Método de amplificación genómica del virus West Nile

Abstract

Método de amplificación genómica del virus West Nile. El método se basa en la amplificación de una zona de la región 3' no codificante del virus, preferiblemente mediante PCR en Tiempo Real, gracias al uso de una pareja de cebadores mínimamente degenerados, lo que permite la amplificación de virus West Nile presentes en una muestra de cualquiera de los linajes conocidos. El fragmento amplificado se detecta, preferiblemente, con una sonda específica de la zona, también mínimamente degenerada. La pareja de cebadores degenerados elegidos, así como la sonda preferida, dan lugar a una alta sensibilidad en la detección de todos los linajes y también a una alta especificidad para el virus West Nile.

REIVINDICACIONES: 1. Un método para la detección del virus West Nile presente en una muestra que comprende las etapas de:

a) amplificar los ácidos nucleicos del virus West Nile presentes en dicha muestra utilizando como cebadores los oligonucleótidos con las secuencias:

5'-CGGAAGTYGRGTAKACGGTGCTG-3' (SEQ ID NO:1) (directo) , y 5'-CGGTWYTGAGGGCTTACRTGG-3' (SEQ ID NO:2) (inverso) ; b) detectar el fragmento de ácido nucleico amplificado,

en donde la detección del ácido nucleico amplificado indica la presencia del virus West Nile en dicha muestra.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la detección del ácido nucleico amplificado se realiza utilizando como sonda la secuencia representada por SEQ ID NO:3.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa a) de amplificación de los ácidos nucleicos del virus West Nile presentes en la muestra comprende las siguientes subetapas:

i) síntesis del cDNA a partir del RNA del virus West Nile presente en la muestra mediante una transcriptasa inversa;

ii) amplificación del cDNA mediante PCR en Tiempo Real utilizando como cebadores los oligonucleótidos de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2; y

la etapa b) de detección del fragmento de ácido nucleico amplificado se lleva a cabo mediante el uso de una sonda fluorogénica que consiste en un oligonucleótido monocatenario, complementario al fragmento de ácido nucleico amplificado en la reacción de PCR, covalentemente unido a al menos un compuesto fluorocromo.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el oligonucleótido utilizado como sonda tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el oligonucleótido utilizado como sonda está covalentemente unido en 5' a un primer compuesto fluorocromo y en 3' a un segundo compuesto fluorocromo quencher capaz de aceptar la energía emitida por el primer fluorocromo cuando ambos están unidos al oligonucleótido de SEQ ID NO:3 y de disiparla en forma de fluorescencia de mayor longitud de onda que la emitida por el primer fluorocromo.

6. Método según la reivindicación 4, en el que el oligonucleótido utilizado como sonda está covalentemente unido en 5' a un compuesto fluorocromo y en 3' a un compuesto quencher no fluorescente, capaz de aceptar la energía emitida por el compuesto fluorocromo cuando ambos están unidos al oligonucleótido de SEQ ID NO:3 y que contiene un resto MGB capaz de unirse al surco menor del DNA.

7. Método según la reivindicación 6, en el que compuesto fluorocromo unido en 5' es 6-carboxifluoresceína (FAM) .

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la amplificación de los ácidos nucleicos del Virus West Nile se lleva a cabo en presencia de una molécula de DNA útil como control interno que comprende un fragmento que puede ser amplificado mediante PCR con los cebadores de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 por comprender secuencias complementarias a ambos cebadores, situadas de manera que cada cadena de la molécula de DNA contiene la secuencia de uno de dichos cebadores y la secuencia complementaria al otro cebador, estando dichas secuencias correspondientes a los cebadores separadas por un fragmento heterólogo, exógeno tanto con respecto al genoma del virus West Nile como al genoma de la especie de la que se ha extraído la muestra en la que se desea comprobar la presencia del virus West Nile.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la molécula de DNA útil como control interno comprende la secuencia representada por SEQ ID NO:6.

10. Método según la reivindicación 9, en el que se detecta la amplificación del DNA útil como control interno mediante el uso de una sonda con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7 lleva covalentemente unido un compuesto fluorocromo distinto de cualquier fluorocromo presente en la sonda de SEQ ID NO:3.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el compuesto fluorocromo es NED.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende una etapa previa en la que se lleva a cabo una reacción de amplificación por PCR de los oligonucleótidos de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, que sirven tanto como cebadores como moldes, dando lugar a un producto de amplificación que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los ácidos nucleicos amplificados en la etapa a) del método han sido extraídos de una muestra biológica.

15. Método según la reivindicación 14, en el que la muestra biológica ha sido tomada de un ser humano.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la muestra biológica se selecciona de líquido cefalorraquídeo, muestras de órganos, muestras de sangre o suero obtenido de la misma.

17. Método según la reivindicación 14, en el que la muestra biológica procede de un artrópodo o de un ave.

18. Un kit que comprende los oligonucleótidos de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2.

19. Kit según la reivindicación 18, que adicionalmente comprende una sonda que contiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:3.

20. Kit según la reivindicación 19, en el que la sonda de SEQ ID NO:3 presenta unido al extremo 5' un compuesto fluorocromo y en 3' un compuesto quencher no fluorescente, capaz de aceptar la energía emitida por el compuesto fluorocromo cuando ambos están unidos al oligonucleótido de SEQ ID NO:3, compuesto quencher no fluorescente que contiene un resto MGB capaz de unirse al surco menor del DNA.

21. Kit según la reivindicación 20, que adicionalmente contiene una sonda con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7.

22. Kit según la reivindicación 21, en el que la sonda con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:8 lleva unido covalentemente un compuesto fluorocromo distinto de cualquier fluorocromo presente en la sonda de SEQ ID NO:3.

23. Kit según la reivindicación 21 ó 22, que adicionalmente comprende los oligonucleótidos de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5.

24. Kit según la reivindicación 21 ó 22, que adicionalmente comprende una molécula de DNA que comprende la secuencia representada por SEQ ID NO:6.

25. Kit según la reivindicación 24, en el que la molécula de DNA es un plásmido.

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