Universidad Autónoma de Madrid Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares Papel de Caveolina-1 en la biogénesis de exosomas: Implicación en la organización de la matriz extracelular y en la progresión tumoral   Lucas Albacete Albacete Madrid, 2018     Pág ina 1  Departamento de Bioquímica Facultad de Medicina Universidad Autónoma de Madrid Papel de Caveolina-1 en la biogénesis de exosomas: Implicación en la organización de la matriz extracelular y en la progresión tumoral Doctorando: Lucas Albacete Albacete, Licenciado en Bioquímica Director: Miguel Ángel del Pozo Barriuso, MD, PhD Directora: Inmaculada Navarro Lérida, PhD Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Madrid, 2018    Pág ina 2       Pág ina 3     Pág ina 4       Pág ina 5  AGRADECIMIENTOS El ser humano, al igual que la gran mayoría de las especies, es social por naturaleza 1, lo que le hace necesitar y ser necesitado de otras personas y mi caso no es una excepción. Por tanto, yo soy yo y mi circunstancia 2, es decir, toda la gente que ha estado a mi alrededor ha contribuido en mi construcción como persona y concretamente como científico, aunque la primera siempre será la prevalente. Los cimientos, por supuesto, han sido mi familia. Mi madre y mi padre que, aunque ya no están, sin sus enseñanzas nunca habría sido quien soy. Mi hermano Miguel, que no solo está en mis cimientos, sino que es la mitad de esta especie de motorcillo que hemos creado juntos y que continúa en marcha, apoyándonos el uno en el otro. De él sigo aprendiendo muchísimo día a día, lo que me hace sentir cada vez más admiración y orgullo. Mi familia nunca se ha definido por ser pequeña y dentro de ella también he encontrado amigos y pilares de sostén. Mi abuela, Pepe, Ana, Julio, Juana, Cari, Alfonso, Marisa, Paula, Itziar, Tana, Rocío. Todos ellos han estado en momentos muy felices, pero también en los malos. No puedo olvidarme de mis amigos de toda la vida, esos de los que cuando miras atrás, siempre han estado, esos que también forman parte de los cimientos. Parte de mi personalidad se formó a la vez que la suya por lo que siempre existirá ese vínculo por el que aún nos entendemos sin decir nada. La edificación continúa y nuevos peones se ponen manos a la obra. En la facultad conocí a mucha gente que puso su propio grano de arena, Ivy, Cholo, Clara, Elsa, Marta, pero, sobre todo, lo que más me hizo aprender fue llegar a Madrid de la mano de Ari y donde Nora y Adriana, a su manera especial, fueron referentes. En los 10 años que llevo ya en Madrid he conocido a verdaderos aparejadores de quien soy. Inés es una de estas personas. Nos hemos visto crecer en este Madrid convulso lleno de penas y alegrías, con cervezas, lágrimas y por supuesto y siempre, manifestaciones. Borja, compañero de plazas y reflexiones de vida. Mirar al cielo siempre es un placer contigo. Ángel, arquitecto, sin ti este edificio que hemos levantado juntos no sería el mismo y seguramente haría aguas. Te has asomado a mis cimientos y no solo los has aceptado si no que has ayudado a reforzarlos.    Pág ina 6  Al final hay que poner el tejado. La vida científica. Agradezco a Miguel Ángel la oportunidad que me dio de trabajar en este laboratorio y haberme dado todos los materiales necesarios para la construcción y a Inma como directora de obras y el imprescindible andamiaje. Como no, no puedo olvidarme de todos los que a mi alrededor edificaban sus propios proyectos y que a su vez me ayudaban con el mío. Especialmente Rober, Sergio, Alberto, Tere, Cris, Montero, Amaia, Mauro, Xenia y Sarah.      Pág ina 7  Él ya llevaba un tiempo esperándola aunque en realidad estaba acostumbrado, ella siempre fue un alma libre. Por fin apareció con un cigarro encendido como si no pasase nada. ¡Vamos, María! Encendieron el motor y soltaron amarras Cuando ya salieron de puerto pudieron izar las velas Amolla, ¡amolla! ¡La escota del génova, coño! Ya se alejaban rumbo al Cabo de Hornos y el viento de alta mar hizo escorar el barco. A lo lejos se podían escuchar los gritos ¡Manolo, por favor! Y él con una sonrisa    Pág ina 8       Pág ina 9  RESUMEN La composición y las propiedades físicas de la matriz extracelular (ECM, ExtraCellular Matrix) condicionan significativamente el comportamiento de las células presentes en los tejidos. En los últimos años, el papel de la deposición y remodelado de la ECM ha cobrado una gran importancia como elemento esencial en la progresión tumoral. Sin embargo, los mecanismos por los que las células estromales regulan la formación de la ECM son aún poco conocidos. La interacción estroma-tumor depende de manera fundamental de la comunicación celular a través de exosomas, pequeñas vesículas secretadas por la mayoría de los tipos celulares y generadas en el lumen de los cuerpos multivesiculares (MVBs, MultiVesicular Body). En este trabajo hemos mostrado que Caveolina-1 (Cav1), un organizador esencial de las membranas lipídicas, juega un papel crucial en la regulación tanto de la biogénesis de exosomas como en la selección de su cargo proteico a través de la modulación del colesterol. Mediante ensayos proteómicos, hemos podido identificar que las proteínas de matriz constituyen una de las principales familias cuya incorporación a los exosomas depende específicamente de la presencia de Cav1. En concreto, y dentro de esta familia, Tenascina-C (TnC) es uno de los representantes más relevantes. Utilizando diferentes ensayos funcionales hemos demostrado que Cav1 modula la deposición de ECM a través de exosomas, lo que promueve la invasión y migración celular. Además, hemos confirmado que los exosomas derivados de células Cav1WT, pero no los procedentes de células Cav1KO, eran capaces de nuclear ECM en nichos distantes en diferentes órganos in vivo. Estas observaciones sugieren, por tanto, el papel clave de Cav1 como regulador de los niveles de colesterol en los MVBs, lo cual condiciona la deposición de ciertos componentes de la ECM a través de su selección para la entrada en los exosomas. Todos estos datos apoyan el modelo en el que Cav1 es un regulador central de las interacciones estroma-tumor a través de la deposición de ECM mediada por exosomas.    Pág ina 10   SUMMARY The composition and physical properties of the extracellular matrix (ECM) critically influence the behavior of cells located in different tissues. Moreover, the role of the ECM deposition and remodeling in cancer has emerged as a crucial element in tumor progression. However, the molecular mechanisms by which stromal and tumour cell populations regulate ECM layering are poorly understood. Tumour-stroma interaction is critically dependent on cell-cell communication mediated by exosomes, small vesicles secreted by most cell types and generated within multivesicular bodies (MVBs). Here, we show that caveolin-1 (Cav1), an essential regulator of lipid membranes, plays a central role in modulating both exosome biogenesis and exosomal protein cargo sorting through cholesterol-dependent mechanisms. Quantitative proteomics profiling revealed that a major share of Cav1-dependent exosomal cargoes are composed of ECM proteins, one of the most important components being tenascin-C (TnC). Comparative functional assays demonstrated that Cav1 is required for fibroblast-derived exosomes to depose ECM and promote tumour cell invasiveness. Exosomes purified from Cav1WT cells, but not those from Cav1-null cells, were able to nucleate distant stromal niches in different organs in vivo. These findings suggest a key role for Cav1 as a cholesterol rheostat in MVBs, and seems to determine ECM deposition by eliciting ECM component sorting into specific exosome pools. These results, together with previous work, support a model in which Cav1 is a central regulatory hub for tumour-stroma interactions through a novel exosome-dependent ECM deposition mechanism.      Pág ina 11   ÍNDICE RESUMEN………………………………………………………………………………………9 SUMMARY………………………………………………………………...……………………10 ABREVÍATURAS………………………………………………………………………..…..….15 GLOSARIO………………………………………………………………………………….…..17 1.  INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 19  1.1  MATRIZ EXTRACELULAR .............................................................................................. 21  1.1.1 Aspectos generales. Introducción .............................................................................. 21  1.1.2 Componentes principales de la matriz extracelular .................................................. 21  1.1.3 ECM y patologías. Progresión tumoral y metástasis .................................................. 24  1.1.4 Mecanismos de biogénesis y secreción de la matriz extracelular ............................. 28  1.2  EXOSOMAS .................................................................................................................. 28  1.2.1 Definición. Antecedentes ........................................................................................... 28  1.2.2 El Sistema endosomal. Mecanismos de biogénesis de exosomas ............................. 28  1.2.3 Mecanismos de secreción de exosomas .................................................................... 32  1.2.4 Composición molecular los exosomas ....................................................................... 32  1.2.5 Funciones de los exosomas ........................................................................................ 33  1.3  CAVEOLINA‐1 REGULADOR DE MEMBRANAS LIPÍDICA .............................................. 36  1.3.1 Propiedades estructurales de Cav1 ............................................................................ 36  1.3.2 Propiedades funcionales de Cav1 .............................................................................. 38  2.  OBJETIVOS ........................................................................................................................... 43  3.  MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 47  3.1  Anticuerpos ................................................................................................................. 49  3.2  Reactivos ..................................................................................................................... 50  3.3  Cultivos celulares ........................................................................................................ 50  3.4  Silenciamiento génico y medición de la expresión génica .......................................... 51  3.5  Plásmidos de expresión ............................................................................................... 53  3.6  Extracción de proteínas y ensayos de Western Blot ................................................... 54  3.6.1 Distinción entre lisados intracelulares y extracto total de células ............................ 55  3.7  Técnicas de microscopía ............................................................................................. 55  3.7.1 Microscopía óptica de inmunofluorescencia ............................................................. 55  3.7.2 Microscopía electrónica de exosomas ....................................................................... 56  3.7.3 Tinción y cuantificación de colesterol por marcaje con filipina III ............................. 56     Pág ina 12   3.8  Aislamiento y caracterización de exosomas ............................................................... 56  3.8.1 Obtención de suero fetal bovino libre de exosomas ................................................. 58  3.8.2 Análisis de partículas mediante la utilización de la tecnología NTA .......................... 58  3.8.3 Marcaje de los exosomas con la sonda fluorescente PKH67 ..................................... 59  3.9  Estudios mediante tecnologías ómicas ....................................................................... 59  3.9.1 Análisis proteómico.................................................................................................... 59  3.9.2 Análisis de la composición de los glicerofosfolípidos de los exosomas ..................... 60  3.10  Cuantificación de las fibras de matriz extracelular ..................................................... 61  3.11  Ensayos de migración celular ...................................................................................... 62  3.11.1 Ensayos de quimiotaxis en cámaras Transwell ........................................................ 62  3.11.2 Ensayos de cierre de herida in vitro ......................................................................... 62  3.12  Ensayos de formación de esferoides .......................................................................... 63  3.12.1 Estudio de la motilidad de los esferoides ................................................................ 63  3.13  Generación de matrices derivadas de células ............................................................ 64  3.13.1 Incubación de exosomas con matrices derivadas de células ................................... 64  3.14  Ensayos de fraccionamiento en gradientes de sacarosa ............................................ 65  3.14.1 Ensayos de fraccionamiento subcelular ................................................................... 65  3.14.2 Extracción de dominios de membrana resistentes a detergente a partir de  exosomas ............................................................................................................................ 65  3.15  Análisis estadístico ...................................................................................................... 65  4.  RESULTADOS ....................................................................................................................... 67  4.1  Caveolina‐1 en la vía hacia los exosomas ................................................................... 69  4.1.1 Localización de Cav1 en la ruta del endolisosoma ..................................................... 69  4.1.2 Presencia de Cav1 en los exosomas ........................................................................... 76  4.2  La biogénesis de exosomas está regulada por Cav1 ................................................... 79  4.2.1 Implicación de Cav1 en la formación y tamaño de los exosomas ............................. 79  4.2.2 Papel de Cav1 en la formación de exosomas a través de su capacidad de modular el  colesterol en los MVBs ........................................................................................................ 81  4.2.3 La presencia de Cav1 en exosomas especifica su composición proteica ................... 87  4.3  Los exosomas juegan un papel importante en la secreción y deposición tanto de TnC  como de otros componentes de matriz tales como FN .......................................................... 96  4.4  La incorporación de TnC en exosomas se produce a través de su síntesis de novo . 103  4.5  Los exosomas generan puntos de nucleación de TnC. Implicaciones funcionales ... 108  4.5.1 Modelos bidimensionales ........................................................................................ 108  4.5.2 Modelos tridimensionales ....................................................................................... 111  4.5.3 Los exosomas Cav1WT crean nichos ricos en TnC en un modelo animal in vivo..... 114       Pág ina 13   5.  DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 119  5.1  Cav1 en la biogénesis de exosomas .......................................................................... 122  5.2  Caveolina y la regulación de la entrada de proteínas de matriz extracelular en los  exosomas .............................................................................................................................. 126  5.3  Los exosomas como vehículos para depositar y generar una matriz rica en TnC.  Implicaciones funcionales ..................................................................................................... 129  6.  CONCLUSIONES ................................................................................................................. 135  7.  BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 139  8.  MATERIAL SUPLEMENTARIO ............................................................................................. 157     Pág ina 14        Pág ina 15   ABREVÍATURAS   Proteínas, dominios y genes (Castellano, Inglés) BIRC6 Proteína baculoviral 6 con repeticiones IAP, Baculoviral IAP repeat- containing protein 6 CARM1 Metiltransferasa de arginina asociada a coactivador, Coactivator- Associated Arginine Methyltransferase Cav1 Caveolina-1 Cav2 Caveolina-2 Cav3 Caveolina-3 CH60 Chaperonina de 60 KDa CHMP Proteína cargada del cuerpo multivesicular, Charged Multivesicular Body Protein CHOP Proteína homóloga a C/EBP, C/EBP Homologous Protein Col6 Colágeno tipo VI COPII Complejo de proteínas de recubrimiento tipo II, Coat Protein II Complex CSD Dominio de andamiaje de caveolina, Caveolin-Scaffolding Domain EEA-1 Antígeno 1 del endosoma temprano, Early Endosome Antigen 1 EGF Factor de crecimiento epidérmico, Epidermal Growth Factor eNOS Óxido nítrico sintasa endotelial, endothelial Nitric Oxide Synthase ESCRT Complejos de selección endosomal requeridos para el transporte, Endosomal Sorting Complexes Required for Transport FN Fibronectina GAG Glucosaminoglicano GAPDH Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, Glycerladehyde-3- phosphate dehydrogenase GFP Proteína verde fluorescente, Green Fluorescent Protein GM130 Marcador de Golgi 130, Golgi Marker 130 Hmcn1 Hemicentina-1 HRP Peroxidasa derivada de rábano, HorseRadish Peroxidase Hrs Sustrato de tirosina kinasas regulado por el factor de crecimiento de hepatocitos, Hepatocyte growth factor-Regulated tyrosine kinase Substrate Hsp70 Proteína de shock térmico 70, Heat Shock Protein 70 Lamp1 Proteína asociada a la membrana lisosomal 1, Lysosomal Associated Membrane Protein 1 LOX Lisil Oxidasa LTBP2 Proteína de unión a factor de crecimiento de transformación latente beta 2, Latent-Transforming growth factor Beta-binding Protein 2 MHC complejo mayor de histocompatibilidad II, Mayor Histocompatibility-Complex II MMP Metaloproteinasa PGBM Heparán sulfato específico de la membrana basal, Basement Membrane-specific heparan sulfate PTRF Factor de terminación de la transcripción y la polimerasa I (Cavina-1), Polymerase I and Transcript Release Factor SCRB1 Receptor clase B1 de Scavenger, Scavenger Receptor Class B1    Pág ina 16   SMasa Esfingomielinasa SNAP Proteína de unión a NSF soluble, Soluble NSF Attachment Protein SNARE Receptor de SNAP, SNAP Receptor STAM Molécula adaptadora de la transducción de señales 1, Signal Transducing Adaptor Molecule 1 TAD Dominio de ensamblaje de tenascina, Tenascin Assembly Domain TANGO1 Transporte y organización de Golgi 1, Transport and Golgi Organization TIMP Inhibidor de metaloproteinasa tisular, Tissue Inhibitor of MetalloProteinase TnC Tenascina-C TSG101 Gen de susceptibilidad tumoral 101, Tumour Susceptibility Gene 101 UBXD1 Proteína con dominio UBX, UBX domain-containing protein VCP Proteína que contiene valoisina, Valoisin-Containing Protein Vps Selección de proteinas de vacuola, Vacuolar Protein Sorting v-Src Viral Src XBP1 Proteína de unión a X-box 1, X-box Binding Protein 1 Orgánulos y estructuras celulares (Castellano, Inglés) DRM Membrana resistente a detergentes, Detergent-Resistant Membrane ECM Matriz extracelular, ExtraCellular Matrix EE Endosoma temprano, Early Endosome ER Retículo endoplasmático, Endoplasmic Reticulum ILV Vesícula intraluminal, Intraluminal Vesicle LD Cuerpo lipídico, Lipid Droplet LE Endosoma tardío, Late Endosome MAM Membrana asociada a mitocondria, Mitochondria-Associated Membrane MVB Cuerpo multivesicular, MultiVesicular Body PM Membrana plasmática, Plasma Membrane TGN Red Trans-Golgi, Trans-Golgi Network Otras moléculas y macromoléculas orgánicas (Castellano, Inglés) ADN Ácido Desoxirribonucléico ARN Ácido ribonucléico ARNi Ácido ribonucléico de interferencia GPI Gucosilfosfatidilinositol GTP Guanosín trifosfato LBPA Ácido liso-bis-fosfatídico, LysoBisPhosphatidic Acid LDL Lipoproteína de baja densidad, Low Density Lipoprotein PA Ácido fosfatídico, Phosphatidic Acid PC Fosfatidil colina, Phophatidil Coline PE Fosfatidil etanolamina, Phosphatidil Etanolamine PG Fosfatidil glicerol, Phosphatidil Glycerol PI Fosfatidil inosito, Phosphatidil Inositol PS Fosfatidil serina, Phosphatidil Serine SM Esfingomielina, Sphingomyelin      Pág ina 17   Materiales y métodos (Castellano, Inglés) BSA Albúmina de suero bovino, Bovine Serum Albumin dmA Dimetil amilorida DMEM Medio de Eagle modificado por Dulbecco, Dulbecco´s Modified Eagle Medium. DMSO Dimetil sulfóxido, Dimethyl Sulfoxide FBS Suero fetal bovino, Fetal Bovine Serum HEPES Ácido 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonico NTA Análisis de nanopartículas por seguimiento, Nanoparticle Tracking Analysis PBS Tampón fosfato, Phosphate-Buffered Saline PFA Paraformaldehido RPMI Medio del Roswell Park Memorial Institute SDS Dodecil sulfato sódico, Sodium Dodecyl Sulfate shRNA ARN corto horiquillado, Short Haripin RNA Tipos celulares (Castellano, Inglés) DC Célula dendrítica, Dendritic Cell MEF Fibroblasto embrionario de ratón, Murine Embrionic Fibroblast TAF Fibroblasto asociado a tumor, Tumour-Associated Fibroblast Otros (Castellano, Inglés) EMT Transición epitelio-mesénquima, Epithelial-Mesenchymal Transition KO Versión Knock-Out de un gen WT Versión silvestre de un gen, Wild Type HIV Virus de la inmunodeficiencia humana, Human Immunodeficiency Virus GLOSARIO Desmoplasia: Fenómeno de producción excesiva de tejido conectivo, pobre en células y rico en matriz extracelular ISGilación: Conjugación de diferentes dianas con ISG15 (gen estimulado por interferón, Interferon Stimulated Gene 15), una proteína similar a ubiquitina. Organotropismo: Afinidad química de una sustancia, microorganismo o estructura por un tejido u órgano determinado. Palmitoilación: Unión covalente a través de enlace tioéster de moléculas de ácidos grasos, como el ácido palmítico, a una proteína en residuos, principalmente de cisteína. Prognosis: Conocimiento anticipado del progreso de una enfermedad.    