con melanoma candidatos a vemurafenib. Después se aproba- ron otros CDx basados en NGS: el primero fue FoundationFocus CDxBRCA Assay (de Foundation Medicine) para la detección de BRCA1 y BRCA2 en pacientes con cáncer de ovario posibles candidatas a rucaparib. En la Tabla 6 se presentan los CDx aprobados por la FDA para biomarcado- res, fármacos e indicaciones clínicas concretas. Tabla 6. CDx aprobados por la FDA CDx Indicación clínica Fármaco Biomarcador Enlace / Fecha FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc.) NSCLC - Tejido Xalkori (crizotinib) ALK reordenamientos P170019 (11/30/2017) FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc.) NSCLC - Tejido Alecensa (alectinib) ALK reordenamientos P170019 (11/30/2017) FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc.) NSCLC - Tejido Zykadia (ceritinib) ALK reordenamientos P170019 (11/30/2017) FoundationOne Liquid CDx (Foundation Medicine, Inc.) NSCLC - Plasma Alecensa (alectinib) ALK reordenamientos P200006 (10/26/2020) INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 168 Tabla 6. CDx aprobados por la FDA CDx Indicación clínica Fármaco Biomarcador Enlace / Fecha FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc.) NSCLC - Tejido Rozlytrek (entrectinib) ROS1 fusiones P170019/S014 (06/07/2022) FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc.) Tumores sólidos - Tejido Rozlytrek (entrectinib) NTRK1, NTRK2 and NTRK3 fusiones P170019/S014 (06/07/2022) FoundationOne CDx (Foundation Medicine, Inc.) Tumores sólidos - Tejido Vitrakvi (larotrectinib) NTRK1, NTRK2 and NTRK3 fusiones P170019/S017 (10/23/2020) Oncomine Dx Target Test (Life Technologies Corporation) NSCLC - Tejido Xalkori (crizotinib) ROS1 fusiones P160045 (06/22/2017) Oncomine Dx Target Test (Life Technologies Corporation) NSCLC - Tejido Retevmo (selpercatinib) RET fusiones P160045/S031 (09/21/2022) Oncomine Dx Target Test (Life Technologies Corporation) Carcinoma medular de tiroides - Tejido Retevmo (selpercatinib) RET mutaciones (SNVs, MNVs, y deleciones) P160045/S031 (09/21/2022) Oncomine Dx Target Test (Life Technologies Corporation) Cáncer de tiroides - Tejido Retevmo (selpercatinib) RET fusiones P160045/S031 (09/21/2022) Oncomine Dx Target Test (Life Technologies Corporation) NSCLC - Tejido Gavreto (pralsetinib) RET fusiones P160045/S019 (09/04/2020) Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular Inc.) NSCLC - Tejido Xalkori (crizotinib) ALK reordenamientos P110012 (08/26/2011) Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit (Abbott Molecular Inc.) NSCLC - Tejido Alunbrig (brigatinib) ALK reordenamientos P110012/S020 (05/22/2020) Ventana ALK (D5F3) CDx Assay (Ventana Medical Systems, Inc.) NSCLC - Tejido Xalkori (crizotinib) ALK expresión proteica P140025 (06/12/2015) Ventana ALK (D5F3) CDx Assay (Ventana Medical Systems, Inc.) NSCLC - Tejido Zykadia (ceritinib) ALK expresión proteica P140025/S005 (05/26/2017) Ventana ALK (D5F3) CDx Assay (Ventana Medical Systems, Inc.) NSCLC - Tejido Alecensa (alectinib) ALK expresión proteica P140025/S006 (11/06/2017) Ventana ALK (D5F3) CDx Assay (Ventana Medical Systems, Inc.) NSCLC - Tejido Lorbrena (lorlatinib) ALK expresión proteica P140025/S014 (03/03/2021) 169 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Anexo III. Estrategias de búsqueda Base de datos Ovid MEDLINE(R) ALL <1946 to November 02, 2021> 1 (gene adj2 fusion?).ti,ab,kw. 14926 2 (protein adj2 fusion).ti,ab,kw. 39223 3 (ntrk adj3 (fusion? or rearrange* or fusion?-positive)).ti,ab,kw. 363 4 (RET adj3 (fusion? or rearrange* or fusion?-positive)).ti,ab,kw. 1465 5 (Anaplastic adj5 Lymphoma adj5 Receptor adj5 Tyrosine adj5 Kinase). ti,ab,kw. 282 6 (fusion? or rearrange* or fusion?-positive).ti,ab,kw. 314871 7 5 and 6 141 8 (ALK adj3 (fusion? or rearrange* or fusion?-positive)).ti,ab,kw. 3273 9 ((ROS1 or ROS-1) adj3 (fusion? or rearrange* or fusion?-positive)).ti,ab,kw. 733 10 1 or 2 or 3 or 4 or 7 or 8 or 9 56869 11 Immunohistochemistry/ 299115 12 High-Throughput Nucleotide Sequencing/ 39237 13 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction/ 153553 14 In Situ Hybridization, Fluorescence/ 44155 15 11 or 12 or 13 or 14 506041 16 immunohistochemistry.ti,ab,kw. 205569 17 Immunohistocytochemistry.ti,ab,kw. 47 18 Immunocytochemistry.ti,ab,kw. 35817 19 (High adj4 Throughput adj4 Nucleotide adj4 Sequencing).ti,ab,kw. 65 20 (Next-Generation adj2 Sequencing).ti,ab,kw. 41716 21 (Next adj3 generation adj3 sequencing).ti,ab,kw. 42150 22 ((DNA or RNA) adj4 sequencing).ti,ab,kw. 73378 23 (Massiv* adj3 Parallel adj3 Sequencing).ti,ab,kw. 3449 24 Pyrosequencing.ti,ab,kw. 10982 25 (Reverse adj5 Transcriptase adj5 Polymerase adj5 Chain adj5 Reaction). ti,ab,kw. 26008 26 (Reverse adj3 Transcriptase adj3 PCR).ti,ab,kw. 7650 27 RT-PCR.ti,ab,kw. 146837 28 (RT adj2 PCR).ti,ab,kw. 149564 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 170 Base de datos Ovid MEDLINE(R) ALL <1946 to November 02, 2021> 29 (Fluorescen* adj3 In-Situ adj3 Hybridization).ti,ab,kw. 36000 30 (Fluorescen* adj4 In adj4 Situ adj4 Hybridization).ti,ab,kw. 36053 31 FISH.ti,ab,kw. 180068 32 16 or 17 or 18 or 19 or 20 or 21 or 22 or 23 or 24 or 25 or 26 or 27 or 28 or 29 or 30 or 31 691062 33 15 or 32 1007458 34 ((cancer or tumo?r) adj3 screening).ti,ab,kw. 47828 35 algorithm.ti,ab,kw. 213085 36 diagnostic.ti,ab,kw. 781975 37 detect*.ti,ab,kw. 2529630 38 34 or 35 or 36 or 37 3334256 39 10 and 32 and 38 342 40 limit 39 to (humans and yr=»2015 -Current») 180 41 entrectinib.ti,ab,kw. 201 42 larotrectinib.ti,ab,kw. 203 43 (TRK adj3 inhibitor?).ti,ab,kw. 503 44 41 or 42 or 43 701 45 10 and 44 271 46 limit 45 to (humans and yr=»2015 -Current») 164 Base de datos EMBASE. Noviembre, 2021 N.º Query Results #48 #11 AND #42 AND [humans]/lim AND [2015-2021]/py AND ([article]/lim OR [article in press]/lim OR [review]/lim) 208 #47 #11 AND #42 AND [humans]/lim AND [2015-2021]/py 436 #46 #11 AND #42 478 #45 #11 AND #34 AND #38 AND [humans]/lim AND [2015-2021]/py AND ([article]/lim OR [article in press]/lim OR [review]/lim) 492 #44 #11 AND #34 AND #38 AND [humans]/lim AND [2015-2021]/py 999 #43 #11 AND #34 AND #38 2357 #42 #39 OR #40 OR #41 1758 #41 (trk NEAR/3 inhibitor$):ti,ab,kw 818 171 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Base de datos EMBASE. Noviembre, 2021 N.º Query Results #40 larotrectinib:ti,ab,kw 393 #39 entrectinib:ti,ab,kw 424 #38 #35 OR #36 OR #37 1228498 #37 diagnostic:ti,ab,kw 1156955 #36 (test* NEAR/3 algorithm):ti,ab,kw 7013 #35 ((cancer OR tumo?r) NEAR/3 screen*):ti,ab,kw 72797 #34 #16 OR #33 1662029 #33 #17 OR #18 OR #19 OR #20 OR #21 OR #22 OR #23 OR #24 OR #25 OR #26 OR #27 OR #28 OR #29 OR #30 OR #31 OR #32 1084666 #32 fish:ti,ab,kw 231244 #31 (fluorescen* NEAR/4 in NEAR/4 situ NEAR/4 hybridization):ti,ab,kw 46060 #30 (fluorescen* NEAR/3 «in situ» NEAR/3 hybridization):ti,ab,kw 45969 #29 (rt