Pág ina 18          Pág ina 19   1. INTRODUCCIÓN   INTRODUCCIÓN    Pág ina 20        Pág ina 21   1.1 MATRIZ EXTRACELULAR 1.1.1 Aspectos generales. Introducción Con la aparición de los organismos pluricelulares surgió la diferenciación celular, lo que permitió el desarrollo de funciones especializadas dentro del propio organismo. Sin embargo, esta habilidad también trajo consigo la pérdida de la capacidad de vivir individualmente y por tanto la necesidad de las células de encontrarse unidas y en comunicación con el resto de células. Es por ello que, junto con el desarrollo de la pluricelularidad, emergió también un ambiente conectivo entre las células conocido como matriz extracelular (ECM, ExtraCellular Matrix). La ECM es una red acelular cuya composición y complejidad ha aumentado a lo largo de la evolución, alcanzando su máximo exponente en el grupo de los vertebrados 3 4. No sólo proporciona un andamiaje físico esencial en todos sus tejidos y órganos, sino también un soporte fundamental en la regulación de multitud de procesos bioquímicos y biomecánicos que intervienen en la morfogénesis, diferenciación y homeostasis de los tejidos. Aunque fundamentalmente la ECM está compuesta por agua, proteínas, glicoproteínas y proteoglicanos, cada tejido tiene una matriz con una composición y topología propias que le proporcionan unas propiedades fisicoquímicas únicas de manera que, alteraciones en estas características pueden derivar en diversas situaciones patológicas 5 6 7 (Figura I1). La ECM es un entramado altamente dinámico que está sometido a un remodelado continuo perfectamente orquestado por parte de las células del tejido para asegurar el correcto funcionamiento del organismo 8 9 10. Esta homeostasis tisular está mediada por la secreción coordinada de metaloproteinasas (MMPs) 11 y sus inhibidores (TIMPs)  12 y la actividad de otras enzimas como lisil oxidasas (LOX)  13  14 y transglutaminasas que participan en la correcta formación de esta red tridimensional. Asimismo, una gran variedad de factores de crecimiento y citoquinas se encuentran unidos a la matriz extracelular modulando diferencialmente la adhesión y diferenciación celular, su crecimiento y migración, e interviniendo en multitud de procesos celulares, formando parte de un circuito de retroalimentación altamente controlado 15. 1.1.2 Componentes principales de la matriz extracelular La complejidad de la matriz extracelular se debe en gran medida a la enorme variedad de elementos que la componen y a su organización 7. Esta red está constituida principalmente por: 1) componentes estructurales como colágenos, (formadores de fibras) y elastina, 2) proteínas de matriz especializadas, 3) y proteoglicanos, compuestos por una proteína central a la cual se unen largas cadenas de unidades de    Pág ina 22   disacáridos repetitivos llamados glicosaminoglicanos (GAGs) formando así complejos compuestos de alto peso molecular 7. Figura I1. Aspectos generales de la ECM. (a) La composición y estructura de la ECM puede variar entre diferentes tejidos, condicionando sus propiedades fisicoquímicas (rigidez)  5 e intervenir en un gran número de funciones fisiológicas específicas en cada uno de ellos 16 17 18 19  20. (b) Composición básica de la membrana basal y matriz intersticial presente en los tejidos epiteliales. 1.1.2.1 Colágenos El colágeno es la proteína mayoritaria en los mamíferos (representa aproximadamente el 30% del peso total de proteínas) y constituye una familia que abarca 28 miembros 21. Formados por tres cadenas polipetídicas denominadas cadenas todos los colágenos contienen una estructura triple helicoidal 22 (Figura I2a). Los colágenos pueden formar diferentes tipos de complejos supramoleculares y se dividen en subfamilias en función de su capacidad para formar fibras (colágenos I, II III, V y XI), filamentos y fibrillas de anclaje (colágenos IX, XII y XIV), y redes (colágenos IV, VI, VIII y X) que contribuyen a la arquitectura de una variedad de matrices diferentes 21 22 23. Aunque los colágenos se consideran proteínas estructurales prototípicas, su función se extiende más allá a través de su interacción con los receptores celulares, lo que permite también regular el crecimiento, diferenciación y migración celular 21 24 25. Además, los colágenos pueden sufrir alteraciones en su estructura a través de su Ep ite lio Me mb ran a ba sa l Ma triz int ers tici al Colágeno IV Laminina Nidógeno Perlecano Fibroblasto Célula Inmune Proteoglicano Tenascina Fibronectina Colágeno I Componentes principales b 2-4GPa 50 15.000 1.500Rigidez (Pa): Hueso Cartílago Músculo Adiposo Epitelio Cerebro a Función: Transmisión de fuerzas Soporte físico Adipogénesis Compartimentación y homeostasis Tropismo y desarrollo de neuritas      Pág ina 23   ensamblaje, degradación, o fuerzas mecánicas que propician la exposición de sitios funcionales crípticos, ampliando así el abanico de funciones que desempeñan en el desarrollo, angiogénesis y tumorigénesis 8 26 27. 1.1.2.2 Proteínas de matriz especializadas. Glicoproteínas Las glicoproteínas no colagenosas constituyen un grupo heterogéneo de macromoléculas que desempeñan funciones fundamentales en la regulación del ensamblaje de componentes de la matriz, proporcionan centros de interacción entre las macromoléculas y juegan un papel fundamental en la interacción con las células. En la mayoría de los casos contienen la secuencia RGD (Arg-Gly-Asp) 28 de reconocimiento celular, a través de la cual interaccionan con integrinas expuestas por las células 29. En el grupo de las glicoproteínas destacan a) las lamininas, b) la fibronectina y c) las tenascinas. Lamininas Las lamininas son uno de los principales componentes de la membrana basal. Su estructura proteica está formada por tres cadenas (alfa, beta y gamma) de aminoácidos altamente glicosiladas unidas por puentes disulfuro  30. Esta familia de proteínas interacciona con diferentes componentes de la matriz, especialmente con colágeno tipo IV, proteoglicanos, entactina o nidógeno y heparina, desempeñando una función esencial en el mantenimiento de la estabilidad y en la organización de la matriz. Además, es la responsable de la interacción de la células a la membrana basal y del control de su estado de diferenciación 31. Fibronectina La Fibronectina (FN) es una glicoproteína multifuncional formada por dos cadenas polipeptídicas que se asocian por puentes disulfuro cerca del extremo carboxilo terminal formando un dímero de aproximadamente 500 KDa 32 (Figura I2a). Esta proteína muestra un carácter modular lo que permite su unión a las superficies celulares a través de integrinas 28. Además, FN es capaz de interaccionar con una serie de moléculas biológicamente relevantes entre las que destacan heparina, colágeno, gelatina, tenascina y fibrina, interfiriendo en el remodelado de la matriz extracelular mediante la regulación de la adhesión, migración, crecimiento y diferenciación celular 33  34 35. En situaciones patológicas tales como el cáncer, se ha observado que FN presenta un aumento aberrante de su expresión en diferentes etapas de la progresión tumoral que no sólo promueve el crecimiento tumoral y su capacidad invasiva sino que limita la respuesta de las células tumorales a la terapia 36 37 38.    Pág ina 24   Tenascinas Las tenascinas son una familia de glicoproteínas de matriz compuesta por cinco miembros (Tenascina-C, R, W, X e Y), siendo Tenascina-C (TnC) su principal representante 3 39. TnC es un proteína hexamérica que actúa como elemento modulador de la adhesión celular mediante la regulación de las uniones de las células a otros componentes de la ECM a través de un gran número de ligandos 39 (Figura I2a). Como ejemplo de ello, TnC posee capacidad de competir con sindecano-4, impidiendo así la adhesión celular mediada por FN concediéndole propiedades anti-adhesivas 35. Esta característica de TnC genera un impacto en las adhesiones focales de las células 40 41, induciendo la migración y movilidad celular 42. Aunque resulta fundamental durante el desarrollo embrionario, especialmente a nivel del sistema nervioso 43 44, la expresión de TnC en el adulto se reduce considerablemente, quedando prácticamente restringida a los nichos de células madre embrionarias en los que desarrolla un importante papel en proliferación, diferenciación y supervivencia 45. Sin embargo, existen situaciones patológicas como el caso del daño y reparación tisular, procesos inflamatorios crónicos y cáncer 46 en las que se produce una rápida inducción de su expresión y un incremento en su deposición. 1.1.3 ECM y patologías. Progresión tumoral y metástasis La extraordinaria importancia de la matriz extracelular y el amplio rango de sus funciones se revela en la existencia de múltiples patologías asociadas a alteraciones en sus componentes y estructura. Entre ellas se encuentran diferentes síndromes relacionados con anomalías genéticas asociadas generalmente a una carencia en la expresión y/o modificación post-traduccional de ciertas proteínas de la ECM 47 48 49. Sin embargo, también se ha observado que el aumento en la deposición de la matriz, conocido como desmoplasia o fibrosis, y que conlleva una alteración en la organización y remodelado de la misma, está vinculado con el desarrollo de un gran número de patologías 50 entre las que destacan las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. En el marco de ésta última patología, se ha visto que la matriz extracelular juega un papel crucial como modulador de la proliferación celular, la angiogénesis, así como en el proceso de migración e invasión celular que se produce durante el desarrollo de metástasis 51 52. Según la Organización Mundial de la Salud, el cáncer supone la segunda causa de muerte a nivel mundial, siendo los carcinomas (epidermoides y adenocarcinomas) el      Pág ina 25   tipo más común de cáncer, y concretamente el desarrollo de la metástasis la causa principal de muerte 53 54. Los carcinomas se forman a partir de células epiteliales que se encuentran sobre una ECM especializada que secretan ellas mismas (Figura I2b). Esta matriz está formada principalmente por colágeno amorfo tipo IV que forma estructuras en forma de red, lamininas y otras proteínas de unión y es conocida como membrana basal 55. Esta composición proporciona a la ECM una estructura compacta y poco porosa que, además de servir como sostén del epitelio, favorece el mantenimiento de la polaridad celular  56. Con la progresión tumoral se pierde esta polaridad celular, así como las adhesiones entre las células del epitelio. La pérdida de las uniones permite a las células epiteliales comenzar la invasión tumoral hacia la región intersticial del tejido a través de la degradación de la membrana basal, favorecida por un aumento en la expresión de metaloproteinasas 57 58. La matriz intersticial se encuentra bajo la membrana basal y constituye el principal tipo de ECM en tejidos conectivos 59. Es depositada por las células estromales, principalmente por los fibroblastos 60 y en condiciones fisiológicas esta matriz se compone esencialmente de colágeno fibrilar tipo I, proteoglicanos y otras glucoproteínas como TnC o FN 55. Esta composición proporciona a la matriz intersticial una consistencia más laxa que la membrana basal, lo cual permite la migración de fibroblastos y células del sistema inmune, actuando al mismo tiempo como una barrera natural para evitar la diseminación de las células del epitelio. Sin embargo, en condiciones patológicas, como sucede durante el desarrollo del cáncer, el equilibrio entre la síntesis/degradación, la deposición/organización de los componentes de la matriz se ve alterada, promoviendo la capacidad de las células tumorales de migrar a través de la matriz intersticial y de invadir localmente los vasos sanguíneos o linfáticos dando lugar a la metástasis (Figura I2b). Entre los componentes de matriz mayoritariamente alterados durante el desarrollo y progresión tumoral destaca principalmente el colágeno. Un aumento excesivo en la deposición de colágeno tipo I parece ser una característica común en la mayoría de los diferentes tipos de cáncer 8. En todos ellos, se ha descrito la presencia de un incremento de esta proteína en el microambiente tumoral dando lugar a la generación de un proceso fibrótico que tiene como consecuencia cambios en la rigidez del estroma tumoral 61 62 63 lo que resulta en un aumento de la capacidad invasiva de las células tumorales 64. Estos cambios en la rigidez del estroma son considerados como    Pág ina 26   un factor de mala prognosis en la mayoría de los tumores, especialmente en cáncer de mama 65 66. Figura I2. Principales alteraciones de la matriz extracelular durante la progresión tumoral. (a) Estructura y biología de las principales proteínas de matriz implicadas en la progresión tumoral. Colágeno. Estructura de triple α hélice indicando la acción de las proteinasas necesarias para su maduración, su secuencia aminoacídica y puntos de hidroxilación 22 13. Fibronectina. Estructura de un dímero mostrando los puntos de unión a otras proteínas de ECM y los dominios de fibronectina básicos que lo componen (FNI, II y III)  33. Tenascina-C. Estructura de un trímero que conforma la típica forma de hexabraquion. Se indican puntos de unión a otras proteínas de ECM y los dominios básicos que componen cada monómero (TAD, Tenascin Assembly Domain; EGF-L, Dominio similar a EGF, FNIII-L, Dominio similar a FNIII) 67. (b) Esquema explicativo de las principales etapas de la progresión tumoral de un carcinoma. La flecha negra indica el sentido en el que se desarrolla el proceso. La fase I muestra un epitelio normal. Posteriormente (fase II) se produce la pérdida de adhesión intercelular asociada a la transformación de las células epiteliales. La fase III se caracteriza por el inicio de la invasión tumoral para finalmente (fase IV) iniciar la migración de las células a través de la matriz intersticial hacia los vasos sanguíneos (metástasis) 51. Junto a los colágenos, otros componentes de matriz fundamentales durante la progresión tumoral son FN y TnC. En condiciones generales, un incremento en la expresión y deposición de ambas proteínas se ha descrito que favorece la angiogénesis e invasión tumoral, por lo que la inhibición de la señalización inducida por estas Globo de fibrinógeno b Fibroblasto normal Fibroblasto activado normal Fibroblasto activado asociado a tumor (TAF) Célula epitelial normal Célula tumoral Membrana basal Colágeno tipo I Fibronectina Tenascina-C Progresión tumoral I II III IV a S S Gly-X-Y OH OH OH tropocolágeno      Pág ina 27   proteínas se ha convertido en la actualidad en una posible diana para el tratamiento del cáncer 38,68,69. 1.1.3.1 Estroma tumoral. TAFs (Tumour-Associated Fibroblasts) Los tumores se encuentran rodeados por multitud de poblaciones de células no cancerosas entre las que se incluyen fibroblastos, pericitos y células del sistema inmune. Estas células del estroma participan en la generación y modificación del microambiente alrededor del tumor, esencial para favorecer la progresión del cáncer. En condiciones fisiológicas, los fibroblastos se mantienen en un estado quiescente activándose en procesos de daño tisular (fibroblastos activados normales). Si esta activación perdura en el tiempo como resultado de una situación patológica, como es el caso del cáncer, se puede volver irreversible, generando fibroblastos activados asociados a tumores (TAFs, Tumor-Associated Fibroblast)60. Estos fibroblastos se caracterizan por ser capaces de secretar elevados niveles de proteínas de matriz extracelular, influyendo en la organización y rigidez del estroma tumoral lo que promueve la capacidad de los tumores de generar metástasis 61 62 70 71. Al mismo tiempo, son capaces de secretar diversos factores de crecimiento que afectan también a la susceptibilidad, iniciación y progresión tumoral 60,72. La gran cantidad de funciones atribuidas a los TAFs, como promotores del inicio del tumor, la progresión, la transición epitelial a mesénquima, la invasión tumoral, la angiogénesis, y la resistencia a fármacos ponen de manifiesto la relevancia cada vez más creciente de esta población de células 73,74. 1.1.3.2 ECM-nicho premetastático El proceso de metástasis es sistémico de forma que, cuando un tumor se desarrolla no sólo se generan cambios locales entorno al propio tumor, sino que órganos distantes pueden verse modificados en su composición, reclutando numerosos tipos de células estromales y formando un microambiente favorable para la metástasis en los mismos, denominado “nicho premetastático” 75. Durante los últimos años se ha descrito que en la formación del nicho premetastático participan numerosas proteínas de matriz, en su conjunto conocidas como “matrisoma metastático” entre las que destacan FN, TnC, periostina, colágeno IV, lisil oxidasas y diferentes metaloproteasas de matriz 69 76 77. Aunque aún se conoce poco acerca de los mecanismos por los cuales se producen la acumulación de estas proteínas y modificaciones de microambiente en tejidos distantes al tumor primario, diferentes estudios apuntan al papel de los exosomas (vesículas nanométricas de    Pág ina 28   origen endosomal) así como de otras vesículas secretadas por parte de los tumores como elementos fundamentales en la generación de los nichos premetastáticos 78 79 80. 1.1.4 Mecanismos de biogénesis y secreción de la matriz extracelular Aunque son sintetizadas, ensambladas e inicialmente modificadas post- traduccionalmente en el retículo endoplásmico (ER, Endoplasmic Reticulum), poco se conoce acerca de los mecanismos moleculares implicados en la secreción de las diferentes proteínas de matriz 81. De ellas, la mejor estudiada ha sido el colágeno tipo I 81 82, cuyo transporte entre el retículo endoplásmico y el Golgi está mediado por el complejo de proteínas de recubrimiento tipo II (COPII, Coat Protein II Complex) 83. Desde allí, y gracias a la proteína adaptadora TANGO1 (Transport and Golgi Organization 1) el colágeno sufre una serie de modificaciones post-traduccionales que permiten su salida al espacio extracelular a través de la ruta clásica de secreción mediada por el trans-Golgi 84. Recientes estudios muestran cómo la inducción del estrés generado en el ER afecta directamente a la secreción de fibronectina y otras proteínas de matriz 85, sin embargo y a diferencia de lo que sucede con el colágeno, la eliminación de la maquinaria COPII no afecta a su secreción, sugiriendo la existencia de mecanismos de secreción alternativos a la vía clásica ER-Golgi que aún están por descubrir 86. 1.2 EXOSOMAS 1.2.1 Definición. Antecedentes Los exosomas son vesículas de tamaño nanométrico que son liberadas al medio extracelular por la gran mayoría de los tipos celulares 87, pudiendo encontrarse prácticamente en todos los fluidos de los organismos superiores 88, incluidas las plantas 89. En los años 70 90 se detectaron por primera vez como parte importante del proceso de maduración de los reticulocitos, sin embargo, no fue hasta los años 80 cuando se les atribuyó una entidad propia basada en su origen endosomal 91. En la actualidad, un gran número de investigaciones han demostrado la enorme variedad de funciones que los exosomas desempeñan gracias a su capacidad de actuar como un nuevo mecanismo de comunicación intercelular 92-95. 1.2.2 El Sistema endosomal. Mecanismos de biogénesis de exosomas El sistema del endosoma es una compleja red de compartimentos cuya función principal ha sido típicamente relacionada con la internalización y posterior degradación de elementos del espacio extracelular, así como con el reciclaje de distintos componentes de la membrana plasmática. Sin embargo, otras funciones de gran importancia han sido reveladas como la regulación y distribución del colesterol libre o la      Pág ina 29   computación de señales procedentes del exterior celular 96 97. No obstante, la biogénesis de exosomas es la más destacada y en la actualidad se encuentra en amplio estudio. Figura I3. Sistema endosomal. Esquema explicativo del tráfico intracelular observado en la ruta endosomal. En los recuadros se especifican los marcadores más comúnmente utilizados para su estudio 98. La endocitosis es el punto de partida para la entrada de distintos componentes en la ruta endosomal 98 99. Tras la internalización, las vesículas que se forman desde la membrana plasmática (PM, Plasma Membrane) son llevadas a un compartimento común conocido como endosoma temprano (EE, Early Endosome). Algunos de estos elementos pueden ser reciclados directa o indirectamente a la PM (endosomas de reciclaje) o a la red Trans-Golgi (TGN, Trans Golgi Network). La continuación en la ruta endosomal supone la maduración de los EE hacia endosomas tardíos (LE, Late Endosome). Durante este proceso, los EE pierden sus características identificativas consistentes en la presencia de túbulos membranosos que emanan de ellos, así como de sus marcadores típicos EEA1, la Rab-GTPasa Rab5 o APPL1, pasando a ser sustituidos por nuevos marcadores específicos de LE tales como LBPA (LysoBysPhosphatidic acid), CD63 y la GTPasa Rab7 100. Asociado a este proceso de maduración se produce un incremento en su tamaño y la formación de vesículas intraluminales (ILVs, IntraLuminal Vesicle) en su interior. Al conjunto del endosoma tardío con sus ILVs se le conoce con el nombre de cuerpo multivesicular (MVB, MultiVesicular Body) 101 102. Los MVBs pueden finalmente ir a degradación mediante la fusión con los lisosomas o por el contrario pueden liberar su contenido al espacio extracelular tras su fusión con la membrana plasmática, dando lugar a los exosomas (Figura I3). 1.2.2.1. Mecanismos implicados en la formación de ILVs La formación de ILVs se produce a través de la invaginación, y posterior escisión, de la bicapa lipídica de la membrana de los MVBs hacia el interior de éstos. Existe una Lisosoma Exosomas Endosoma de reciclaje TGN EE MVB/LE ER Rab11 Rab6 Rab5 EEA1 APPL1 Rab7 LBPA CD63 CD81 CD9 Hsp70 Alix TSG101 Flotilina-1 Sec61 Calreticulina Lamp1 Exterior celular    Pág ina 30   gran variedad de mecanismos capaces de regular este proceso dando lugar a diferentes tipos de ILVs con características específicas en cuanto a su tamaño y cargo. Mecanismos dependientes de ESCRT La Maquinaria ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) es uno de los mecanismos mejor descritos. Está compuesto por alrededor de 30 proteínas diferentes, altamente conservadas, que se ensamblan en 4 complejos diferentes (ESCRT-0, -I, -II y -III) (Figura I4). El reclutamiento de estos complejos se produce secuencialmente sobre la cara citoplasmática de la membrana de los MVBs (figura I4). En primer lugar, el complejo ESCRT-0 (STAM-Hrs) es ensamblado a la membrana endosomal, favoreciendo la posterior incorporación de los complejos ESCRT I y II, implicados en la deformación de esta membrana. Una vez formada la invaginación, el complejo ESCRT-III dirige la escisión dando lugar a la formación de las ILVs 103 104. Figura I4. Estructura de la maquinaria ESCRT. Ensamblaje secuencial de los componentes ESCRT-0, I, II y III en la membrana de un MVB para la formación de las ILVs. Se especifican las proteínas que componen cada complejo con su nombre dado en humanos 105 106. El silenciamiento de la expresión de diferentes componentes de la maquinaria ESCRT0 y I (tales como Hrs, Stam o TSG101) provoca una disminución en la biogénesis de exosomas afectando tanto a su tamaño como a su composición 107 108. Alternativamente a la ruta canónica mediada por los complejos ESCRT-0, -I, –II y –III, se han descrito mecanismos en los que específicamente participa alguno de estos complejos, como sucede en la ruta mediada por Alix-Sindecano-4-sintenina, en la que sólo tiene lugar el reclutamiento del complejo ESCRT-III para la escisión final de las ILVs 109 110. Mecanismos independientes de ESCRT Diferentes estudios muestran que la biogénesis de ILVs se sigue produciendo en los MVBs a pesar del silenciamiento simultáneo de diferentes subunidades claves de los cuatros complejos ESCRT, lo que indica la existencia de otros mecanismos independientes de ESCRT 108 107, entre los que destacan: ESCRT-IESCRT-0 Hrs STAM1/2 TSG101 Vps37 MVB12 Vps28 EAP45 EAP30 EAP20 CHMP6 CHMP4 Proteína ubiquitinada ESCRT-II ESCRT-III      Pág ina 31   Tetraspaninas Las tetraspaninas son una familia de proteínas integrales de membrana altamente enriquecidas en exosomas. 111. Capaces de modular la formación de microdominios de membranas, las tetraspaninas juegan un papel fundamental no sólo en la formación de las ILVs, sino en la selección de proteínas que específicamente se incorporan dentro de ellas 112 113. Entre los miembros de esta familia destacan CD9, CD63, CD37, CD81 y CD82 consideradas marcadores específicos de exosomas 114. Lípidos En función de su estructura, los lípidos proporcionan a las bicapas lipídicas unas características estructurales y biofísicas que condicionan su deformabilidad y/o curvatura 115. Recientes estudios muestran su importancia como elementos reguladores en la formación y composición específica de los exosomas 116 117. BMP (Bis Monoacylglycerol Phosphate), también conocido como LBPA, es un lípido cuya presencia está restringida a los LE 117. Se ha observado que LBPA puede jugar un papel en la deformación de la membrana durante la formación de las ILVs 118 y que además este proceso puede estar regulado a través de Alix 119. Dentro de los lípidos altamente enriquecidos en exosomas está la ceramida. Aunque sintetizada “de novo” en el ER, su principal fuente proviene de la hidrólisis de esfingomielina por la acción de las esfingomielinasas (SMasas) 120. La inhibición farmacológica de las SMasas neutrales 1 y 2 se ha visto que reduce significativamente la biogénesis de exosomas 121 122. Asimismo, esfingomielina, glicoesfingolípidos y colesterol aparecen en niveles relativamente altos en exosomas 123. Esta composición lipídica es típica de los microdominios de membrana plasmática resistentes a detergentes (DRMs, Detergent- Resistant-Membranes) 124 125 sugiriendo la posibilidad de que éstos puedan también encontrarse a nivel de los MVBs y que desarrollen un papel importante en la organización de las membranas implicadas en la formación de las ILVs 126. Esta variedad de mecanismos permite la generación de diferentes subpoblaciones de exosomas, heterogéneas tanto en su composición como en su distribución y funciones  127  128. Sin embargo, nuevos estudios serán necesarios para poder entender si mecanismos dependientes e independientes de ESCRT actúan de forma independiente o por el contrario sinérgicamente en diferentes condiciones fisiológicas y/o patológicas 128.    Pág ina 32   1.2.3 Mecanismos de secreción de exosomas Tras su maduración, los MVBs pueden fusionarse con la membrana plasmática dando lugar a la secreción de exosomas o, por el contrario, degradar su carga fusionándose a los lisosomas. Es conocido que señales como la ISGilación de proteínas desarrollan un papel en el destino de estos MVBs 129, sin embargo, aún es necesario la realización de estudios que arrojen luz sobre este aspecto. Aquellos MVBs cuyo destino final es la exocitosis son dirigidos hacia la membrana plasmática a través de un mecanismo de transporte modulado por la GTPasa Rab7. Tras el anclaje de los MVBs a la membrana en un proceso mediado por las GTPasas Rab35/Rab27 130 se produce la unión de los MVBs a la maquinaria SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive component attachment receptor). Esta unión permite la fusión directa entre ambas membranas facilitando la liberación del contenido de los MVBs al medio extracelular. La importancia del calcio en la regulación de este último paso, se refleja en la reducción en la secreción de exosomas producida por inhibición farmacológica de las bombas H+/Na+ y Na+/Ca2+ presentes en la membrana plasmática 131. 1.2.4 Composición molecular los exosomas A lo largo de los últimos años se ha realizado un gran número de estudios para evaluar el contenido presente en exosomas derivados de diferentes tipos celulares y fluidos corporales lo que ha permitido el desarrollo de bases de datos que incluyen las proteínas, ácidos nucleicos y lípidos identificados como componentes de estas nanovesículas (www.exocarta.org; 132,133; www.microvesicles.org 134). Proteínas Aunque el contenido de proteínas en los exosomas varía dependiendo del tipo celular, existe un grupo de proteínas conservado en todos los exosomas con independencia de su origen. A este grupo de proteínas características de los exosomas pertenecen algunas proteínas implicadas en el proceso de biogénesis de exosomas tales como Alix y TSG101 110. Otra clase de proteínas detectadas con frecuencia es la correspondiente a la familia Rab, GTPasas pequeñas que regulan el acoplamiento y fusión de membranas. Las anexinas (I, II, IV, V, VI, VII y X), proteínas implicadas en el mecanismo de tráfico y fusión de membranas, aparecen enriquecidas en exosomas 135  92. Un gran número de proteínas de membrana como receptores o moléculas de adhesión también están presentes en exosomas (CD63, CD81, CD9) 114. Por otro lado, se han detectado diferentes proteínas globulares localizadas en el lumen de los exosomas. Un ejemplo de ellas son proteínas del citoesqueleto, chaperonas o incluso enzimas metabólicas 127.      Pág ina 33   Lípidos Tal y como se ha comentado previamente, los lípidos han sido postulados como factores claves en los mecanismos de formación de los exosomas. El enriquecimiento en esfingomielina, fosfatidil serina y colesterol, así como en ceramida 121 117 123 116 y otros lípidos con ácidos grasos saturados provoca en los exosomas una arquitectura en su membrana que promueve el reclutamiento de proteínas específicas tales como las flotilinas, proteínas ancladas a glucosilfosfatidilinositol (GPI) o modificadas lipídicamente por ácidos grasos 126. Ácidos nucleicos El descubrimiento de ácidos nucleicos en los exosomas sugiere la posibilidad de que estas nanovesículas puedan actuar en la transferencia horizontal de información genética entre unas células y otras 136. Un alto porcentaje del material genético presente en exosomas corresponde a moléculas de ARN tales como microARNs o ARNm 137 138  139, existiendo niveles considerablemente menores de ARNs ribosómico o de transferencia. Asimismo, se ha descrito la presencia de moléculas de ADN mono y bicatenarios, y de ADN mitocondrial 140. Junto a estos ácidos nucleicos, una gran variedad de ribonucleoproteínas están presentes en exosomas, apuntando a un papel fundamental en el transporte y almacenamiento de este material genético en forma de complejos moleculares 141. 1.2.5 Funciones de los exosomas Los exosomas secretados son entidades biológicamente activas capaces de actuar como mensajeros intercelulares. Desde su descubrimiento como parte del proceso en la maduración de reticulocitos 91, y gracias a la diversidad de cargos que son capaces de transportar, los exosomas constituyen un mecanismo fundamental en la regulación de multitud de procesos tanto fisiológicos como patológicos. 1.2.5.1 Exosomas y el sistema inmune El funcionamiento del sistema inmune es un proceso finamente regulado y esencial en la defensa de nuestro organismo frente a agresiones externas, ya sean de naturaleza biológicas (agentes patógenos), físico-químicas (contaminantes o radiaciones) e internas (desarrollo de células tumorales). Alteraciones en su organización pueden dar lugar a situaciones patológicas severas como inmunodeficiencias, enfermedades autoinmunes e inflamatorias y cáncer. Parte de los procesos implicados en su regulación requieren de la comunicación intercelular a través de la sinapsis inmune y de la secreción de diferentes citoquinas, procesos en los que los exosomas juegan un papel fundamental 142. Recientes estudios muestran cómo durante la formación de la sinapsis inmunológica se produce el reclutamiento de los    Pág ina 34   MVBs hacia la zona de sinapsis inmune, provocando un aumento en la secreción de exosomas 93 y una transferencia selectiva de microRNAs desde el linfocito T a las células presentadoras de antígeno 143. Una de las primeras evidencias de la importancia de los exosomas en el sistema inmune se obtuvo al identificar el papel de estas nanovesículas como presentadoras de antígenos. La capacidad de los linfocitos B, las células dendríticas (DC, Dendritic Cell) y los macrófagos de liberar el complejo mayor de histocompatibilidad II (MHC-II) a través de exosomas permite la presentación directa de antígenos a los linfocitos T CD4+ promoviendo su activación 144. Recientes estudios muestran también cómo los exosomas procedentes tanto de células tumorales, como de diferentes organismos patógenos, contienen antígenos específicos que pueden ser endocitados por las células dendríticas para su procesamiento y su posterior presentación a los lifocitos T CD4+ citotóxicos, iniciando su activación y dando lugar a la respuesta inmunológica 145 146. En la actualidad, se está estudiando la posibilidad de utilizar los exosomas para dirigir la respuesta inmune (inmunoterapia) en enfermedades como el cáncer 142. 1.2.5.2 Exosomas en cáncer Los exosomas pueden desempeñar múltiples funciones durante la progresión del cáncer. Tienen la capacidad de modular tanto el entorno tumoral local, como a nivel sistémico para promover el crecimiento y diseminación de las células tumorales dando lugar a metástasis 147,148. Ambiente tumoral local A nivel local, el tumor primario está constituido no sólo por las células tumorales, sino por otros tipos celulares entre los que se encuentran fibroblastos, células endoteliales y células del sistema inmune. Este heterogéneo conjunto es capaz de secretar una gran variedad de exosomas, diferenciales en cuanto a su composición, permitiendo formar una compleja red de comunicación entre todas las células. Como resultado de este diálogo intercelular se producen cambios en la proliferación, migración e invasión de las células tumorales 52 79 147. La liberación de exosomas por parte de las células tumorales es muy elevado, tal y como se demuestra en diferentes estudios donde una gran cantidad de estas nanovesículas se concentra en plasma, orina, ascitis y derrames pleurales de pacientes con cáncer, considerándose la posibilidad de ser usados como biomarcadores en la progresión de esta enfermedad 149,150.      Pág ina 35   Se ha observado que los exosomas liberados por las células tumorales juegan un papel fundamental en el proceso de activación de los fibroblastos y su activación a TAFs 95. Asimismo, los exosomas tumorales tienen importantes implicaciones en el desarrollo de angiogénesis mediante la secreción de factores pro-angiogénicos o de ARNm y microARN que tienen un impacto directo en las células endoteliales 151,152. Otras funciones relacionadas con los exosomas tumorales son el remodelamiento de la ECM a través de la acción de metaloproteinasas que contienen 153 o incluso el desarrollo de quimiorresistencia 154. Metástasis Durante el proceso de metástasis, las células tumorales invaden inicialmente el tejido colindante hasta alcanzar el torrente sanguíneo o el sistema linfático desde donde podrán invadir nuevos órganos. Recientemente se ha sido descubierto la generación de nichos pre-metastáticos en aquellos órganos que van a ser posteriormente colonizados por parte de las células tumorales 75 77  78  155. En este proceso, se ha visto que los exosomas procedentes del tumor primario, a través de los vasos sanguíneos y linfáticos, son capaces de viajar hacia otros tejidos dependiendo de su organotropismo 156. Una vez alcanzado el tejido diana, los exosomas son capaces de promover cambios en la integridad de los vasos sanguíneos 157, así como en las características estructurales de la ECM de estos órganos facilitando el reclutamiento de las células tumorales y la formación de metástasis 158. 1.2.5.3 Exosomas en otras patologías Diferentes estudios muestran la relevancia de los exosomas en la modulación y desarrollo de otras patologías. Ejemplo de ello es su capacidad de actuar como mecanismo de propagación de ciertos patógenos como el virus del HIV 159. Además, los exosomas liberados por patógenos y células infectadas portan factores de virulencia específicos, como proteínas, ARNm y microRNAs, que contribuyen a propagar la infección. Aunque fundamentales en el desarrollo normal y la fisiología del sistema nervioso 160 161, los exosomas también se han descrito como elemento clave en la generación y progresión de múltiples enfermedades neurodegenerativas gracias a su capacidad de actuar como mecanismos de transporte de agentes tóxicos o de proteínas mal plegadas, tales como péptidos de β-amiloide en el caso de la enfermedad de Alzheimer 162 u oligómeros de -sinucleina en la enfermedad de Parkinson 163. Finalmente, también se ha observado la implicación de los exosomas en la formación de los huesos 164 o en patologías cardiovasculares en las que se han convertido en valiosos biomarcadores de diagnóstico y prognosis 165.    Pág ina 36   1.3 CAVEOLINA-1 REGULADOR DE MEMBRANAS LIPÍDICA Las membranas lipídicas juegan un papel crucial en la compartimentación, tanto de la célula con el medio extracelular, como de sus diferentes orgánulos con el citoplasma. Estas membranas se encuentran constituidas por una bicapa lipídica, formando estructuras altamente dinámicas que permiten el ensamblaje de proteínas esenciales para su correcto funcionamiento. La naturaleza lipídica de las membranas favorece la formación de microdominios especializados a través del empaquetamiento selectivo de colesterol y esfingolípidos fundamentales en la regulación de multitud de procesos celulares. Un ejemplo de este tipo de microdominios son las caveolas (Figura I5a), pequeñas invaginaciones de la membrana plasmática ricas en colesterol, con un tamaño comprendido entre 50 y 100 nm  166. El principal componente proteico y estructural de las caveolas es la Caveolina 167. Se han identificado 3 miembros de proteínas integrales de membrana dentro de esta familia: Caveolina-1 (Cav1), Caveolina-2 (Cav2) y Caveolina-3 (Cav3) 168. Presentan una gran similitud tanto en su secuencia de aminoácidos como en su estructura, con un peso molecular de entre 21 y 25 KDa. Cav1 y Cav2 se coexpresan en la gran mayoría de los tejidos, siendo especialmente abundantes en adipocitos, células endoteliales y fibroblastos. Por el contrario, la expresión de Cav3 se encuentra prácticamente restringida a las células musculares estriadas, así como al músculo cardiaco 166 169. Además de las Caveolinas, recientemente se han identificado otro tipo de proteínas fundamentales para la formación de las caveolas, llamadas Cavinas, con funciones adaptadoras y estabilizadoras 170,171. Esta familia se compone de 4 miembros (Cavina1-4), siendo Cavina-1 y 2 los que desarrollan un papel más importante en la regulación de las caveolas  172. Cavina-1 también llamada PTRF (Polimerase I and Trancript Release Factor) fue inicialmente descrita como factor de transcripción, sin embargo su ausencia se ha visto que también provoca el desensamblaje de las caveolas 170. Por otro lado, cavina-2 o SDPR (Serum Deprivation Protein Response) es capaz de unirse directamente a PTRF favoreciendo la generación de la curvatura de la membrana característica de este tipo de invaginaciones de membrana 173. 1.3.1 Propiedades estructurales de Cav1 Cav1 (178 residuos) es una proteína integral de membrana de 22-24 kDa que posee una estructura en forma de horquilla (Figura I5b) 174. Al encontrarse inserta en la monocapa citosólica de la membrana a través de un dominio central hidrofóbico      Pág ina 37   (residuos 102-122) deja sus extremos N- y C-terminal (residuos 1-101 y 122-178 respectivamente) situados hacia la región citoplasmática175. En la secuencia de Cav1 puede encontrarse el dominio de oligomerización (residuos 61-101) cuya principal función es la formación de homo-oligómeros de Cav1 y que incluye el dominio de andamiaje (CSD, Caveolin-Scaffolding Domain) (residuos 82-101), imprescindible para su anclaje a la membrana (figura I5b)  176. Este dominio CSD permite también la interacción de caveolina con otras proteínas sirviendo como mecanismo regulador de diferentes rutas de señalización177,178, así como elemento fundamental para su unión a colesterol 179. 1.3.1.1 Principales modificaciones post-traduccionales de Cav1 Además de su regulación a nivel transcripcional, muchas proteínas son capaces de ser modificadas post-traduccionalmente, lo que permite la regulación tanto de su localización como de sus funciones dentro de la célula (figura I5b). En el caso concreto de Cav1, esta proteína se ha descrito que sufre las siguientes modificaciones: Fosforilación Cav1 es fosforilada por la acción de diferentes tirosina kinasas tales como v-Src o Abl en el residuo de tirosina en posición14 (Y14) presente en su extremo N-terminal 180 181. Esta modificación se da en respuesta a diversos estímulos como la unión de la célula a adhesiones focales 182 participando, tanto en el mantenimiento de dominios de membrana 183 como en la endocitosis de caveolas mediada por integrinas 184. Por otro lado, Cav1 también es fosforilada en el residuo serina-80 (S80), lo cual tiene una implicación en la unión de Cav1 a la membrana del ER y en la regulación de su entrada en la vía secretora 185. Palmitoilación En el extremo C-terminal, Cav1 posee 3 cisteínas que son palmitoiladas (residuos 133,143, y 156) contribuyendo a su unión a colesterol y a su asociación con la membrana plasmática 186. Sin embargo, aunque la palmitoilación de Cav1 no es indispensable para su localización en membrana, sí que ejerce un papel importante estabilizando su estructura proteica y la formación de oligómeros 175 187. Ubiquitinación Cav1 presenta residuos de lisina susceptibles de ser modificados a través de la unión covalente de ubiquitina. En concreto, su ubiquitinación tiene lugar en los residuos presentes en el extremo amino terminal (lisinas 5, 26, 30, 39, 47 y 57), jugando un papel fundamental en el tráfico de Cav1 desde el endosoma temprano al endosoma tardío en ruta hacia su degradación lisosomal 188 189. Aunque este proceso se encuentra finamente    Pág ina 38   regulado a través de la acción de VCP (Valoisin-Containing Protein) y su cofactor UBXD1 190 aún se desconocen las señales que promueven su iniciación. Figura I5. Organización de las caveolas. (a) Microscopía electrónica (barra de escala, 100 nm) 166 y estructura de una caveola indicando la composición lipídica y proteica básica. (b) Estructura de Cav1. Se muestra topología de Cav1 en una bicapa lipídica, así como sus principales dominios y modificaciones post- traduccionales (CSD, Caveolin Scaffolding Domain). 1.3.2 Propiedades funcionales de Cav1 Además de su función como componente estructural de las células, las membranas funcionan como una entidad de computación de las señales, tanto del exterior (en el caso de la membrana plasmática), como del interior celular (en el caso de las membranas de los diferentes orgánulos). Para que esta compleja red de señalización pueda funcionar correctamente es necesario que las membranas presenten una composición y organización específica. En este sentido, Cav1 actúa como un elemento clave en la generación de microdominios de membrana, de baja fluidez y ricos en colesterol, implicados tanto en la regulación de la señalización celular como en el tráfico intracelular de membranas 166 191. Esta regulación de la arquitectura de membrana por parte de Cav1 se encuentra íntimamenta ligada a su capacidad de unir colesterol 192. Por un lado, Cav1 juega un papel fundamental como transportador de colesterol, afectando a su tráfico intracelular 193, y regulando su homeostasis dentro de la células. Por otro, alteraciones en el contenido de colesterol de las membranas influyen directamente en la distribución y organización de Cav1 194  195  196, mostrando la estrecha interrelación entre ambos componentes. En algunos casos Cav1 interviene de manera directa a través de su unión a componentes de las rutas de señalización. Tal es el caso de la inhibición de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) 177,197 o de la cascada de las kinasas Src 168. En otros muchos casos, las funciones atribuidas a Cav1 se desprenden de su papel esencial en a b Fosfolípido Colesterol Esfingolípido Cavina Caveolina Oligomerización 1 17861 102 13482N-terminal C-terminal IntramembranaCSD K86      Pág ina 39   la formación de caveolas. Estas estructuras tienen la capacidad de actuar como mecanismos para la compartimentación de proteínas de las diferentes vías de señalización, regulando espacial y temporalmente su interacción, bien mediante el secuestro o el acercamiento de los mismos 70 198 199. Finalmente, las caveolas también pueden controlar el número de proteínas de señalización que se encuentran a nivel de la PM a través de procesos de endocitosis, tanto favoreciéndola como inhibiéndola. Ejemplo de ello son rutas como las de Rac1-PAK (Rac1-p21-activated kinase), de PI3K- AKT o RAS-ERK 200 así como los niveles de integrina β1 184. Cambios en el equilibrio de los diferentes componentes de las caveolas (Cav1, PTRF y colesterol entre otros) y/o en el estado de fosforilación de Cav1, se ha visto que impactan directamente sobre el ensamblaje-desensamblaje de estos dominios de membrana 183 201 196 afectando directamente a múltiples procesos celulares170 202 203 204. 