NEAR/2 pcr):ti,ab,kw 216719 #28 «rt pcr»:ti,ab,kw 211862 #27 (reverse NEAR/3 transcriptase NEAR/3 pcr):ti,ab,kw 8852 #26 (reverse NEAR/5 transcriptase NEAR/5 polymerase NEAR/5 chain NEAR/5 reaction):ti,ab,kw 28981 #25 pyrosequencing:ti,ab,kw 16027 #24 (massiv* NEAR/3 parallel NEAR/3 sequenc*):ti,ab,kw 5900 #23 ((dna OR rna) NEAR/3 sequenc*):ti,ab,kw 206323 #22 (next NEAR/3 generation NEAR/3 sequenc*):ti,ab,kw 74913 #21 («next-generation» NEAR/2 sequenc*):ti,ab,kw 74287 #20 (high NEAR/4 throughput NEAR/4 nucleotide NEAR/4 sequencing):ti,ab,kw 387 #19 immunocytochemistry:ti,ab,kw 50596 #18 immunohistocytochemistry:ti,ab,kw 70 #17 immunohistochemistry:ti,ab,kw 326356 #16 #12 OR #13 OR #14 OR #15 1106596 #15 «fluorescence in situ hybridization»/exp 76791 #14 «reverse transcription polymerase chain reaction»/exp 307864 #13 «high throughput sequencing»/exp 118375 #12 «immunohistochemistry»/exp 686670 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 172 Base de datos EMBASE. Noviembre, 2021 N.º Query Results #11 #1 OR #2 OR #3 OR #4 OR #5 OR #8 OR #9 OR #10 82477 #10 ((ros1 OR «ros 1») NEAR/3 (fusion$ OR rearrange* OR «fusion positive»)):ti,ab,kw 1758 #9 (alk NEAR/3 (fusion$ OR rearrange* OR «fusion positive»)):ti,ab,kw 6659 #8 #6 AND #7 127 #7 fusion$:ti,ab,kw OR rearrange*:ti,ab,kw OR «fusion positive»:ti,ab,kw 402040 #6 (anaplastic NEAR/5 lymphoma NEAR/5 receptor NEAR/5 tyrosin$ NEAR/5 kinase$):ti,ab,kw 413 #5 (ret NEAR/3 (fusion$ OR rearrange* OR «fusion positive»)):ti,ab,kw 2448 #4 (ntrk NEAR/3 (fusion$ OR rearrange* OR «fusion positive»)):ti,ab,kw 830 #3 (protein NEAR/2 fusion):ti,ab,kw 48572 #2 (gene NEAR/2 fusion):ti,ab,kw 17714 #1 «gene fusion»/exp 18526 Base de datos PubMed (Medline). Julio, 2022 Search Query Results #1 Search: ((entrectinib[Title/Abstract]) OR (larotrectinib[Title/Abstract])) OR («tumor agnostic»[Title/Abstract] OR «tumor agnostic therapy»[Title/ Abstract] OR «tumor agnostic treatment»[Title/Abstract]) Filters: English, Spanish, Humans, from 2021 - 2022 271 #2 Search: (((NTRK[Title/Abstract]) OR (RET[Title/Abstract] OR «rearranged during transfection»[Title/Abstract]) OR (ROS1[Title/Abstract]) OR (ALK[Title/Abstract] OR «anaplastic lymphoma kinase»[Title/Abstract])) AND (fusion*[Title/Abstract] OR rearrang*[Title/Abstract])) AND ((IHQ[Title/ Abstract] OR inmunohistochemi*[Title/Abstract] OR FISH[Title/Abstract] OR «fluorescence in situ hybridization»[Title/Abstract] OR RT-PCR[Title/ Abstract] OR NGS[Title/Abstract] OR «next generation sequencing»[Title/ Abstract])) Filters: Consensus Development Conference, Consensus Development Conference, NIH, Guideline, Meta-Analysis, Practice Guideline, Randomized Controlled Trial, Review, Systematic Review, Technical Report, English, Spanish, from 2021 - 2022 70 173 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Anexo IV. Algoritmos diagnósticos para estudio de fusiones NTRK En las siguientes figuras 8 a 11 se presentan los algoritmos diagnósticos para estudios de fusiones NTRK propuestos por Lim y cols (124). Figura 8. Algoritmo propuesto para pacientes con NSCLC INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 174 Figura 9. Algoritmo propuesto para pacientes con CCR 175 BIOMARCADORES AGNÓSTICOS DE FUSIONES GÉNICAS EN ONCOLOGÍA Figura 10. Algoritmo propuesto para pacientes con sarcoma INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 176 Figura 11. Algoritmo propuesto para pacientes pediátricos