1.3.2.1 Importancia de Cav1 en los compartimentos intracelulares Aunque inicialmente la importancia de Cav1 se centraba en su señalización a nivel de la membrana plasmática, la presencia de esta proteína en diferentes orgánulos apunta a nuevas funciones de Cav1 a nivel intracelular 205. Tras la endocitosis, Cav1 es transportada hasta la ruta endosomal 188. En los endosomas, las vías de señalización que han sido endocitadas pueden continuar activas o por el contrario apagarse, lo que convierte a estas vesículas en puntos de procesamiento e integración de señales intracelulares 97. En este sentido, Cav1, al igual que ocurre a nivel de PM, es capaz de regular las cascadas de señalización mediadas por el receptor de EGF, insulina, Raf-1 o Mek-P a nivel del endosoma 206 207. Durante su síntesis, Cav1 se inserta inicialmente en la membrana del ER donde se produce la formación de oligómeros 185. Desde allí Cav1 es transportada al aparato de Golgi siguiendo la ruta exocítica hasta alcanzar la membrana plasmática 208 185. Sin embargo, diferentes estudios muestran la importancia creciente del retículo endoplásmico no sólo dentro de la ruta secretora clásica, sino como vía de conexión funcional con diferentes compartimentos 209  210. El ER es capaz de interaccionar directamente con la membrana plasmática, los endosomas, lisosomas, peroxisomas, mitocondrias y con los cuerpos lipídicos (LD, lipid droplets) sirviendo como mecanismo de intercambio de metabolitos, lípidos y proteínas 211. La presencia de Cav1 en el ER permite su transporte a través de este entramado reticular de membrana hasta diferentes localizaciones intracelulares. Uno de estos destinos son los LDs, estructuras dinámicas cuya función principal es la de acumular y distribuir lípidos en las células 211. La translocación de Cav1 a los cuerpos lipídicos actúa    Pág ina 40   como mecanismo de transporte de ácidos grasos y colesterol fundamental en procesos de regeneración hepática 212 213. En el caso de la interacción entre el ER y las mitocondrias, Cav1 participa en la formación de las conexiones de membrana que se establecen entre ambos compartimentos, conocidas como MAMs (Mitochondria-associated membranes). Desde allí, Cav1 es capaz de regular los niveles de colesterol mitocondrial, así como de una enorme variedad de proteínas implicadas en el metabolismo de esteroides y de lipoproteínas 214. La presencia de Cav1 en estos contactos ER-Mitocondria permitiría su transferencia entre ambos compartimentos. Se ha visto que en condiciones patológicas como la esteatosis hepática, se produce un aumento de la Cav1 en la membrana interna mitocondrial, donde presumiblemente actúa reduciendo el daño mitocondrial producido por el estrés oxidativo 215 216. 1.3.2.2 Papel de Cav1 en la progresión tumoral Diferentes evidencias apuntan a Cav1 como un gen supresor de tumores. Los genes que codifican para Cav1 y 2 se encuentran en el locus humano 7q31 (en el 6-A2 en ratones), región que está frecuentemente alterada en células tumorales, y que por tanto es susceptible de contener genes supresores tumorales 217. También se han encontrado mutaciones en el gen de Cav1 en el 16% de los cánceres de mama (P132L) 218 219 220, y otros muchos tumores humanos presentan niveles reducidos de Cav1. Sin embargo, a pesar de todas las evidencias que avalan el papel de Cav1 como supresor tumoral, múltiples trabajos muestran que también puede actuar como promotor tumoral. Se ha encontrado un aumento de la expresión de Cav1 en carcinomas de próstata 221, vejiga 222, de células escamosas en esófago 223 y de células no- pequeñas de pulmón (NSCLC, non-small cell lung cancer) 224. La complejidad aumenta aún más si se considera el papel de Cav1 no sólo a nivel de las células tumorales, sino en el estroma tumoral, especialmente en TAFs. En este sentido, la ausencia de Cav1 en TAFs se ha visto que influye directamente sobre el metabolismo del tumor asociándose a una mala prognosis de la enfermedad 225 226. Sin embargo, otros grupos incluidos el nuestro hemos observado que elevados niveles de Cav1 en el estroma, promueven cambios en su rigidez que favorecen la invasión tumoral 70 227. Todos estos datos apuntan por tanto a la necesidad de nuevos estudios que nos permitan entender los mecanismos a través de los cuales Cav1 es capaz de regular las diferentes etapas del desarrollo tumoral.      Pág ina 41      Pág ina 42          Pág ina 43   2. OBJETIVOS   OBJETIVOS    Pág ina 44        Pág ina 45   Caveolina-1 (Cav1) es una proteína integral de membrana implicada en un gran número de funciones derivadas de su capacidad de modular la arquitectura y composición de las bicapas lipídicas de las células 166. Su localización celular no solo se restringe a la membrana plasmática, sino que se extiende a diferentes compartimentos intracelulares 212 214, aunque aún no se conoce con claridad el papel que Cav1 juega en dichos orgánulos ni tampoco los mecanismos moleculares que regulan su tráfico a estas estructuras. Por otro lado, diferentes grupos, entre los que se incluye el nuestro 70 228 229, hemos observado el papel que puede desempeñar Cav1 en la regulación tanto de la composición como de la rigidez y remodelado de la matriz extracelular, produciendo un impacto en el desarrollo tumoral. Finalmente, recientes estudios muestran la presencia de Cav1 en exosomas apuntando a un posible papel de esta proteína como marcador de progresión tumoral en melanomas 230. A pesar de ello, aún se desconoce cómo se regula la entrada de Cav1 a los exosomas y el papel que Cav1 juega en la señalización mediada por estas nanovesículas. Por todo ello, en este trabajo se han abordado los siguientes objetivos: - Identificación de los mecanismos implicados en la incorporación de Cav1 a los exosomas mediante su endocitosis. - Estudio del papel de Cav1 en la biogénesis de exosomas. Se abordará su participación tanto en la formación de exosomas como en la selección de sus cargos. - Implicación de Cav1 en la composición y deposición de la ECM generada por fibroblastos. - Evaluación del impacto funcional de los exosomas producidos por fibroblastos (con y sin Cav1) sobre el comportamiento tumoral.    Pág ina 46          Pág ina 47   3. Materiales y métodos   MATERIALES Y MÉTODOS    Pág ina 48        Pág ina 49   3.1 Anticuerpos Los anticuerpos primarios usados en este trabajo, así como su proveedor, aparecen reflejados en la siguiente tabla: Tabla MM1. Anticuerpos primarios. Se indica la especie, casa comercial, y referencia. Anticuerpo (tipo, especie) Proveedor (referencia) anti-Alix (3A9) (monoclonal, ratón) Cell Signaling Technology (2171) anti-Cadherina (monoclonal, ratón) BD transduction (610181) anti-Calreticulina (policlonal, conejo) Abcam (ab2907) anti-Caveolina 1 (D46G3) XP® (monoclonal, conejo) Cell Signaling Technology (3267) anti-Caveolina 1 (monoclonal, ratón) Sigma Aldrich (SAB4200216) anti-CD63 (H-193) (policlonal, conejo) Santa Cruz (sc15363) anti-CD63 [NK1/C3] (monoclonal, ratón) Abcam (ab1318) anti-Fibronectina (policlonal, conejo) Sigma Aldrich (F3648) anti-Flotilina 1 (policlonal, conejo) Abcam (ab13349) anti-GM130 (monoclonal, ratón) BD transduction (610823) anti-HA (monoclonal, ratón) Roche (1158381) anti-Histona H3 (policlonal, conejo) Abcam (ab1791) anti-LBPA (6C4) (monoclonal, ratón) Echelon (Z-LBPA) anti-N-SMase (B-1) (monoclonnal, ratón) Santa Cruz (sc3777135) anti-N-SMase 2 (G-6) (monoclonnal, ratón) Santa Cruz (sc166637) anti-Periostina (policlonal, conejo) Abcam (ab14041) anti-PTRF (policlonal, conejo) Abcam (ab48824) anti-py14-Caveolina 1 (monoclonal, ratón) BD transduction (611339) anti-Tenascina C (Mtn-12) (monoclonal, rata) Sigma Aldrich (T3413) anti-Tenascina C (policlonal, conejo) Millipore (AB19011) anti-TSG101 [4A10] (monoclonal, ratón) Abcam (ab83) anti-α-Tubulina (DM1A) (monoclonal, ratón) Sigma Aldrich (T-9026)    Pág ina 50   Los anticuerpos secundarios y terciarios quedan reflejados en la siguiente tabla: Tabla MM2. Anticuerpos secundarios y terciarios. Se indica su origen, el antígeno que reconocen, el elemento con el que están conjugado y su casa comercial. Origen Antígeno Conjugación Proveedor cabra IgG ratón HRP* Thermo Fisher Scientific cabra IgG conejo HRP* Thermo Fisher Scientific cabra IgG ratón Alexa 488 Molecular Probes cabra IgG ratón Alexa 546 Molecular Probes cabra IgG ratón Alexa 647 Molecular Probes cabra IgG conejo Alexa 488 Molecular Probes cabra IgG conejo Alexa 546 Molecular Probes pollo IgG conejo Alexa 647 Molecular Probes pollo IgG rata Alexa 647 Molecular Probes cabra IgG conejo Biotina Vector Labs cabra Biotina HRP* Cell Signaling HRP: peroxidasa derivada de rábano, del inglés HorseRadish Peroxidase. La faloidina marcada con Alexa 546 ó 647 fue adquirida en Molecular Probes. 3.2 Reactivos Para la inhibición de la producción de exosomas se usó GW4869 (Calbiochem, 567715) y dimetilamilorida (Sigma, A4562). Los ensayos de invasión de celular se realizaron utilizando matrigel (BD, 354230) o colágeno tipo I de cola de rata (Corning, 354249). Hoechst 3342 fue obtenido de Sigma Aldrich. Para la inducción de la acumulación del colesterol endosomal se usó U18666A (3β)-3-[2- (Diethylamino)ethoxy]androst-5-en-17-one hydrochloride, Sigma, U3633). Los medios de cultivo empleados (DMEM y DMEM-F12 y RPMI) y el suero fetal bovino (FBS, Fetal Bovine Serum) fueron proporcionados por Gibco. Los antibióticos, penicilina y estreptomicina fueron de Bio-Whittaker. El medio de montaje de la inmunofluorescencias fue Permafluor, de Thermoscientific. 3.3 Cultivos celulares En este trabajo se han utilizado fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs, Murine Embrionic Fibroblasts) inmortalizados procedentes de ratones silvestres (WT, Wild Type) y knock-out (KO) para caveolina-1 (Cav1KO), cedidos por el Dr. Michael P.      Pág ina 51   Lisanti (Thomas Jefferson University, Filadelfia, EEUU). También se usaron líneas de MEFs WT y KO para Tenascina C (TnCWT y TnCKO respectivamente) proporcionadas por la Dra. Gertraud Orend (Université de Strasbourg, Estrasburgo, Francia). Los MEFs KO para PTRF (PTRFKO) fueron proporcionados por el Dr. Robert G. Parton (Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Australia) cuya reconstitución para la expresión de PTRF exógeno se llevó a cabo mediante infección retroviral utilizando el vector pMIGR1-PTRF (dando lugar a la línea celular PTRFKO + PTRF). Las células COS7 (células de riñón de mono verde, Cercopithecus aethiops) fueron adquiridas en ATCC (CRL-1651). La línea de fibroblastos humanos asociados a tumor (TAFs, tumor Associated Fibroblast) fue aislada a partir de tumores primarios de mama en el Instituto Europeo di Oncología (IEO, Milán) 231. Para este trabajo también se utilizaron diferentes líneas tumorales. La línea de glioblastoma humano U-251 MG fue adquirida en ATCC. Por otra parte, se usaron líneas tumorales de cáncer de mama. La línea de ratón EO771 fue adquirida en CH3 BioSystems (940001-A). Las líneas humanas MDA-MB-231 (HTB- 26), MDA-MB-468 (HTB-132), HCC1937 (CRL-2336), HCC1954 (CRL-2338) se consiguieron en ATCC. Todas las células fueron cultivadas a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% CO2 y en medio suplementado con FBS al 10% y penicilina a 100 U/ml y estreptomicina a 100 µg/ml. El origen, especie y medio de cultivo de cada una de las líneas celulares previamente citadas se recoge en la siguiente tabla: Tabla MM3. Líneas celulares utilizadas. Se indica su nombre, tipo celular de origen y especie y medio óptimo de cultivo. Línea celular Origen Especie Medio de cultivo MEF Fibroblasto embrionario Mus musculus DMEM COS7 Fibroblasto de riñón Cercopithecus aethiops DMEM U-251 MG Glioblastoma multiforme Homo sapiens DMEM EO771 Adenocarcinoma medular de mama Mus musculus RPMI MDA-MB-231 Adenocarcinoma de mama (efusión pleural) Homo sapiens DMEM/F12 MDA-MB-468 Adenocarcinoma de mama (efusión pleural) Homo sapiens DMEM/F12 HCC1937 Carcinoma ductal de mama Homo sapiens RPMI HCC1954 Carcinoma ductal de mama Homo sapiens RPMI TAF Fibroblasto asociado a tumor de mama Homo sapiens DMEM 3.4 Silenciamiento génico y medición de la expresión génica Para el silenciamiento de la expresión génica de manera transitoria se transfectaron oligonucleótidos de ARNi específicos para cada gen. Para ello, se utilizó Lipofectamine® RNAiMAX (Thermo Fisher, 13778030) y una concentración final de los    Pág ina 52   diferentes ARNi de 20nM. Se utilizó el protocolo de transfección reversa. Brevemente, la cantidad de lipofectamina y de ARNi apropiados, según las indicaciones de la casa comercial, se incubaron en Opti-MEM durante 20 minutos ajustando las cantidades en función del tamaño de placa deseado. Una vez pasado el tiempo, se añadió a la placa el número de células deseadas junto con medio de cultivo suplementado con suero bovino. Los ARNi utilizados para interferir TSG101, nSMase1/Smpd2 y nSMase2/Smpd3 de ratón fueron SMART pool ON-TARGET plus obtenidos en Dharmacon (TSG101 Cat. L-049922-01-0005; nSMAse1/Smpd2 Cat. L-044206-01- 0005; nSmase2/Smpd3 Cat. L-059400-01-0005). Para el silenciamiento de Cav1 se utilizó un ARNi de Dharmacon (secuencia diana: GAGCUUCCUGAUUGAGAUU) y un ARNesi procedente de Sigma (EHU031251). En el caso de PTRF se utilizó un SMART pool ON-TARGET plus de Dharmacon (L-040777-01-0005). Como control de transfección de ARN se usó un ARNi de secuencia truncada (“scramble”) incapaz de reconocer ningún ARNm (ON-TARGET plus non-targeting Pool, Dharmacon Cat. D- 001810-10-05). El nivel de expresión del ARNm de cada gen se analizó posteriormente mediante PCR cuantitativa a tiempo real mediante el uso de oligonucleótidos cebadores específicos del gen de interés (tabla MM4). Comprobándose también la eficiencia de silenciamiento mediante análisis por Western Blot. El silenciamiento de la expresión génica de Cav1 se realizó mediante infección lentiviral. Para ello la secuencia diana de Cav1 de ratón (nucleótidos 5´- GCTTCCTGATTGAGATTCAGT-3´ y la secuencia control 5´- GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3´ se clonaron respectivamente en el vector pLVX- shRNA2 que contiene como el reporter ZsGreen1 (Clontech). Cada uno de estos vectores fueron cotransfectados con los plasmidos pMD2.G y p8.91 en células 293T, utilizando el reactivo de transfección Fugene 6. Tras 48 horas, los sobrenadantes cargados de partículas lentivirales se filtraron y fueron añadidos a los cultivos de fibroblastos Cav1WT, en presencia de suero (10% FBS) y del polímero catiónico protamina sulfato (4 g/ml). Después de otras 48 horas, las células que expresaban GFP fueron detectadas y aisladas utilizando un separador de células MoFlo (DAKO- Cytomation). Se comprobó mediante Western Blot que los niveles de expresión de Cav1 se habían reducido de forma significativa.      Pág ina 53   Tabla MM4. Cebadores utilizados para la medición de la expresión génica Gen Especie Cebador (5'  3') Cav1 Ratón Directo CCGCGACCCCAAGCA Reverso CTGCAATCACATCTTCAAAGTC TSG101 Ratón Directo TCTAACCGTCCGTCAAACTGT Reverso TTGTACCAGTGAGGTTCACCA Hrs  Ratón Directo CGGAACGAACCCAAGTACAAG Reverso CGAACATGGCATCACTTTCCT nSMAse1/Smpd2 Ratón Directo TGGGACATCCCCTACCTGAG Reverso TAGGTGAGCGATAGCCTTTGC nSMAse2/Smpd3 Ratón Directo GGGCAGAGAATCCGCAATG Reverso GGCTGTCCTCTTAATGCTCCC Hprt1 Ratón Directo GCTGGTGAAAAGGACCTCT Reverso CACAGGACTAGAACACCTGC Gapdh Ratón Directo TGCACCACCAACRGCTAGC Reverso GGCATGGACTGTGGTCATGAG mChop Ratón Directo CCACCACACCTGAAAGCAGAA Reverso AGGTGAAAGGCAGGGACTCA XBP1 Ratón Directo AAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGC Reverso TCCTTCTGGGTAGACCTCTGGGA XBP1 Humano  Directo TTACGAGAAAACTCATGGC Reverso GGGTCCAAGTTGTCCAGAATG 3.5 Plásmidos de expresión Los plásmidos que se han usado a lo largo de este trabajo se especifican en la siguiente tabla: Tabla MM5. Plásmidos de expresión. Se indica el nombre y el tipo de vector, así como el gen de interés y la etiqueta usada para su detección. Vector Tipo de vector Gen Etiqueta pcDNA3.1 (+) de expresión Cav1 WT HA pcDNA3.1 (+) de expresión Cav1 K5-57R HA pcDNA3.1 (+) de expresión Cav1 K5-176R HA pcDNA3.1 (+) de expresión Cav1 K65-176R HA pEGFP-C1 de expresion Rab5 Q79L EGFP pRRL_CMV retroviral Cav1 WT GFP retroviral Cav1 Y14F GFP pLVX-shRNA2 lentiviral shRNA Cav1 GFP pMD2.G lentiviral VSV-G - pCMV-dR8.91 lentiviral gag pol tat rev - pMIGR1 retroviral Ptrf GFP    Pág ina 54   3.6 Extracción de proteínas y ensayos de Western Blot Para la obtención de los extractos celulares, las células se lavaron en tampón fosfato (PBS, Phosphate-Buffered Saline), procediéndose a su ruptura mediante el uso de un tampón de lisis RIPA (10mM Tris-HCl, pH 7,2, 1% Triton X-100, 0,5% deoxicolato sódico, 0,1% dodecil sulfato de sodio (SDS), 150 mM NaCl y 5 mM EDTA) en presencia de inhibidores de proteasas (1 µg/ml aprotinina y 1µg/ml leupeptina) y fosfatasas (0,5mM Na3VO4, 20mM NaF). La cuantificación de la concentración de proteínas se realizó empleando el método de Bradford. Entre 20 y 40 µg de proteína se desnaturalizaron a 95ºC en tampón Laemmli (60mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 0,01% azul de bromofenol). En el caso de los exosomas, se analizaron las proteínas procedentes del mismo número de partículas (determinado mediante la cuantificación de los exosomas por la tecnología NTA, Nanoparticle Tracking Analysis) mediante lisis en tampón de Laemmli. Para el análisis de su composición proteica, las muestras se cargaron en geles de poliacrilamida (con porcentaje de acrilamida en función del peso molecular de la proteína a analizar) en condiciones desnaturalizantes (presencia de dodecil sulato sódico SDS) y se separaron mediante electroforesis en Posteriormente, las proteínas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa (Hybond C, Amersham Pharmacia, Biotech). Las membranas se bloquearon durante 1 hora en una solución de leche desnatada en polvo al 5% en PBS. En el caso de necesitar la detección posterior de proteínas fosforiladas, el bloqueo se realizó en albúmina de suero bovino (BSA, Bovine Serum Albumin) al 5% en PBS. A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4ºC con los anticuerpos primarios deseados en PBS a una concentración aproximada de 0,1 – 1 µg/ml. Después de lavar las membranas con PBS o PBS-Tween se incubaron de nuevo con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa HRP (a una concentración de 0,2 µg/ml) durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras lavar nuevamente las membranas con PBS o PBS-Tween las proteínas se visualizaron mediante una reacción de quimioluminiscencia usando los reactivos ECLTM (GE Healthcare-Amersham). En caso necesario de amplificar la señal a detectar se usaron anticuerpos secundarios conjugados con biotina y posteriormente se incubaron las membranas con un anticuerpo terciario anti-biotina conjugado con peroxidasa HRP. El análisis densitométrico se realizó utilizando el software Image J. Las unidades expresadas son arbitrarias.      Pág ina 55   3.6.1 Distinción entre lisados intracelulares y extracto total de células Los lisados intracelulares corresponden al conjunto de proteínas que se encuentran específicamente presentes dentro de las células. Para su extracción, las células adheridas a las placas de cultivos se incubaron con una proteasa (tripsina al 0,25%) a 37ºC durante 5 minutos separándolas por tanto de cualquier proteína presente en el espacio extracelular. Las células despegadas se lavaron con PBS y se lisaron en RIPA para su posterior análisis. Los lisados o extractos totales consisten en las proteínas presentes tanto intracelularmente como aquellas presentes en la matriz extracelular donde las células se encuentran adheridas. Para su obtención, las células se lisaron directamente sobre la placa utilizando RIPA y llevando a cabo la extracción mediante levantamiento utilizando un raspador. 3.7 Técnicas de microscopía 3.7.1 Microscopía óptica de inmunofluorescencia Inmunofluorescencia de células Las células crecidas sobre cubreobjetos de cristal se fijaron en paraformaldehido al 4% a 37ºC durante 15 minutos. Tras varios lavados en PBS se procedió a su permeabilización con un tampón PBS en presencia de Triton X-100 al 0.1% a 4ºC durante 5 minutos realizándose posteriormente la incubación con BSA al 2% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tanto los anticuerpos primarios como los secundarios (a una concentración de 1-2 µg/ml) se incubaron durante 1 hora en PBS en presencia de BSA al 0,1%. Para la tinción de los núcleos, junto con los anticuerpos secundarios se llevó a cabo la incubación de las muestras con los marcadores de ADN DAPI o Hoechst 33342 1 µg/ml. Para llevar a cabo el marcaje del citoesqueleto de actina se procedió a la incubación con el marcador de actina faloidina. Finalmente, las muestras se montaron con medio de montaje para su conservación y posterior análisis. Inmunofluorescencia de tejidos Los órganos extraídos se fijaron en paraformaldehido al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se sumergieron consecutivamente en soluciones de sacarosa al 15% y 30% en PBS hasta conseguir la pérdida de la flotación del órgano en estudio. Finalmente, los tejidos se embebieron en medio OCT (Tissue- Tek) y se guardaron a -80ºC para la realización de cortes utilizando un criostato motorizado. Las tinciones se realizan en cortes de 20 µm de grosor. Para el bloqueo y posterior permeabilización las muestras se incubaron en PBS en preencia de suero al 4% correspondiente a la especie animal deseada (pollo o cabra, según el origen de los anticuerpos secundarios) y Triton X-100 al 0,3%. Tras 1 hora de incubación, los anticuerpos primarios a una concentración de 1-2 µg/ml fueron añadidos se incubaron    Pág ina 56   durante la noche a 4ºC. Tras un lavado exhaustivo de las muestras con PBS en presencia deTriton X-100 al 0,15% y se realizó la incubación con el anticuerpo secundario durante 3 horas a 4ºC en ese mismo tampón. Finalmente, las muestras lavaron abundantemente con PBS y se montaron sobre un portaobjetos con medio de montaje para su conservación y posterior análisis. 3.7.2 Microscopía electrónica de exosomas Para la visualización de exosomas por microscopía electrónica de transmisión se siguió el protocolo previamente descrito 232. La suspensión de exosomas se fijó en paraformaldehido al 2% depositándose sobre una rejilla recubierta de Formvar/carbono durante 20 minutos. Tras el lavado de las gradillas en PBS, éstas se transfirieron a glutaraldehido al 1% durante 5 minutos. A continuación, las rejillas se lavaron en agua destilada abundatemente y las muestras se contrastaron mediante tinción con acetato de uranilo al 2%. 3.7.3 Tinción y cuantificación de colesterol por marcaje con filipina III Las células se sembraron sobre cubreobjetos de cristal y se fijaron 24 horas después con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos a 37ºC. La permeabilización se realizó con una solución de BSA al 0,2% y de saponina al 0,1% (detergente) en PBS durante 30 minutos (Solución de Permeabilización, SP). Tanto los anticuerpos primarios como los secundarios conjugados con fluorescencia se incubaron durante 1 hora y fueron posteriormente lavados 3 veces con SP. A continuación, se llevó a cabo la incubación de las muestras con filipina III (50 µg/ml en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Una vez lavadas las muestras en PBS, éstas se montaron sobre portaobjetos utilizando medio de montaje para su conservación. Para el estudio de los niveles de colesterol en los cuerpos multivesiculares, se usó como marcador un anticuerpo primario dirigido frente el lípido LBPA. A través del programa Fiji (imageJ 1,50e x64, http://fiji.sc/) se procedió a cuantificar la intensidad media y total de filipina III que se encuentra específicamente colocalizando con la tinción de LBPA a nivel multivesicular, así como el área de todas las partículas positivas para LBPA con un área mayor de 0,25 µm2. 3.8 Aislamiento y caracterización de exosomas Los exosomas fueron purificados a partir del medio de cultivo en el que se crecieron las células durante al menos 72h. Dicho medio contiene, a parte de los componentes descritos previamente, FBS libre de exosomas. Una vez recogido el medio de cultivo que contiene los exosomas liberados por las células se realizaron centrifugaciones diferenciales sucesivas (figura MM1). En primer lugar, se centrifugó a      Pág ina 57   300 g durante 10 minutos a 4ºC para la eliminación de aquellas células muertas o en suspensión que se encuentren en el medio. Posteriormente, se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 2000 g durante 20 minutos a 4ºC. Con esta centrifugación se consigue la eliminación de los restos celulares que queden en suspensión. A continuación, el sobrenadante se ultracentrifugó a 10.000 g durante 30 minutos a 4ºC para permitir la eliminación de los cuerpos apoptóticos, microvesículas y otros restos celulares de menor tamaño. El paso final para la sedimentación de los exosomas consistió en una última ultracentrifugación del sobrenadante obtenido anteriormente el a 110.000 g durante 70 minutos a 4ºC. El precipitado correspondiente a los exosomas purificados, se lavó mediante resuspensión con PBS y procediéndose nuevamente a su ultracentrifugación a 110.000 g durante 70 minutos a 4ºC. La muestra resultante de todos estos pasos corresponde a los exosomas totales producidos por las células 232. Figura MM1. Purificación y caracterización de exosomas. Se presentan las centrifugaciones seriadas realizadas para la purificación de exosomas, así como los principales componentes que se extraen en cada una. La tabla indica la densidad estimada de sacarosa que se obtiene tras la centrifugación del gradiente de sacarosa. Para la caracterización de los exosomas purificados se procedió a una centrifugación zonal en un gradiente de sacarosa preformado y discontinuo (figura MM1) a partir de diferentes soluciones de sacarosa a las concentraciones 2M, 1,3M, 1,16M, 0,8M, 0,5M y 0,25M preparadas en una solución de HEPES 20mM, pH 7,4. La muestra correspondiente a los exosomas purificados anteriormente se cargó en el fondo del gradiente, junto con la solución de sacarosa 2M y a continuación se fueron cargando fracciones de 2ml de cada solución de sacarosa en orden decreciente de concentración. Tras la ultracentrifugación de los gradientes a 200.000 g durante 18h a 4ºC, .se extrajeron fracciones de 1ml en tubos de cristal en un total de once fracciones y se    Pág ina 58   añadió un volumen igual de acetona, incubándose las diferentes fracciones a -20ºC durante 2 h para la permitir la precipitación de las proteínas presentes en cada fracción. Pasado ese tiempo las muestras se centrifugaron a 16.000 g durante 10 minutos a 4ºC. Los precipitados de proteínas correspondientes a cada fracción se resuspendieron en tampón de Laemmli para su posterior análisis por Western Blot. De forma alternativa, los exosomas producidos y purificados se analizaron directamente mediante Western Blot sin proceder a su separación mediante gradiente de sacarosa, y se utilizaron directamente para llevar a cabo los diferentes ensayos tal y como se especifica en cada apartado. 3.8.1 Obtención de suero fetal bovino libre de exosomas El suero sanguíneo es un fluido corporal que contiene altos niveles de exosomas. Para el estudio de los exosomas liberados por las células en cultivo los exosomas presentes en el plasma han de ser extraídos previamente. Para ello, el FBS (Gibco) es centrifugado a 110.000 g a 4ºC durante 16h. Posteriormente es filtrado y añadido al medio de cultivo 232. 3.8.2 Análisis de partículas mediante la utilización de la tecnología NTA El sistema NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) es un método de visualización y análisis de las partículas contenidas en un fluido que relaciona el movimiento browniano de cada una con su tamaño (figura MM2). Además, el algoritmo utilizado para el análisis también requiere de la temperatura y viscosidad a la que se encuentran las partículas a analizar. El resultado obtenido es una distribución de la cantidad de partículas por tamaño de entre 10 y 1000 nm. Figura MM2. Esquema explicativo del funcionamiento de la tecnología NTA. Se indica el resultado obtenido tras el análisis matemático del movimiento browiniano obtenido de 3 tipos de poblaciones de partículas que difieren en tamaño. ሺݔ, ݕሻ2 4 ൌ ܦݐ ൌ ܶܭܾ 3ߨߟ݀ Trayectoria seguida por la partícula Ecuación de Stokes-Einstein Dt: constante de difusión Kb: constante de Boltzmann T: Temperatura η: viscosidad d: diámetro de la partícula Diámetro de partícula (nm) Diámetro de partícula (nm) Diámetro de partícula (nm) Co nc en tra ció n d e p art ícu las Po bla cio ne s d e d ife ren te tam añ o d e p art ícu la      Pág ina 59   3.8.3 Marcaje de los exosomas con la sonda fluorescente PKH67 Los exosomas purificados se marcaron con la sonda verde PKH67 (Sigma MIDI67) acorde con las indicaciones del fabricante. Tras la incorporación del marcaje a los exosomas, el exceso de sonda no unido se eliminó mediante la utilización de columnas (Thermo Fisher, 4484449). 3.9 Estudios mediante tecnologías ómicas 3.9.1 Análisis proteómico Los lisados tanto celulares como los correspondiente a los exosomas producidos por dichas células se llevaron a cabo mediante el protocolo de digestión de muestras en filtro (FASP, del inglés Filter aided sample preparation protocol). Brevemente, las muestras se diluyeron en tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,5 SDS 4% y DTT 50 mM. Posteriormente se hirvieron durante 10 minutos y se centrifugaron. La concentración de proteína del sobrenadante se cuantificó con un espectrómetro de infrarrojo Direct Detect® (Millipore). Alrededor de 100µg de proteína se diluyeron en urea 8 M en Tris- HCl 100 mM pH 8,5 (tampón de desnaturalización, TD) y se cargaron sobre un filtro de centrífuga de 30 kDa (FASP Protein Digestion Kit). Posteriormente, las proteínas se alquilaron con iodoacetamida 50 mM en TD durante 20 minutos en oscuridad. La muestra se lavó tres veces en TD y posteriormente otras tres veces en bicarbonato amónico 50 mM. Las proteínas se digirieron durante la noche a 37ºC con tripsina modificada (Promega) en bicarbonato amónico 50 mM en una ratio 50:1 proteína:tripsina (peso/peso). Los péptidos resultantes se eluyeron con NaCl 0,5 M. Finalmente, se añadió ácido trifluoroacético hasta el 1 %, los péptidos se desalaron en cartuchos C18 Oasis-HLB y se secaron mediante centrifugación en vacío. Para el análisis cuantitativo, los péptidos se disolvieron en tampón de bicarbonato trietilamónico (TEAB 100 mM). La misma cantidad de péptidos de cada una de las muestras se marcó individualmente con su respectivo reactivo isobárico (iTRAQ4- plex iTRAQ Reagents Multiplex Kit, Applied Biosystems). El marcaje se realizó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la incubación, las reacciones se pararon con ácido trifluoroacético y se mezclaron las muestras adecuadamente. Finalmente, las muestras se concentraron en vacío, se desalaron sobre cartuchos C18 Oasis-HLB y se secaron como antes. Los péptidos digeridos se cargaron en un sistema de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS) y fueron analizados mediante el uso de nanocolumnas de fase reversa C-18 (75 µm I.D x 25 cm, tamaño de partícula 2 µm, Acclaim PepMap RSLC, 100 C18; Thermo Fisher Scientific) en un gradiente continuo    Pág ina 60   de acetonitrilo. Para eluir los péptidos de las nanocolumnas a un nanospray emisor se estableció un flujo de 200 nL/min para su posterior ionización en tiempo real y la fragmentación de los péptidos en un espectrómetro de masas Orbitrap QExactive (Thermo Fisher). Durante la cromatografía, se examinó el aumento del espectro de resolución-FT (resolución=70.000) seguido del espectro de masas HCD de los 20 iones más intensos. La exclusión dinámica se fijó en 40 s. Para aumentar la profundidad del análisis del proteoma, las muestras marcadas fueron también fraccionadas por cromatografía de intercambio catiónico (columnas Oasis HLB-MCX). Las fracciones se desalaron y se analizaron de la misma manera que la descrita anteriormente. Para la identificación y cuantificación de la proteína se analizaron los espectros adquiridos con el programa Proteome Discoverer (versión 1.4.0.29, Thermo Fisher Scientific) usando el algoritmo SEQUEST-HT (Thermo Fisher Scientific). Se usó la base de datos Uniprot con los siguientes parámetros: Digestión de tripsina con un máximo de 2 cortes fallidos, tolerancia de 2 Da y 0,03 Da en la masa de los iones precursores y fragmentos respectivamente, la oxidación de metioninas como modificación dinámica y carbamidometil cisteína y las modificaciones de iTRAQ en la región N-terminal y en lisinas como modificaciones fijas. Los péptidos se validaron usando el método de la ratio de probabilidad (pRatio) y el índice de falso positivo (FDR, False Discovery Rate) fue calculado mediante el uso del método de bases de datos invertidas y el método refinado con un filtro adicional de tolerancia de masa del precursor de 15 ppm. Los péptidos identificados tuvieron un FDR igual o inferior al 1%. Las proteínas se cuantificaron en base a las intensidades de los iones reporteros. Los datos cuantitativos se analizaron por QuiXoT, basado en el modelo estadístico WSPP. En este modelo, el log2 de las ratios de cada proteína se expresan en términos de variables estandarizadas como las unidades de desviación estándar en relación a sus varianzas estimadas (valores Zq). 3.9.2 Análisis de la composición de los glicerofosfolípidos de los exosomas La composición lipídica de los exosomas se analizó mediante cromatografía líquida y espectrometría de masas. Para ello, se usó una cantidad de muestra correspondiente a 2,5 mg de proteína. Antes de la extracción de lípidos, se añadieron 200 pmol de los estándares necesarios para el seguimiento (1,2-dipentadecanoyl-sn- glicero-3-fosfocolina, 1,2-dilauroyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dipalmitoyl-sn- glicero-3-fosfoinositol, 1,2-dimiristoyl-sn-glicero-3-fosfoserina, 1,2-dimiristoyl-sn-glicero- 3-fosfato, y 1-heptadecanoyl-2-araquidonoyl-3-fosfoglicerol) según establece el método de Bligh y Dyer. Tras la evaporación del solvente orgánico por acción del vacío, los      Pág ina 61   lípidos se disolvieron en 50 µl de solvente (75% de A y 25% de B) y 40 µl se inyectaron en un cromatógrafo líquido Agilent 1260 Infinity, equipado con una bomba cuaternaria Agilent G1311C y un autodispensador Agilent G1329B. La columna usada fue una FORTIS HILIC (150 x 3 mm y 3 µm de tamaño de partícula, Fortis Technologies) protegida con un cartucho Supelguard (20 mm x 2,1 mm, Sigma Aldrich). Los glicerofosfolípidos y la esfingomielina se separaron según el procedimiento descrito por Axelsen. Brevemente, la fase móvil para la separación consistió en un gradiente del solvente A (hexanos:isopropanol 30:40) y del solvente B (hexanos:isopropanol:AcONH4 20mM en agua 30:40:7). El gradiente comenzó en un 75% A hasta 5 minutos. Posteriormente se redujo a un 40% de A en 15 minutos, del 40% de A al 5% en 20 minutos y finalmente se redujo al 5% hasta 40 minutos. El flujo a través de la columna se fijó en 0,4 ml/min para entrar en un cuádruple espectrómetro de masas API2000 (Applied Biosystems). Las especies de fosfolípidos se analizaron a través de una ionización negativa en Q1. Posteriormente dichas especies se detectaron como iones [M-H]- excepto en el caso de las especies de fosfatidilcolina y la esfingomielina que se detectaron como iones [M+OAc]-. Finalmente, para la cuantificación, se integraron los picos cromatográficos de cada especie y se compararon con el área de los estándares previamente citados. 3.10 Cuantificación de las fibras de matriz extracelular La cuantificación de las fibras correspondientes a las diferentes proteínas de matriz se realizó a través de la programación de un procesamiento de imagen en Fiji (ImageJ 1,50e x64, http://fiji.sc/). Dicho procesamiento proporciona una medida aleatoria que integra tanto la densidad como la longitud de estructuras reconocidas como fibras (Nivel de “Fibrosidad”, figura MM3). Para ello, en primer lugar, se realiza una reducción del ruido de la imagen. La información estructural de los eigenvalores de la matriz Hessiana es usada para aplicar un filtro Frangi vesselness para aumentar el número de estructuras tubulares prácticamente unidimensionales (escala del filtro: σ=0.179 µm, cercana al tamaño del pixel). El resultado obtenido es una imagen en la que se encuentra incrementadas las fibras y donde cada pixel contiene un valor del nivel de “Fibrosidad”. El valor a medir se computa como la media de los niveles de Fibrosidad en toda la imagen.    Pág ina 62   Figura MM3. Método de cuantificación de fibras de matriz extracelular. Se muestra el procesamiento de las imágenes necesario para el análisis de la “fibrosidad” de la matriz extracelular. “a” indica la imagen original obtenida, mientras que “c” representa la imagen final en la que se realiza la cuantificación. 3.11 Ensayos de migración celular 3.11.1 Ensayos de quimiotaxis en cámaras Transwell Se utilizaron cámaras Transwell con membrana de policarbonato con tamaño de poro de 8 m (Corning Costar Corp.). Las membranas fueron tapizadas con 5 g/ml de FN. Las células fueron privadas de suero durante las 24 horas prevías al experimento. Después de tripsinizar las células, se resuspendieron y se añadieron a la parte superior del filtro de las cámaras. Los compartimentos inferiores fueron llenados con 500 l de DMEM 10% FBS. Las cámaras fueron incubadas a 37ºC durante 24 horas para permitir la migración celular en medio con o sin exosomas. Pasado ese tiempo, las membranas fueron lavadas con PBS, fijadas con metanol a -20ºC durante 20 minutos y teñidas con cristal violeta durante 30 minutos a temperatura ambiente para marcar las células. Las células que habían migrado a la parte inferior de la membrana fueron contadas con la ayuda de un microscopio óptico. 3.11.2 Ensayos de cierre de herida in vitro Las células MDA-MB-468 se crecieron hasta confluencia en placas con fondo de cristal y fueron privadas de suero 24 horas antes de llevarse a cabo el ensayo. Las incisiones se realizaron con una punta de pipeta de 1 mm de grosor aproximadamente. El cierre de herida se monitorizó por videomicroscopía, tomando imágenes en campo claro en intervalos de 45 minutos durante el tiempo indicado. El área migrada fue calculada restando el área entre los bordes de la incisión a los distintos tiempos del área inicial medida a tiempo 0. Reducción del ruido Estructuras unidimensionales Cuantificación      Pág ina 63   3.12 Ensayos de formación de esferoides Las células tumorales se despegaron de la placa mediante tripsinización y se resuspendieron en medio con suero libre de exosomas. Cada esferoide se generó a partir de una solución de 20µl conteniendo 5.000 células, metilcelulosa a una concentración final de 0,25% (preparada a partir de una solución de metilcelulosa al 1,2% en medio sin suero) y los exosomas deseados (generalmente 1x106 partículas por esferoide). En el caso de los controles, en lugar de exosomas se añadió PBS (figura MM4). La mezcla se depositó cuidadosamente en forma de gota sobre la parte interior de la tapa de una placa de cultivo p100. Una vez colocadas todas las gotas, la placa se rellenó con 10ml de PBS y se colocó la tapa dejando por tanto que las gotas quedarán suspendias parcialmente. Tras 24 horas, y gracias a la gravedad, las células contenidas en la gota se agregaron en el fondo dando lugar a una estructura esférica denominada esferoide. Figura MM4. Formación de esferoides. Se muestra el proceso por el cual se forman los esferoides de células tumorales mediante el método de “Hanging Drop” (Gota colgante) gracias al efecto de la gravedad. 3.12.1 Estudio de la motilidad de los esferoides La capacidad migratoria de las células periféricas contenidas en los esferoides se estudió en condiciones tanto bidimesionales (2D) como tridimensionales (3D). Para la migración 2D, los esferoides generados se depositaron en placas de cultivo p96 y se cubrieron con medio de cultivo. La motilidad celular se monitorizó mediante la captura de imágenes en contraste de fases cada 10 minutos durante un tiempo total de 72 horas. En el caso del estudio de la invasión celular (ensayos tridimensionales) los esferoides generados se embebieron dentro de una matriz. Dos tipos de matrices fueron utilizadas para estos estudios. Por un lado, se generaron geles de colágeno I de 2 mg/ml de concentración siguiendo las instrucciones del fabricante (Corning, 354249). de manera que cada esferoide fue transferido a 25 µl de la solución de colágeno sobre placas IBIDI (15 µ-Slide Angiogenesis, IBIDI 81506). permitiendo su polimerización a 37ºC durante 30 min. En el caso del matrigel (BD, 354230), los esferoides fueron    Pág ina 64   transferidos a 25 µl de matrigel diluido en medio libre de exosomas en proporción 1:1 permitiendo su polimerización a 37ºC durante 30 min. Una vez obtenidos los esferoides en el interior de cada uno de ambos tipos de matriz, se evaluó el comportamiento del mismo durante 5 días mediante monitorización utilizando microscopía de contraste de fases o mediante microscopía confocal. En todos los casos, durante el periodo de estudio, se añadió medio de cultivo nuevo cada 48 h. 3.13 Generación de matrices derivadas de células La matriz extracelular se obtuvo a partir de células en adhesión tras su cultivo durante un periodo de 8 días 70. Para ello, previamente al sembrado de las células se llevó a cabo el recubrimiento de gelatina al 1% durante 1 hora a 37ºC de la placa dónde se llevó a cabo la formación de la matriz. Posteriormente, se retiró la gelatina y tras lavar la placa con PBS se añadió glutaraldehido al 1% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Finalizada la incubación, se lavó nuevamente la placa con PBS y se realizó la incubación con glicina 1M durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavó la placa con PBS y se realizó un último lavado de la misma con DMEM sin suplementar. Una vez generado preparado el soporte las células se sembraron sobre el mismo a la confluencia deseada permitiendo su crecimiento durante los siguientes 8 días. Cada 48 horas se llevó a cabo el cambio de medio añadiendo al mismo ácido ascórbico a una concentración final de 50 µg/ml. Transcurrido este periodo, las células se eliminaron mediante lisis alcalina en presencia de detergentes (tampón de lisis: NH4OH a 20 mM y Triton X-100 al 0,5% en PBS). durante 5 minutos a 37ºC. A continuación, se procedió a la comprobación microscópica de la eliminación completa de las células. Tras confirmar que todas las células han desaparecido, se lavó la placa con PBS quedando exclusivamente en la placa la matriz producida por las células que estuvieron sembradas previamente. 3.13.1 Incubación de exosomas con matrices derivadas de células Una vez las matrices extracelulares se descelularizaron, se lavaron abundantemente con PBS y se extrajeron mediante raspado. A continuación, el equivalente a la matriz derivada de una placa p150 se incubó junto con los exosomas purificados previamente a 37ºC durante 1h. Transcurrido este tiempo, se procedió a dos centrifugaciones seriadas a 110.000 g durante 70 minutos para eliminar aquellos elementos de la matriz extracelular que no se hubiesen unido a los exosomas. Las muestras obtenidas se lisaron el Laemmli y analizadas por electroforesis.      Pág ina 65   3.14 Ensayos de fraccionamiento en gradientes de sacarosa 3.14.1 Ensayos de fraccionamiento subcelular Los diferentes compartimentos intracelulares se separaron mediante una centrifugación diferencial en gradiente de sacarosa. Para ello, las células se lavaron 3 veces con tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5 y MgCl2 0,5 mM. A continuación, las células se separaron de la placa de cultivo mediante raspado resuspendiéndose en Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y sacarosa 0,25 M. Las células se lisaron mediante fuerzas de cizalladura en un homogeneizador mediante la aplicación de 30 ciclos. El lisado se centrifugó a 3.000 g durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante se incorporó sobre un gradiente que abarca concentraciones de sacarosa desde 2 M hasta 0,5 M. Para la ultracentrifugación a 100.000 g durante 18 horas a 4ºC se extrajeron fracciones de 1 ml que se precipitaron con acetona en una ratio 1:1 atrás su incubación a -20ºC durante 4 horas y posterior centrifugación a 16.000 g a 4ºC. Los sobrenadantes se retiraron y los precipitados se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras se resuspendieron en tampón Laemmli y se analizaron mediante Western Blot. 3.14.2 Extracción de dominios de membrana resistentes a detergente a partir de exosomas Los exosomas procedentes de diferentes líneas celulares y/o tratamientos se lisaron en tampón MBS (MES Buffered Saline MES 25 mM pH 6,5, NaCl 0,15 M, PMSF 1mM y 1% de Triton X-100) y posteriormente se homogeneizaron mediante mecanismos de cizalla haciendo pasar la solución 10 veces a través de una jeringa de 25G (0,5x16 mm) en hielo. El lisado obtenido se llevó hasta una composición de 40% de sacarosa mediante la adición de sacarosa al 80% preparada en tampón MBS en una proporción 1:1 llevando la mezcla a volumen final de 4 ml. Posteriormente, se dispuso el gradiente mediante la adición de 4 ml de 30% sacarosa y finalmente otros 4 ml al 5% de sacarosa colocados en la parte superior. Tras la ultracentrifugación de las preparaciones a 200.000 g durante 18 horas a 4ºC se procedió a la extracción del gradiente en fracciones de 1 ml y se precipitaron con acetona a -20ºC durante 2 horas. A continuación, se centrifugaron y los precipitados obtenidos se resuspendieron en tampón Laemmli para el análisis de proteínas mediante Western Blot. 3.15 Análisis estadístico La estadística de todos los datos fue estimada mediante la prueba t de Student, utilizando GraphPad para este análisis. Los resultados fueron considerados significativos con un valor p≤0,05. Valores p<0,05 se marcaron con “*”, valores de p<0,01 con “**” y valores de p<0,001 con “***”.    Pág ina 66          Pág ina 67   4. RESULTADOS RESULTADOS    Pág ina 68        Pág ina 69   4.1 Caveolina-1 en la vía hacia los exosomas Caveolina-1 (Cav1), en el desarrollo de muchas de sus funciones, sufre un proceso de endocitosis a través de una compleja señalización intracelular 166 233 que permite su entrada en el sistema endosomal. Desde allí, Cav1 puede ser directamente reciclada a la membrana plasmática (PM, Plasma Membrane) a través de endosomas de reciclaje o bien continuar en la ruta endolisosomal a través de su tráfico desde el endosoma temprano (EE, Early Endosome) al endosoma tardío (LE, Late Endosome), también conocido como cuerpo multivesicular (MVB, MultiVesicular Body) por su contenido intraluminal, siendo su destino final el lisosoma. Sin embargo, en los últimos años, se ha observado que, de forma alternativa a su fusión lisosomal con fines degradativos, existen MVBs capaces de fusionarse directamente con la membrana plasmática permitiendo la liberación de su contenido al medio extracelular. Entender lo mecanismos implicados en el tráfico de Cav1 a través de esta nueva ruta de señalización que conecta MVB-PM y su implicación funcional ha sido uno de los principales objetivos de este trabajo. 4.1.1 Localización de Cav1 en la ruta del endolisosoma En primer lugar, se procedió a confirmar la presencia de Cav1 en condiciones basales dentro de la ruta endosomal. Para la incorporación en dicha ruta, Cav1 debe ser translocada en primer lugar a los EEs. Con el fin de caracterizar este proceso, se comprobó mediante microscopía confocal, la distribución de Cav1 endógena en células COS7 que habían sido transfectadas con una construcción capaz de expresar una forma constitutivamente activa de Rab5 fusionada a la proteína verde fluorescente GFP (Rab5Q79L-GFP) 234 (Figura R1). Rab5 es una de las principales proteínas marcadoras de los endosomas tempranos y como todas las GTPasas es capaz de ciclar entre una forma inactiva unida a GDP y una forma activa fusionada a GTP 235 cuya función es la fusión de endosomas tempranos. La mutación del residuo de glutamina 79 por uno de leucina reduce la capacidad GTPasa de Rab5, dando lugar a una forma constitutivamente activa. Esta construcción, por tanto, genera endosomas de mayor tamaño de gran utilidad para realizar estudios de inmunofluorescencia que permitan estudiar la localización de Cav1 dentro del propio endosoma (ver esquema correspondiente a la figura R1a). Además, en la maduración de los endosomas tempranos hacia el endosoma tardío se ha observado la formación de vesículas intraluminales (ILV, IntraLuminal Vesicle). La tinción de los marcadores CD63, TSG101 o LBPA (Lyso-Bis-Phosphatidic Acid), propios de MVBs e ILVs, confirman que la formación de estas vesículas comienza en endosomas positivos para Rab5 (Figura R1b). Gracias a este abordaje, se pudo confirmar que Cav1 se encuentra situada    Pág ina 70   preferencialmente en el interior de los EE, mostrando una menor colocalización con la zona de la membrana de estos endosomas (Figura R1c), sugiriendo la presencia de Cav1 a nivel de las ILVs de dichos endosomas. Finalmente, y mediante el empleo de microscopía de alta resolución se pudo demostrar la presencia de Cav1 en el interior de los MVBs mediante marcaje con CD63 (Figura R1d), observándose una distribución tanto a nivel de la membrana externa como en las ILVs presentes en los endosomas tardíos. Estos resultados nos permiten confirmar la capacidad de Cav1 de localizarse en condiciones basales dentro de la ruta endosomal, siendo específicamente incorporada en los MVBs. Figura R1. Cav1 se encuentra localizada en el sistema del endosoma en condiciones basales. (a) Esquema explicativo del mecanismo de fusión de endosomas mediado por Rab5. Rab5 es una guanosina trifosfatasa (GTPasa) que cuando está unida a GTP (forma activa) promueve la unión de los endosomas a través de un mecanismo dependiente de EEA1. Tras la fusión endosomal, Rab5 hidroliza GTP para volver de nuevo a su forma inactiva unida a GDP.      Pág ina 71   El mutante Rab5Q79L posee un cambio del residuo de Glutamina (Glu) en posición 79 por un residuo de Leucina (Leu) lo que provoca una reducción de su actividad GTPasa y por tanto permite que la proteína se mantenga en un estado activado de forma estable. Por lo tanto, la inducción de la expresión Rab5Q79L a nivel celular promueve la fusión de los endosomas tempranos induciendo la formación de endosomas de mayor tamaño que presentan vesículas intraluminales (ILVs) en su interior, de gran utilidad para realizar estudios de localización subcelular a nivel de estos compartimentos. (b) Microscopía confocal de células COS7 transfectadas con Rab5Q79L-GFP (verde) y teñidas para marcadores de vesículas intraluminales y cuerpos multivesiculares (ILVs/MVBs) CD63, TSG101 y LBPA (rojo) (barra de escala, 15 µm). Las imágenes ampliadas muestran la acumulación de los marcadores CD63, TSG101 Y LBPA en la zona intraluminal de los endosomas (barra de escala, 5 µm). (c) Distribución de Cav1 en células COS7 que expresan Rab5Q79L (barra de escala, 10 µm). Imagen ampliada de un endosoma mostrando la presencia de Cav1 en ILVs (barra de escala, 2,5 µm). (d) Colocalización entre Cav1 (rojo) y el marcador de MVBs, CD63 (verde). El panel inferior muestra una microscopía de alta resolución de un MVB (barra de escala, 1 µm). Las células se tiñeron con Hoechst en todos los casos para visualizar los núcleos. 4.1.1.1 La fosforilación de Cav1 como mecanismo de entrada en la ruta endosomal Cav1 es una proteína capaz de ser fosforilada específicamente en su residuo de tirosina en posición 14 (Y14) en respuesta a diversos estímulos, tales como el anclaje de integrinas, la estimulación por factores de crecimiento, y mediante estrés celular, lo que promueve su internalización 166 182. Con el fin de poder estudiar la importancia de la fosforilación de Cav1, como primer paso para su internalización en la vía endolisosomal decidimos emplear tres abordajes diferentes. En primer lugar, se trataron fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs, Murine Embrionic Fibroblast) con ortovanadato sódico (NaV), un inhibidor específico de proteínas tirosina fosfatasas. Mediante análisis por Western Blot se confirmó que dicho tratamiento producía un incremento significativo de la fosforilación de Cav1 correlacionándose con una mayor presencia de esta proteína en los compartimentos intracelulares correspondientes a los MVBs, tal y como se aprecia de los estudios de colocalización mediante inmunofluorescencia con el marcador LBPA (Figura R2a). Por otro lado, se ha descrito que la fosforilación de Cav1 está implicada en la internalización de Cav1/caveolas mediadas por integrinas 184 236, por tanto, como segundo abordaje se procedió a inducir la pérdida de la adhesión celular mediante la quelación de iones de Ca2+, componentes clave de las uniones celulares al sustrato, utilizando para ello EDTA. Como se observa en la Figura R2b, en presencia de concentraciones crecientes de EDTA se produjo un incremento de la fosforilación de Cav1 que resultó en un incremento de su endocitosis dentro de la ruta endosomal hacia los MVBs. En último lugar, se ha visto que PTRF/Cavina-1 es una proteína necesaria junto con Cav1 para la formación de caveolas y su ausencia provoca el desensamblaje de estas estructuras de membrana favoreciendo la endocitosis de Cav1 170. Por tanto, como tercer abordaje se procedió al silenciamiento de PTRF/Cavina-1 en MEFs usando    Pág ina 72   un RNA de interferencia (ARNi) para este gen. Mediante análisis por Western Blot se pudo observar una reducción de los niveles de expresión de PTRF asociada a un incremento en los niveles de fosforilación de Cav1 resultando nuevamente en un incremento en la internalización de Cav1 hacia los MVBs (Figura R2c). Figura R2. Cav1 es relocalizada a los endosomas tras la inducción de su fosforilación. En las imágenes de microscopía confocal se muestra la localización en MVBs (marcados con LBPA, verde) de Cav1 (rojo) en condiciones que promueven la fosforilación e internalización de Cav1 (barra de escala, 25 µm). Los núcleos se marcaron con Hoechst (azul). Las flechas blancas indican la presencia de Cav1 en la membrana plasmática mientras que las grises muestran su relocalización a los compartimentos intracelulares a nivel citoplasmático presentes en áreas próximas al núcleo. A la derecha, se muestra en cada caso un Western Blot representativo tanto de los niveles de Cav1 total cómo de su estado fosforilación en el residuo de tirosina en posición 14 mediante un anticuerpo específico. Tubulina se utilizó como control de carga. (a) Tratamiento con 500 µM de ortovanadato durante 2h. La gráfica muestra el solapamiento relativo entre Cav1 y LBPA (las barras de error indican los valores medios ± desviación estándar; n = 80 células; **      Pág ina 73   p < 0,01). (b) Tratamiento con 2 mM de EDTA durante 12 minutos. La gráfica muestra el porcentaje de solapamiento entre Cav1 y LBPA (las barras de error indican los valores medios ± desviación estándar; n = 80 células; ** p < 0,01). (c) Silenciamiento de la expresión de PTRF mediante la transfección de un ARNi específico. La gráfica muestra el porcentaje de solapamiento entre Cav1 y LBPA (las barras de error indican los valores medios ± desviación estándar). Finalmente, se llevó a cabo la reconstitución de fibroblastos derivados de ratones knock-out para Cav1 (Cav1KO) con la forma silvestre de Cav1 (Cav1 wild type, WT) o con el mutante correspondiente a la tirosina en posición 14 en el que se sustituyó dicho residuo por una fenilalalina (Cav1Y14F). Este mutante es incapaz de fosforilarse tal y como se confirmó mediante análisis por Western Blot tras la estimulación con ortovanadato sódico (Figura R3a). Se pudo observar que, además, la Cav1Y14F muestra una distribución subcelular totalmente polarizada y restringida prácticamente en su totalidad a la membrana plasmática con una reducida o casi nula capacidad de acumularse en vesículas intracelulares (Figura R3b). Estos resultados confirman la importancia de la fosforilación de Cav1 en su entrada dentro de la ruta endocítica y su posterior incorporación en los MVBs. Figura R3. La ausencia de fosforilación de Cav1 en su residuo Y14 reduce su internalización. (a) MEFs Cav1WT y MEFs Cav1KO reconstituidos mediante infección lentiviral con el vector de expresión tanto de la forma silvestre de Cav1 como del mutante incapaz de fosforilarse (Cav1Y14F) fueron cultivados en ausencia o presencia de ortovanadato (500 µM). Posteriormente se analizó mediante Western Blot la expresión tanto de Cav1 total como de Cav1 fosforilada específicamente en este residuo. (b) Análisis mediante microscopía confocal de la distribución subcelular de la forma silvestre de Cav1 (Cav1WT) y del mutante Cav1Y14F (en verde) (barra de escala, 25 µm). En las imágenes magnificadas se muestra la marcada acumulación en membrana del mutante Cav1Y14F en comparación con la distribución correspondiente a Cav1WT (barra de escala, 15 µm). Los gráficos muestran los perfiles de intensidad de fluorescencia de Cav1 (en unidades arbitrarias) a lo largo de toda célula (delimitada por la línea blanca).    Pág ina 74   4.1.1.2 Papel de la ubiquitinación de Cav1 en su entrada en de las ILVs Diferentes estudios han descrito la importancia de la ubiquitinación/deubiquitinación en el tráfico específico de proteínas en las vesículas intraluminales presentes en los MVBs como paso fundamental para ser específicamente seleccionadas para su entrada en los exosomas 92 (Figura I4). Dado que se ha descrito que Cav1 es capaz de ubiquitinarse específicamente en varios residuos de lisina presentes en su extremo amino terminal 188 (Figura R4 esquema) decidimos evaluar cómo afectaba esta ubiquitinación en su capacidad para translocarse dentro de los MVBs. Para ello, se utilizaron varios mutantes de Cav1 en los que diferentes residuos de lisina presentes tanto en el extremo amino terminal como en su extremo carboxilo fueron reemplazados por argininas (Figura R4a). Mediante cotransfección de células COS7 con cada uno de estos mutantes junto con la versión constitutivamente activa de Rab5 se estudió su colocalización por inmunofluorescencia (Figura R4c). Nuestros resultados mostraron cómo todos ellos tenían la capacidad de asociarse a los endosomas tempranos, indicando que en ninguno de estos mutantes de ubiquitinación la internalización estaba afectada. De hecho, tal y como se muestra, todos ellos tienen la capacidad de ser fosforilados correctamente (Figura R4b). Sin embargo, su distribución dentro del endosoma temprano mostraba un patrón diferencial en función de su capacidad de ubiquitinación (Figura R4c). La versión silvestre de Cav1 o el mutante cuyas lisinas amino-terminales se encuentra intactas (mutante K65-176R), pudiendo ambos ser ubiquitinados correctamente, se distribuían tanto en la membrana del endosoma como en las ILVs presentes en su interior. Sin embargo, aquellos mutantes carentes de estas lisinas del extremo amino (Cav1 K5-57R y Cav1 K5-176R) mostraban una localización restringida específicamente a la membrana endosomal (Figura R4d). Para comprobar el impacto de estas alteraciones en la distribución, se procedió a estudiar la colocalización de estos mutantes con el marcador de MVBs, CD63, observándose una correlación entre la capacidad de cada mutante de encontrarse en las ILVs y su colocalización con los cuerpos multivesiculares (Figura R5).      Pág ina 75   Figura R4. La incorporación de Cav1 en el interior del endosoma temprano está mediada por su ubiquitinación en el extremo amino-terminal. (a) Esquema explicativo de los diferentes residuos de lisina (K) susceptibles de ubiquitinación en la secuencia correspondientes a Cav1WT, así como de los mutantes de Cav1 en la que estos residuos de lisina se han sustituido por arginina (R). En todos los casos, tanto la forma silvestre de Cav1 como los diferentes mutantes de ubiquitinación, se encuentran fusionados a un péptido derivado de la hemaglutinina (HA). La capacidad de ubiquitinación se encuentra abolida en el caso de los mutantes que carecen de las lisinas de la región amino-terminal (K5-57R) o de todas las lisinas (K5-176R), pero no en el caso de las lisinas 65-176 (K65-176R) tal y como se describe en Hayer, A. et al., 2010. (b) Análisis por Western Blot de la capacidad de fosforilación de los mutantes de ubiquitinación de Cav1 inducida tras el tratamiento con ortovanadato. Como control negativo de fosforilación se incluye el mutante no fosforilable de Cav1 (Cav1 Y14F). (c) Microscopía confocal de células COS7 transfectadas con RabQ79L (verde) y los mutantes de ubiquitinación de Cav1 (rojo) (barra de escala, 10 µm). Las imágenes magnificadas muestran la distribución de los mutantes de Cav1 en endosomas representativos (barra de escala, 2,5 µm) junto con los perfiles correspondientes a la intensidad de fluorescencia (en unidades arbitrarias) de Cav1 a lo largo de la línea blanca indicada. (d) El gráfico de barras muestra el porcentaje tanto de Cav1WT como de los diferentes mutantes de Cav1 presente en el lumen de los endosomas (interior, INT: blanco) y en la membrana endosomal (membrana, MEMB: gris) expresado respecto a la intensidad total. Estos datos refuerzan la idea de un mecanismo de dos etapas en la entrada de Cav1 dentro de los MVBs. En primer lugar, la fosforilación constituye un elemento esencial para su internalización desde la membrana plasmática hasta la membrana    Pág ina 76   externa de los endosomas. Posteriormente, la ubiquitinación actuaría como un elemento de control en la entrada específica de Cav1 dentro de las ILVs del MVB. Figura R5. La progresión de Cav1 hacia el endosoma tardío es dependiente de la ubiquitinación amino-terminal. Análisis de la colocalización mediante microscopía confocal de los mutantes de Cav1 correspondientes a los diferentes residuos de lisina (rojo) con el marcador de MVBs, CD63 (verde) (barra de escala, 25 µm). El gráfico de barras muestra el porcentaje de solapamiento entre ambos marcadores (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 3, ** p < 0,01). 4.1.2 Presencia de Cav1 en los exosomas Los exosomas son nanovesículas de doble membrana lipídica que se forman por invaginación interna de la membrana externa de los endosomas tardíos y se acumulan como vesículas intraluminales dentro de los endosomas. La fusión de la membrana de los MVBs con la membrana plasmática da lugar a la secreción de los exosomas al medio extracelular, pudiendo actuar como mensajeros entre células 87. La presencia de Cav1 en las ILVs podría indicar que también se puede encontrar en dichos exosomas. Con el fin de arrojar luz sobre este aspecto, se llevó a cabo el estudio de los exosomas producidos por diferentes líneas celulares (incluyendo tanto fibroblastos como células tumorales). Para ello, se cultivaron las células durante varios días en un medio libre de exosomas (ver materiales y métodos). A continuación, se recogió el medio de cultivo y se procedió a la purificación de los exosomas mediante centrifugaciones seriadas. Posteriormente, y para su mejor caracterización se      Pág ina 77   separaron mediante gradientes de sacarosa dada la capacidad de los exosomas de flotar selectivamente a una densidad comprendida entre 1,1 y 1,2 g/ml de sacarosa 232. Finalmente, las fracciones obtenidas se analizaron por Western Blot. En todos los tipos celulares, se observó que Cav1 cofraccionaba junto con el marcador de exosomas TSG101, confirmando la presencia específica de Cav1 en exosomas (Figura R6). Figura R6. Cav1 se encuentra presente en los exosomas. Determinación de la presencia de Cav1 en exosomas derivados de diferentes líneas celulares. Western Blots representativos de la flotación de exosomas producidos tanto por fibroblastos como por diferentes líneas tumorales en gradientes de sacarosa (0,25 – 2M). Tras la centrifugación se extrajeron fracciones de 1 ml y se procedió a la precipitación de las proteínas presentes en cada una de ellas. Posteriormente, las fracciones precipitadas se cargaron en geles de electroforesis para el análisis de los niveles de Cav1 y del marcador de exosomas TSG101. Aunque la entrada de Cav1 en los MVBs puede tener diferentes orígenes, nuestros datos previos muestran que procesos que promueven la internalización de Cav1 favorecen su presencia en los MVBs. Para confirmar si esto se traduce en una mayor presencia de Cav1 en exosomas se utilizaron fibroblastos deficientes en PTRF/Cavina1 (PTRFKO) y como control se empleó la misma línea celular reconstituida con un vector lentiviral que expresa la proteína PTRF (PTRFKO +PTRF). Los exosomas producidos por ambas líneas se purificaron y se analizaron mediante Western Blot. Se pudo observar un incremento de los niveles de Cav1 en los exosomas producidos por las células PTRFKO a pesar de que los niveles totales de Cav1 en los lisados eran menores que en las células reconstituidas (Figura R7a). Por el contrario, en las células en las que la internalización de Cav1 se encuentra bloqueada (Cav1KO reconstituidas con el mutantes Cav1Y14F) (Figura R7b) o tienen un defecto en su tráfico a las vesículas intraluminales (Figura R8) (mutantes de CAV1 que no pueden ubiquitinarse en su extremo amino-terminal) se observó una reducción de la presencia de Cav1 en exosomas.    Pág ina 78   Figura R7. La endocitosis de Cav1 favorece su presencia en exosomas. (a) Análisis por Western Blot de los niveles de Cav1 presentes en lisados celulares y en exosomas derivados de fibroblastos deficientes para PTRF/Cavina-1 (PTRF KO) y fibroblastos reconstituidos con la expresión de PTRF exógeno (PTRF KO + PTRF). Tubulina y TSG101 se utilizaron como controles de carga de los lisados o de los exosomas respectivamente. El gráfico muestra la cantidad de Cav1 presente en exosomas (las barras de error muestran valores medios ± desviación estándar, n = 3, * p < 0,05). (b) Análisis mediante Western Blot de la expresión de Cav1 en exosomas derivados de fibroblastos Cav1WT y fibroblastos que expresan el mutante no fosforilable de Cav1 (Cav1Y14F). Todos estos datos sugieren, por tanto, una clara conexión entre los niveles de Cav1 endocitada y su posterior presencia en exosomas mostrando que en todas las líneas celulares que expresan Cav1, una fracción de esta proteína es incorporada a los exosomas. Figura R8. La ubiquitación en el extremo amino- terminal es determinante para la entrada de Cav1 en exosomas. Análisis por Western Blot de los niveles de Cav1 presentes en lisados celulares y en exosomas derivados de células COS7 transfectadas con las construcciones correspondientes a los diferentes mutantes de ubiquitinación de Cav1 fusionados a HA. La detección se realizó empleando anticuerpos específicos frente a Cav1 y frente al tag HA. Finalmente, una vez los exosomas se encuentran en el medio extracelular pueden actuar como mensajeros entre células distantes. Una de las vías por las cuales los exosomas actúan como medio de comunicación es mediante la transferencia directa de las proteínas y ácidos nucleicos que contienen a la célula aceptora 92. Para comprobar la funcionalidad de los exosomas en la transferencia de Cav1 se realizó un ensayo en que se trataron MEFs Cav1KO con exosomas derivados de MEFs Cav1WT.      Pág ina 79   Una vez realizado el tratamiento durante 24, 48 y 72h se pudo observar mediante Western Blot que los MEFs Cav1KO tratados poseían ciertos niveles de Cav1, indicando la capacidad de los exosomas de transmitir Cav1 a células incapaces de expresarla (Figura R9). Figura R9. Cav1 es transferida a la célula receptora a través de exosomas. MEFs Cav1WT y Cav1KO fueron cultivados durante 24, 48 y 72h en presencia de exosomas purificados a partir de MEFs Cav1WT. Los lisados celulares correspondientes a las diferentes condiciones fueron analizados mediante Western Blot utilizando un anticuerpo específico para Cav1 permitiéndonos detectar los niveles de Cav1 transferidos a los MEFs a través de los exosomas. Tubulina se utilizó como control de carga. 4.2 La biogénesis de exosomas está regulada por Cav1 La formación de exosomas es un proceso altamente regulado. Entre los mecanismos implicados se encuentran sistemas dependientes de proteínas estructurales como CD63, Alix o la maquinaria ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Requiered for Transport) 107 109 113. Pero también se ha descrito un papel fundamental de la composición lipídica de los MVBs en la formación de exosomas 117 121. Cav1 es una proteína capaz de unir colesterol, condicionando la arquitectura de las membranas celulares 193. Por ello, en este trabajo, se decidió estudiar la posibilidad de que Cav1 además de estar presente en los exosomas pudiera estar jugando un papel activo en la biogenésis de estas nanovesículas. 4.2.1 Implicación de Cav1 en la formación y tamaño de los exosomas En primer lugar, se realizó la caracterización de los exosomas producidos por los fibroblastos MEFs Cav1WT y Cav1KO. Tras su purificación mediante centrifugación secuencial, se vio que ambos tipos celulares presentan capacidad de secretar exosomas (Figura R10a), sin embargo, esta capacidad se encontraba aumentada en las células carentes de Cav1 en comparación con los controles (MEFs Cav1WT) tal y como se determinó mediante el análisis por seguimiento de nanopartículas (NTA, Nanoparticle Tracking Analysis) (Figura R10b). Para caracterizar mejor la población de exosomas producidos por los dos tipos celulares se llevó a cabo el estudio por Western Blot de la producción total de exosomas derivados del mismo número de células,    Pág ina 80   confirmándose nuevamente que la ausencia de Cav1 conllevaba un aumento en la secreción de exosomas (Figura R10c). Figura R10. La producción de exosomas se encuentra aumentada en ausencia de Cav1. (a) Western Blots representativos de la flotación de exosomas de MEFs Cav1WT y Cav1KO en gradientes de sacarosa. Se muestran los niveles de Cav1 y TSG101(marcador de exosomas). (b) Cuantificación de la producción de exosomas relativa al mismo número de células productoras determinado mediante la tecnología NTA (las barras de error muestran valores medios ± desviación estándar, n = 3, * p < 0,05). (c) Análisis por Western Blot de los exosomas producidos por el mismo número de MEFs Cav1WT y Cav1KO. TSG101, Alix y flotilina-1 se usaron como marcadores de exosomas. Además de cuantificar el número de partículas, el sistema NTA permite a su vez obtener una distribución por tamaño de las vesículas analizadas. De esta manera se pudo observar que los exosomas producidos por los MEFs Cav1WT mostraban una distribución de tamaño heterogénea, pudiendo dividirse en dos poblaciones normales, una de menor tamaño (con un tamaño medio de 201,07 ± 8,11 nm) y otra de un tamaño ligeramente mayor (308,71 ± 11,53 nm) (Figura R11a). Por el contrario, en ausencia de Cav1 esta segunda población de mayor tamaño desaparecía quedando la secreción de exosomas restringida a una única población homogénea (con un tamaño medio de 196,75 ± 8,22 nm). Estos datos se confirmaron mediante microscopía electrónica (Figura R11b), pudiéndose apreciar que los MEFs Cav1WT producían exosomas con una distribución de tamaño más heterogénea que los MEFs Cav1KO. Finalmente, esta alteración también se vio reflejada en el patrón tinción de LBPA diferencial de las vesículas intraluminales presentes en MEFs Cav1WT y Cav1KO transfectadas con la construcción Rab5Q79L-GFP (Figura R11c). Todos estos datos sugieren, por tanto, un papel de Cav1 en la regulación de la biogénesis de exosomas.      Pág ina 81   Figura R11. Cav1 modula el tamaño de los exosomas producidos. (a) Perfiles de distribución por tamaño de los exosomas producidos por MEFs Cav1WT y Cav1KO mediante la tecnología NTA. Las flechas negras señalan las poblaciones mayoritarias, encontrándose dos poblaciones claramente diferenciadas en exosomas Cav1WT (p1 y p2) y una en el caso de los exosomas Cav1KO (p1). El gráfico de barras muestra la cuantificación de la proporción de los exosomas encontrados en cada una de las dos poblaciones normales identificadas (las barras de error muestran valores medios ± Error estándar de la media, SEM; n = 10, ** p < 0,01). (b) Imagen representativa de microscopía electrónica de transmisión de exosomas producidos por MEFs Cav1WT y Cav1KO (barra de escala, 200 nm). Los gráficos muestran la distribución del tamaño de las partículas encontradas en las muestras, mostrando el tamaño medio de las dos poblaciones normales identificadas (las barras de error muestran valores medio ± desviación estándar, n = 3). (c) Microscopía confocal de MEFs Cav1WT y Cav1KO transfectados con el mutante constitutivamente activo de Rab5 (Rab5Q79L, gris) y teñidos para Cav1 (rojo) y LBPA como marcador de ILVs/MVBs (verde). La densitometría muestra un cambio en el patrón del marcaje de LBPA localizado en el interior de los endosomas engrosados, siendo éste más homogéneo en el caso de los MEFs Cav1KO (barra de escala, 10 µm). 4.2.2 Papel de Cav1 en la formación de exosomas a través de su capacidad de modular el colesterol en los MVBs Los endosomas juegan un papel importante en la redistribución del colesterol procedente de la endocitosis al resto de los orgánulos celulares 96,237. Cambios en los niveles de colesterol no sólo afectan a la integridad de la célula en su conjunto, sino también a la estructura propia del endosoma, alterando su distribución en el interior celular, así como el tamaño y la cantidad de ILVs 238 239. Por ello, se estudió si Cav1, gracias a su capacidad de asociarse a lípidos específicos, particularmente colesterol,    Pág ina 82   era capaz de promover la heterogeneidad observada en los exosomas producidos por los fibroblastos Cav1WT mediante la modulación de los niveles de colesterol y su organización en los MVBs. En primer lugar, se confirmó la presencia de colesterol en el sistema del endosoma en MEFs transfectadas con la construcción Rab5Q79L-GFP y mediante posterior tinción con LBPA (como marcador de MVBs e ILVs) y filipina III, una sonda fluorescente que se une específicamente al colesterol libre de la célula (Figura R12). Los resultados mostraron un claro marcaje de filipina III tanto en la membrana endosomal como en las ILVs, confirmando una presencia importante de este lípido a nivel de los MVBs. Con el fin de evaluar el impacto que la ausencia de Cav1 provocaba en este compartimento, se marcaron las células Cav1WT y Cav1KO con LBPA y filipina III y se analizaron los MVBs de cada tipo celular mediante inmunofluorescencia. Como se observa en la figura R13a, aunque el número de estructuras positivas para LBPA (es decir el número de MVBs) no mostraba diferencias entre ambas líneas celular, por el contrario, si se pudo determinar que tanto el área de los MVBs como su contenido medio y total de colesterol estaban significativamente incrementados en las células Cav1KO. Este fenotipo, además se recapituló tanto por silenciamiento de Cav1 en las células Cav1WT mediante el uso de un ARN de interferencia (ARNi) y de un ARN de interferencia generado a partir del corte de un ARN de doble hebra por una endoribonucleasa (ARNesi, Endoribonuclease-prepared siRNA) (Figura R13b), como por tratamiento de estas células con U18666A, una droga que promueve específicamente la acumulación de colesterol en los endosomas tardíos/MVBs 240 241 (Figura R13a). En ambos casos, se pudo observar un aumento significativo de la presencia de colesterol a nivel endosomal mimetizando el fenotipo de las células Cav1KO. Figura R12. Los endosomas contienen elevados niveles de colesterol libre. Determinación de la distribución del colesterol libre en MEFsCav1WT transfectados con Rab5Q79L (verde) mediante microscopía confocal. Para la detección de colesterol libre se utilizó la sonda fluorescente Filipina III (gris y azul) y como marcador de ILVs/MVBs, LBPA (rojo). La tinción de Filipina III muestra la presencia de colesterol tanto a nivel de la membrana endosomal como en las ILVs (flechas blancas) (barra de escala, 10 µm).      Pág ina 83   Figura R13. La ausencia de Cav1 produce un aumento en los niveles del colesterol libre endosomal. (a) (Izquierda) Imágenes de microscopía confocal correspondiente a la tinción con LBPA (ILVs/MVBs, verde) y Filipina III (colesterol libre, gris) en MEFs Cav1WT, Cav1KO y Cav1WT tratados con U18666A (barra de escala, 20 µm). Los paneles inferiores muestran la magnificación del área indicada (barra de escala, 6 µm). (Derecha) El gráfico de barras superior muestra la cuantificación de la intensidad media de Filipina III localizada en MVBs (las barras de error indican valores medios relativos ± SEM, n = 4, ** p < 0,01, *** p < 0,001). El gráfico de barras inferior indica el área media de los endosomas en cada caso (las barras de error indican valores medios relativos ± SEM, n = 4, * p < 0,05, ** p < 0,01). (b) Análisis del efecto del silenciamiento de Cav1 en el contenido de colesterol endosomal. (Parte superior) Western Blot representativo de la eficiencia del silenciamiento de Cav1 en MEFs Cav1WT. (Parte inferior) Cuantificación de la intensidad media de Filipina III en los MVBs en MEFs Cav1WT transfectados con el control y con los ARNs indicados (las barras de error indican valores medios relativos ± SEM, n = 4, * p < 0,05). Con el fin de confirmar si estas diferencias en los niveles de colesterol entre los MEFs Cav1WT y Cav1KO a nivel de los endosomas tardíos/MVBs estaban directamente implicadas en los cambios observados en los exosomas producidos por ambos tipos celulares, se decidió evaluar el impacto que el tratamiento de MEFs Cav1WT con la droga U18666A provocaba sobre la biogénesis de exosomas. El análisis de partículas mediante el uso de la tecnología NTA mostró un aumento significativo en el número de exosomas producidos tras inducir la acumulación de colesterol con esta    Pág ina 84   droga (Figura R14a). Además, la distribución por tamaño reveló que, al igual que ocurría en los exosomas derivamos de MEFs Cav1KO, el tratamiento con U18666A provocó la pérdida de la población de exosomas de mayor tamaño, obteniéndose un perfil más homogéneo y de menor tamaño (Figura R14a). Finalmente, el análisis por Western Blot de estos exosomas reveló que el tratamiento con U18666A inducía un aumento en los niveles de Cav1 en los mismos, sugiriendo un reclutamiento de esta proteína hacia el endosoma como mecanismo de compensación del aumento en los niveles de colesterol provocados por la droga (Figura R14b). Figura R14. El aumento en los niveles de colesterol endosomal tiene un impacto en la formación de los exosomas. (a) Análisis de los exosomas producidos por MEFs Cav1WT control y tratados con U18666A mediante NTA. (Izquierda) La gráfica muestra los niveles de producción de exosomas relativa al mismo número de células en ambas condiciones (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 3, * p < 0,05). (Derecha) Perfil de distribución por tamaño de los exosomas indicados en a). Las flechas señalan las poblaciones normales identificadas. En el caso de MEFs Cav1WT se observa una distribución con dos poblaciones mayoritarias (p1 y p2). Este patrón desaparece con el tratamiento con U18666A, quedando restringida a una única población (p1). (b) Análisis por Western Blot de los lisados celulares y de los exosomas producidos por MEFs Cav1WT control y/o tratados con U18666A. El gráfico de barras de la derecha muestra la cantidad relativa de Cav1 presente en exosomas (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 3, *** p < 0,001). Tubulina se usó como control de carga para los lisados. TSG101 y Alix se emplearon como controles de carga de los exosomas producidos. Las membranas lipídicas de la célula son estructuras dinámicas que presentan dominios que desempeñan un papel importante en la arquitectura de la propia membrana 125. Estos dominios son el resultado del empaquetamiento selectivo de colesterol y esfingolípidos confiriendo a la membrana un estado de fase líquido- ordenada, resistente a la solubilización con diversos detergentes, de ahí que a estos      Pág ina 85   dominios también se les dé el nombre de DRMs (Detergent Resistant Membranes) 191. Con el fin de analizar si las diferencias de colesterol observadas en los MVBs de las células Cav1WT en comparación con las células Cav1KO se traducían también en cambios en la organización de la membrana de los exosomas que producen, se procedió al aislamiento de estos DRMs a partir de exosomas producidos por las células Cav1WT (control o tratadas con la droga U18666A) y por las células Cav1KO (Figura R15). Los resultados obtenidos mostraron como flotilina-1, un marcador específico tanto de DRMs como de exosomas, se distribuía diferencialmente en cada caso. En el caso de los exosomas producidos por las células Cav1KO o por las células Cav1WT tratadas con la droga, flotilina-1 mostraba una amplia distribución a lo largo de las fracciones 1 a 8. Sin embargo, la acumulación de flotilina-1 en los exosomas derivados de las células Cav1WT control se restringió a las fracciones 1 a 3 (Figura R15) lo que refleja un mayor contenido de microdominios ordenados en exosomas derivados de las células Cav1KO o en exosomas Cav1WT tratados con la droga. Figura R15. La organización lipídica de la membrana de los exosomas depende de Cav1 y está modulada por los niveles de colesterol. Purificación de los dominios de membranas resistentes a detergentes DRMs en exosomas. Western Blots representativos de las fracciones obtenidas a partir de gradientes de sacarosa de los exosomas producidos por MEFs Cav1WT, Cav1KO y MEFs Cav1WT tratados con U18666A en presencia de Triton X-100 a 4ºC. Flotilina-1 se usó como marcador de DRMs. El gráfico de barras de la derecha muestra la proporción de flotilina-1 localizada en membranas resistentes y no resistentes a detergentes (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 3, * p < 0,05, ** p < 0,01). Durante la formación de las ILVs, la membrana del MVB sufre un proceso de invaginación hacia el lumen del endosoma que origina a la formación de dichas estructuras intraluminales que darán lugar a los exosomas. En este proceso, la composición lipídica es fundamental para especificar tanto su tamaño como la    Pág ina 86   morfología de las mismas. De hecho, en los últimos años, diferentes lípidos han sido propuestos como elementos esenciales en la formación de diferentes poblaciones de exosomas 121 117. Para confirmar si además de las diferencias a nivel del colesterol, la ausencia de Cav1 podría provocar cambios en otros lípidos, se procedió a determinar mediante análisis por espectrometría de masas la composición lipídica de exosomas derivados de células Cav1WT y Cav1KO (Figura R16). Curiosamente, se observó que mientras que los lípidos principalmente estructurales en la formación de exosomas tales como fosfatidil-colina, fosfatidil-serina y fosfatidil-etanolamina presentaban niveles similares en ambos tipos de exosomas, por el contrario, aquellos lípidos directamente relacionados con los procesos de invaginación y formación de las ILVs (tales como LBPA y ácido fosfatídico) estaban enriquecidos en los exosomas Cav1WT en comparación con los producidos por las células Cav1KO. Figura R16. Alteraciones en la composición lipídica de los exosomas provocada por la ausencia de Cav1. (a) Esquema explicativo de la implicación de los diferentes componentes lipídicos en la invaginación y formación de las vesículas intraluminales a nivel de los MVBs (adaptado de Subra et al, 2007 117). Se muestran aquellos lípidos que desempeñan un papel activo en el proceso de invaginación tales como PA (Ácido fosfatídico) o LBPA (Ácido liso-bis- fosfatídico), así como aquellos que desempeñan un papel estrictamente estructural tales como PS/PI (Fosfatidil serina/Fosfatidil inositol), SM (Esfingomielina), PG/PE (Fosfatidil glycerol/Fosfatidil etanolamina), PC (Fosfatidil Colina). (b) Análisis lipidómico de los exosomas producidos por MEFs Cav1WT (blanco) y MEFs Cav1KO (gris). El gráfico de barras muestra la cantidad total de cada lípido detectado en la muestra (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 2). Todos estos resultados indican que Cav1 juega un papel clave en la modulación de la biogénesis de exosomas actuando como un “reóstato” o mecanismo de tamponamiento del colesterol a nivel de los MVBs. Esta capacidad de modular el colesterol por parte de Cav1 confiere plasticidad a este compartimento permitiendo la segregación de diferentes poblaciones de exosomas.      Pág ina 87   4.2.3 La presencia de Cav1 en exosomas especifica su composición proteica Los exosomas, como nanovesículas liberadas al medio extracelular por la mayoría de las células, constituyen un novedoso sistema de comunicación de gran relevancia tanto en procesos fisiológicos como patológicos 87 143. Los exosomas pueden actuar localmente como mecanismos de comunicación entre células próximas entre sí (comunicación paracrina) 93 pero también pueden hacerlo a distancia, alcanzando otros órganos o tejidos distantes de aquellos que los han producido (comunicación endocrina)  157 158. Su contenido abarca desde ácidos nucleicos (ARNm, micro-ARN, ADN mitocondrial…), lípidos, así como una amplia colección de proteínas, por lo que son capaces de ejercer múltiples funciones sobre las células aceptoras 79 116,142 143,152. La incorporación específica de todas estas moléculas es un proceso altamente regulado por lo que entender los mecanismos implicados en su regulación representa una estrategia para poder controlar la composición específica de los exosomas. Como se ha visto anteriormente, Cav1 es capaz de modular la biogénesis de exosomas, por lo que a continuación evaluamos la importancia que la presencia de Cav1 tenía en la incorporación selectiva de proteínas dentro de los exosomas. Mediante un análisis proteómico cuantitativo basado en marcaje isobárico se analizó la composición proteica tanto de los lisados correspondientes a fibroblastos Cav1WT y Cav1KO como de los exosomas producidos por ambos tipos celulares. De un total de 9109 proteínas identificadas en los lisados, un 87,1% de las proteínas (7942 proteínas) presentaban niveles similares de expresión en ambas líneas celulares (1,5 ≥ Zq ≥ -1,5) (Figura R17). Esto nos permitió la demarcación de un subconjunto del proteoma común y que por tanto tenía una probabilidad similar de ser incorporado en los exosomas. Por otro lado, el proteoma correspondiente a los exosomas producidos por ambos tipos de fibroblastos reveló un total de 2938 proteínas. Este estudio mostró que del total de proteínas encontradas en lisados únicamente un 25,8% (2359 proteínas) se encontraban presentes en exosomas (Figura R17a). Además, se pudo observar que existe un 19% de proteínas presente en los exosomas cuya presencia no es detectable en los lisados a nivel proteómico, indicando la existencia de un proceso altamente selectivo de estas proteínas en su entrada a los exosomas.    Pág ina 88   Figura 17. Cav1 especifica la composición proteica de los exosomas. (a) Diagrama de Venn de las proteínas identificadas en el análisis proteómico tanto de lisados celulares como de exosomas de MEFs, indicando aquellas proteínas comunes (2359) y aquellas que se encuentran exclusivamente en lisados celulares (6750) o en exosomas (579). La tabla inferior muestra de manera desglosada los subproteomas identificados, así como el porcentaje de éstos respecto al total de proteínas identificadas en cada muestra. (b) Esquema explicativo de las proteínas seleccionadas dentro del proteoma identificado a nivel de los lisados correspondientes a las células MEFs Cav1WT y MEFs Cav1KO para su evaluación dentro del proteoma correspondiente a los exosomas producidos por dichas líneas celulares. A la izquierda se representa el total de proteínas identificadas en los lisados celulares ordenadas jerárquicamente según su valor Zq (Logaritmo en base 2 de la ratio de expresión de cada proteína expresado en unidades de desviación estándar, acorde con el modelo WSPP). En azul se muestran proteínas enriquecidas en los lisados de MEFs Cav1WT (Zq ≥ 1,5) mientras que en rojo aparecen aquellas proteínas enriquecidas en lisados correspondientes a células Cav1KO (Zq ≤ 1,5). En amarillo se señalan las proteínas que presentan niveles similares en los lisados de ambas líneas celulares. (1,5 ≥ Zq ≥ -1,5). A la derecha se representan los valores de Zq de las proteínas que fueron identificadas diferencialmente en exosomas y que se expresan por igual a nivel de los lisados. Con todos estos datos se llevó a cabo un análisis comparativo entre los exosomas Cav1WT y Cav1KO. Entre el conjunto de proteínas detectadas, sólo se      Pág ina 89   consideraron aquellas cuyos niveles de expresión fueran similares en el proteoma de los lisados celulares, pero que a la vez estuvieran diferencialmente representadas en exosomas. Considerando como umbral de cambio significativo correspondiente a un Zq ≥ 1,5 se identificaron 152 proteínas (5,1% del total de proteínas de los exosomas) cuya presencia se encontraba aumentada en exosomas Cav1WT, y que por tanto corresponderían a proteínas que requerirían de la presencia de Cav1 para su incorporación en exosomas. Por el contrario, considerando un Zq ≤ -1,5 se identificaron 163 proteínas (5,5% del total de proteínas de los exosomas) que corresponderían a un subconjunto de proteínas para las que la presencia de Cav1 estaría condicionando negativamente su incorporación a estas nanovesículas (Figura R17b). Una vez seleccionados estos dos grupos de proteínas, se realizó un análisis estadístico basado en una red de interacciones (STRING network analysis: https://string- db.org/cgi/network.pl) así como un análisis funcional de ontología génica (GOrilla, Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool: http://cbl- gorilla.cs.technion.ac.il/). Estos análisis revelaron que, los exosomas derivados de MEFs Cav1WT estaban enriquecidos en proteínas componentes del sistema endosomal/endomembranas, mostrando también un enriquecimiento especialmente significativo en componentes de la matriz extracelular (ECM, ExtraCellular Matrix) (incluidos Tenascina-C, Fibronectina, Nidógeno, Emilina, EDIL3 y proteoglicanos de heparán sulfato entre otros) (Figura R18 y Tabla S1). Por el contrario, el análisis mediante STRING reveló una marcada presencia en los exosomas Cav1KO de proteínas relacionadas con ADN/ARN entre las que se encontraban diferentes histonas. Por otro lado, y apoyando nuestros datos previos en los que demostrábamos un mayor contenido de colesterol en los MVBs de las células Cav1KO, los análisis proteómicos revelaron un aumento significativo de anexinas en los exosomas Cav1KO (Figura R19 y Tabla S2). Las anexinas son proteínas dependientes de calcio que se unen a membranas ricas en colesterol promoviendo el ordenamiento lipídico de las membranas a las que se asocian. El enriquecimiento en anexinas en los exosomas Cav1KO, por tanto, podría ser un mecanismo de regulación del colesterol presente en estos exosomas. A continuación, y tras seleccionar algunas de las proteínas diferencialmente presentes en los exosomas Cav1WT y Cav1KO los resultados proteómicos se validaron mediante Western Blot (Figura R20).    Pág ina 90   Figura R18. Los exosomas producidos por MEFs Cav1WT incorporan selectivamente proteínas del sistema endosoma y de matriz extracelular. (a) El gráfico de barras muestra las familias de proteínas significativamente enriquecidas en los exosomas derivados de MEFs Cav1WT (p < 0,01). En azul se señalan las familias relacionadas con la matriz extracelular (ECM). En verde aquellas vinculadas al sistema del endosoma/lisosoma. A la derecha se presenta el diagrama correspondiente a las redes de conexiones entre proteínas obtenido mediante análisis usando la base de datos STRING que se encuentran aumentadas significativamente en los exosomas derivados de MEFs Cav1WT. (b) Diagrama de intensidad de color correspondientes a los valores de Zq obtenidos para las diferentes proteínas endosomales (parte superior) y para las proteínas de la matriz extracelular (parte inferior) tanto en los lisados celulares como en los exosomas. El color azul indica proteínas enriquecidas en muestras Cav1WT mientras que el color rojo corresponde a aquellas que lo están en muestras Cav1KO. Tenascina-C y Fibronectina se resaltan en negrita dada su relevancia dentro de los componentes de proteínas de matriz extracelular. 4.2.3.1 Cav1 condiciona la presencia de proteínas de matriz en exosomas De todos los grupos de proteínas cuya entrada al exosoma depende de la presencia de Cav1 nos llamó especialmente la atención el grupo correspondiente a las proteínas de matriz extracelular dada su importancia tanto en procesos fisiológicos como patológicos 5 6 10 . Aunque estas proteínas han sido ampliamente estudiadas, aún se desconocen con exactitud cuáles son los mecanismos responsables de su secreción Emilina-2 Tenascina-C Peroxidasina Col6a3 Col6a1 Nidógeno-2 Desmocolina-3 Fibronectina PGBM LTBP2 Lactadherina Hmcn1 Zq = +10 Zq = -8,5 ECM      Pág ina 91   al medio extracelular 81. Nuestros datos sugieren la posibilidad de que los exosomas puedan constituir al menos una de las vías empleadas por estas proteínas para su transporte y posterior secreción, por lo que decidimos profundizar en esta hipótesis. Para ello, nos centramos en Tenascina-C (TnC). Figura R19. Los exosomas producidos por MEFs Cav1KO incorporan selectivamente anexinas y proteínas relacionadas con ADN/ARN. (a) Análisis de las categorías de proteínas enriquecidas en los exosomas derivados de MEFs Cav1KO. (Izquierda) En el gráfico de barras se muestran las familias de proteínas significativamente enriquecidas en dichos exosomas (p < 0,01). En rojo se señalan las familias relacionadas con las histonas y en naranja otras familias relacionadas con el ADN y el ARN. A la derecha se muestra la red de conexiones existentes entre las proteínas enriquecidas en exosomas Cav1KO. (b) Diagrama de intensidad de color correspondiente a los valores de Zq de las diferentes histonas (parte superior) y a los distintos miembros de la familia de las anexinas (parte inferior) tanto en lisados celulares como en exosomas derivados de MEFs Cav1KO. El color azul corresponde a proteínas más enriquecidas en muestras Cav1WT mientras que el color rojo aquellas que lo están en muestras Cav1KO. TnC es una proteína moduladora de la adhesión 41 celular implicada en diferentes aspectos del desarrollo embrionario  44. Sin embargo, también participa en procesos patológicos tales como en la progresión tumoral, jugando un papel    Pág ina 92   fundamental en el desarrollo de metástasis, y usado como un marcador tumoral relacionado con una mala prognosis de esta enfermedad y una baja tasa de supervivencia en pacientes de cáncer 242. Figura R20. Confirmación del análisis proteómico. Análisis mediante Western Blot para confirmar los cambios en la expresión diferencial de diferentes proteínas identificadas por proteómica cuantitativa tanto de lisados correspondientes a fibroblastos Cav1WT y Cav1KO como de los exosomas producidos por dichas células. Tubulina se empleó como control de carga en los lisados celulares, y TSG101 como control de carga de exosomas. Nuestros resultados proteómicos mostraron unos niveles similares de esta proteína entre lisados celulares de MEFs Cav1WT y Cav1KO (Zq = -0,98). Sin embargo, su presencia era muy elevada en los exosomas positivos para Cav1 (Zq = 3,02) sugiriendo un papel fundamental de Cav1 en la modulación de la entrada de TnC a los exosomas. Con el fin de confirmarlo, se llevó a cabo el silenciamiento de Cav1 en las células MEFs Cav1WT mediante infección lentiviral con un RNA de doble cadena en horquilla (shRNA) específico del gen de Cav1. Los resultados mostraron una bajada en los niveles de Cav1 que se correlacionaba con una disminución significativa de la incorporación de TnC en los exosomas (Figura R21) apoyando la idea de que la presencia de Cav1 es fundamental para la incorporación de TnC en estas nanovesículas. Figura R21. Los niveles de TnC en los exosomas se encuentran determinados por la expresión de Cav1. Análisis por Western Blot de la disminución de la incorporación de TnC en los exosomas tras el silenciamiento de la expresión de Cav1. La expresión de TnC en exosomas secretados por fibroblastos silenciados para Cav1 se comparó con la expresión de esta proteína en exosomas derivados de fibroblastos Cav1WT y Cav1KO. El gráfico de barras muestra los niveles de TnC (blanco) y Cav1 (gris) en cada caso (las barras de error muestran valores medios ± SEM, n = 6, * p < 0,05).      Pág ina 93   Con el fin de establecer la cinética de deposición de TnC por parte de los fibroblastos Cav1WT se analizó la distribución subcelular de esta proteína a lo largo del tiempo mediante microscopía confocal. Como se observa en la Figura R22, tras 24-36 horas después de sembrar las células, TnC se encontraba localizada principalmente en el interior celular mostrando una acumulación en áreas próximas al núcleo. Esta primera etapa correspondería con la fase de síntesis de la proteína y con el inicio de su transporte hacia el exterior. Sin embargo, es a partir de las 48h cuando se puede observar la presencia de pequeñas fibras de TnC extracelulares, alcanzándose la máxima deposición y formación de la matriz de TnC a las 120 h. Figura R22. Estudio de la cinética de deposición de TnC. Imágenes de microscopía confocal de TnC (rojo) a lo largo del tiempo. Las células MEFs Cav1WT se sembraron fijándose posteriormente con paraformaldehido a los tiempos indicados. La localización subcelular de TnC (rojo) se evaluó en cada caso. Las flechas blancas muestran el momento en el que comienza la aparición de estructuras en forma de fibras de TnC en el espacio extracelular siendo máxima su deposición a las 120 h (barra de escala, 50 µm). Una vez establecido el tiempo óptimo (120 h) de secreción y deposición de TnC, decidimos estudiar si la ausencia de Cav1 afectaba a este proceso. El análisis comparativo de la deposición de matriz producido por los fibroblastos Cav1WT y Cav1KO confirmó la presencia de TnC extracelular distribuida en forma de fibras en el caso de los fibroblastos Cav1WT. Por el contrario, los fibroblastos Cav1KO mostraron un patrón de TnC principalmente intracelular, con una significativa disminución de fibras a nivel extracelular, un fenotipo que se recapituló mediante silenciamiento de Cav1 en los fibroblastos Cav1WT mediante shRNA específico contra esta proteína (Figura R23a). Estos resultados demuestran que, aunque la expresión/traducción de TnC no está afectada en los fibroblastos carentes de Cav1, su capacidad de ser transportada y secretada al exterior está alterada. Además, pudimos confirmar que la inducción de un aumento en los niveles de colesterol endosomal en los fibroblastos Cav1WT mediante tratamiento con la droga U18666A (mimetizando el fenotipo mostrado por las células Cav1KO) resultó también en una reducción en la capacidad de estas células de producir una matriz de TnC, así como en su presencia en exosomas (Figura R23b). Además, estas diferencias en la formación de fibras fueron cuantificadas mediante un análisis    Pág ina 94   informático desarrollado en el laboratorio (ver materiales y métodos) (Figura R23c). Sin embargo, y a diferencia de la acumulación intracelular de TnC asociada a la disminución o ausencia completa de Cav1 (Figura R23a), en las células Cav1WT tratadas con U18666A la retención de TnC a nivel intracelular fue mucho menos evidente probablemente reflejando una tasa mucho más alta de degradación en esta condición. Asimismo, la inducción de la internalización de Cav1 a los MVBs mediante tratamiento de los fibroblastos Cav1WT con ortovanadato sódico o por silenciamiento de la expresión de PTRF (tal y como se mostró en la Figura R2a y c), resultó en un incremento significativo de la capacidad de estos fibroblastos de secretar y producir matrices ricas en TnC respecto a sus controles (Figura R23d). Figura R23. La deposición de la matriz extracelular de TnC depende de la regulación de los niveles de colesterol en proceso mediado por Cav1. (a) Proyección máxima de imágenes de microscopía confocal donde se muestra la TnC (rojo) depositada en forma de fibras a nivel extracelular por los MEFs Cav1WT, Cav1KO y Cav1KD tras 120h de cultivo. La actina celular se marcó en verde (barra de escala, 40 µm). Las imágenes amplificadas muestran la      Pág ina 95   ausencia de deposición de matriz de TnC asociada a un incremento en la acumulación intracelular de esta proteína en MEFs Cav1KD y MEFs Cav1KO (barra de escala, 10 µm). (b) Estudio del efecto de la acumulación de colesterol endosomal en MEFs Cav1WT. (Izquierda) Western Blot representativo mostrando la reducción en los niveles de TnC en los exosomas producidos por los MEFs Cav1WT tratados con la droga U18666A. (Derecha) Proyección máxima de imágenes obtenidas mediante microscopía confocal de la matriz extracelular de TnC (rojo) producida por MEFs Cav1WT control y tratados con U18666A (barra de escala, 40 µm). (c) Cuantificación de la deposición de TnC extracelular en fibras producidas por los MEFs Cav1WT control y tratados con U18666A y MEFs Cav1KO mediante la utilización de un software específico (ver materiales y métodos) (las barras de error muestran valores medios ± desviación estándar, n = 8, *** p < 0,001). (d) Análisis del efecto que la inducción de la fosforilación y endocitosis de Cav1 provocan sobre la formación de la matriz extracelular de TnC (rojo) determinado mediante microscopía confocal y posterior cuantificación de fibras (barra de escala, 40 µm). (Izquierda) Inducido por tratamiento de MEFs Cav1WT con NaV 100 µM (las barras de error muestran valores medios ± desviación estándar, n = 2). (Derecha) Inducido por la ausencia de PTRF. Las imágenes de microscopía confocal muestran la matriz extracelular de TnC (rojo) producida por MEFs deficientes en PTRF (PTRF KO). PTRF KO reconstituidos con PTRF (PTRF KO + PTRF) se usaron como control (las barras de error muestran valores medios ± desviación estándar, n = 3, *** p < 0,001). Consistente con estas observaciones, se confirmó la colocalización de TnC con Cav1 a nivel de los MVBs en la línea celular U251MG, derivada de un glioblastoma caracterizada por su elevada capacidad para secretar TnC. Mediante la expresión de Rab5Q79L en este tipo celular se observó la presencia de TnC en los endosomas agrandados colocalizando con Cav1 a nivel de las vesículas intraluminales, así como una elevada colocalización con el marcador de exosomas CD63 (Figura R24). Figura R24. La proteína TnC se incorpora dentro de los endosomas. Análisis de la colocalización de TnC (rojo) con Cav1 o CD63 (verde) en células de glioblastoma U251 transfectadas con el mutante Rab5Q79L (blanco). La imagen magnificada muestra la presencia de TnC en el interior de los endosomas engrosados colocalizando con Cav1 (barra de escala, 5 µm). Finalmente, y mediante gradientes de sacarosa de exosomas producidos por fibroblastos Cav1 WT, se confirmó la presencia de TnC en las fracciones enriquecidas en Cav1 y en el marcador exosomal TSG101 (Figura R25).    Pág ina 96   Figura R25. TnC se encuentra presente en exosomas. (a) Western Blot representativo de las fracciones obtenidas tras la ultracentrifugación diferencial en gradiente de sacarosa de los exosomas producidos por MEFs Cav1WT. Se observa la existencia de correlación entre el marcador de exosomas TSG101 con Cav1 y TnC.   4.3 Los exosomas juegan un papel importante en la secreción y deposición tanto de TnC como de otros componentes de matriz tales como FN Los datos previamente mostrados indican que la secreción de TnC es mediada por exosomas. Con el fin de determinar la contribución específica que las rutas implicadas en la biogénesis y secreción de los exosomas ejercían sobre la secreción/deposición de TnC en primer lugar se llevó a cabo una inhibición farmacológica de estas rutas. Para ello, se utilizó dimetil amilorida (dmA), un inhibidor de canales de H+/Ca2+ y H+/Na+ que impide la correcta fusión de los MVBs con la membrana plasmática impidiendo la secreción de exosomas y GW4869, una droga que inhibe la biogénesis de los exosomas mediada por ceramida, bloqueando las esfingomielinasas neutrales 1 y 2 (nSMase1 y 2). El tratamiento de fibroblastos Cav1WT con estas drogas provocó una reducción significativa en la secreción de exosomas (aunque más efectiva con el tratamiento con GW4869) tal y como se confirmó tanto por análisis de partículas utilizando la tecnología NTA como por Western Blot (Figura R26a). Una vez confirmados estos datos, se evaluó el efecto que dichas drogas provocaban en términos de secreción/producción de TnC en forma de matriz empleándose dos aproximaciones. Por un lado y mediante análisis informático se determinaron y cuantificaron las fibras producidas tras el tratamiento con estas drogas y por otro lado se llevó a cabo la medición mediante análisis por Western Blot de los niveles de TnC intracelulares tal y como se detalla en la sección de materiales y métodos. Los resultados obtenidos mostraron una perfecta correlación entre la reducción en los niveles de exosomas producidos tras el tratamiento con estas drogas con una disminución en su capacidad para producir y formar una matriz de TnC asociado a un incremento/acumulación de esta proteína a nivel intracelular (Figura R26b y c), reflejando un defecto en su capacidad para ser exportada.      Pág ina 97   Figura R26. La inhibición de la secreción de exosomas reduce la formación de la matriz extracelular de TnC. (a) Inhibición farmacológica de la producción de exosomas mediante el tratamiento de las células MEFs Cav1WT con los inhibidores dimetil amilorida (dmA, 75 nM) y GW4869 (10 µM). (Izquierda) Western Blot representativo de los exosomas producidos por el mismo número de células en presencia de dichos inhibidores. (Derecha) Cuantificación por NTA de la producción de exosomas por célula en las condiciones anteriores (las barras de error muestran valores medios ± SEM, n = 3, ** p < 0,01). (b) Análisis por Western Blot de los niveles de TnC acumulados intracelularmente en células MEFs Cav1WT inducidos por el tratamiento con dmA y GW4869 (las barras de error muestran valores medios ± SEM, n = 9, * p < 0,05). (c) Imágenes representativas obtenidas mediante microscopía confocal mostrando el efecto que la exposición de MEFs Cav1WT a los inhibidores dmA y GW4869 provocan en la deposición de matriz de TnC (rojo) (barra de escala, 20 µm). Las flechas blancas muestran la acumulación intracelular de TnC. El gráfico muestra la cuantificación de las fibras de TnC depositadas mediante un programa informático elaborado en el laboratorio (las barras de error muestran valores medios ± SEM, n = 12, *** p < 0,001). Dado que nuestros análisis proteómicos muestran un enriquecimiento no sólo de TnC sino de diferentes proteínas de matriz decidimos confirmar la implicación generalizada de los exosomas en la secreción de otras proteínas de matriz, incluyéndose en estos estudios fibronectina (FN), una proteína de gran relevancia en múltiples procesos fisiopatológicos 33. Como se observa en la Figura R27, el tratamiento con las drogas inhibidoras de la síntesis/secreción de exosomas también provocó una    Pág ina 98   disminución significativa en su capacidad para ser depositada al medio extracelular en forma de fibras sugiriendo que la secreción de la matriz extracelular por parte de los exosomas debe ser un mecanismo universal. Figura R27. Inhibidores de la secreción de exosomas también afectan a la deposición de la matriz de FN. (a) Imágenes representativas obtenidas mediante microscopía confocal mostrando el efecto que la exposición de MEFs Cav1 WT a los inhibidores de exosomas dmA (75 nM) y GW4869 (10 µM) provocan en la deposición de la matriz de FN (verde) (barra de escala, 50 µm). El gráfico de barras muestra la cuantificación de las fibras de FN identificadas mediante análisis informático (las barras de error muestran valores medios ± SEM, n = 5, * p < 0,05, ** p < 0,01). Finalmente se confirmó el impacto general de la secreción de exosomas sobre la deposición de matriz extracelular a través de la extensión de estos estudios a fibroblastos humanos asociados a tumores (también conocidos como TAFs, Tumour- Associated Fibroblasts). Estos fibroblastos constituyen una población del estroma tumoral fundamental en la progresión del cáncer. Los resultados obtenidos mediante análisis de partículas (NTA) y mediante Western Blot mostraron cómo la secreción de exosomas por parte de estas células se inhibió significativamente mediante el tratamiento con GW4869, aunque a diferencia de lo observado en MEFs Cav1WT, la dmA no afectó a la cantidad de exosomas producidos por los TAFs, sugiriendo que en estas células posiblemente deben existir mecanismos de secreción de exosomas alternativos al modulado por esta droga (Figura R28a). En consecuencia, la deposición tanto de TnC como de FN por estos TAFs se vio específicamente afectada por el      Pág ina 99   bloqueo de las nSMAsas (droga GW4869) mientras que la dmA no modificó la secreción de estas proteínas de matriz respecto al control (Figura R28 b y c). Figura R28. Los exosomas producidos por los TAFs también modulan la deposición de matriz extracelular rica en TnC y/o FN. (a) Inhibición de la producción de exosomas en TAFs mediante tratamiento con los inhibidores farmacológicos dmA (75 nM) y GW4869 (10 µM). (Izquierda) Western Blot representativo de exosomas producidos por el mismo número de células en presencia de los inhibidores. (Derecha) Cuantificación por NTA de la producción de exosomas por célula en las condiciones anteriores (las barras de error muestran valores medios ± desviación estándar, n = 3, * p < 0,05). (b-c) Imágenes representativas de las proyecciones máximas obtenidas mediante microscopía confocal de la matriz formadas por TAFs tras el tratamiento con los inhibidores de exosomas. (b) Deposición de la matriz de TnC (rojo, barra de escala, 20 µm) (las barras de error muestran valores medios ± SEM, n = 5, * p < 0,05). (c) Deposición de la matriz de FN (verde, barra de escala, 50 µm) (las barras de error muestran valores medios ± SEM, n = 5, *** p < 0,001). Con el fin de descartar que el defecto en la secreción/deposición de TnC y de FN fuera consecuencia de un efecto secundario de estos inhibidores farmacológicos sobre la ruta exocítica clásica. Se analizó, mediante microscopía confocal, el efecto que ambas drogas (GW4869 y dmA) provocaban sobre la estructura del retículo endoplasmático/aparato de Golgi. Los resultados obtenidos tanto en fibroblastos de ratón como en TAFs no mostraron ninguna alteración significativa en ninguna de las dos    Pág ina 10 0  estructuras tras el tratamiento (Figura R29). Además, se analizaron marcadores propios del estrés de retículo endoplásmico como son el corte del mensajero del gen XBP1 (X- box Binding Protein 1) o la expresión de CHOP (CCAAT-enhancer-binding protein Homologous protein) 243. Ambos marcadores mostraban que, en presencia de las drogas dmA y GW4869, no se producía ningún tipo de estrés reticular (Figura R29 b y d). Estos datos confirman la selectividad de estos inhibidores farmacológicos sobre la ruta endosomal demostrando una vinculación clara entre la biogénesis de exosomas y la secreción/depósito extracelular de diferentes proteínas de matriz. Figura R29. Los inhibidores de la secreción de exosomas no afecta a la ruta exocítica clásica retículo endoplasmático-Golgi. (a-b) Estudio del efecto de dmA y GW4869 sobre la estructura y estabilidad del retículo endoplásmatico y el Golgi en MEFs. (a) Inmunofluorescencias representativas del aparato de Golgi en MEFs Cav1WT tras el tratamiento con los inhibidores de exosomas (GM130 se usó como marcador específico de Golgi, verde) (barra de escala, 15 µm). (b) Determinación del estrés del retículo endoplasmático inducido por la presencia de dmA y GW4869 mediante el análisis por RT-PCR y visualización en gel de agarosa del corte del mensajero de XBP1. Se señalan las formas cortadas (cXBP1, marcador positivo de estrés) y la no cortada (ncXBP1, marcador negativo de estrés (parte superior) o mediante análisis por PCR cuantitativa de los niveles de expresión de CHOP (parte inferior). Como inductores positivos de estrés reticular se incluyó el tratamiento con las drogas      Pág ina 10 1  tunicamicina y thapsigardina. (c-d) Estudio del efecto de dmA y GW4869 sobre la estructura y estabilidad del retículo endoplasmático y el Golgi en TAFs. (c) Inmunofluorescencias representativas del aparato de Golgi tras el tratamiento con inhibidores (GM130, verde) (barra de escala, 15 µm). (d) Determinación del estrés del retículo endoplasmático en TAFs inducido por el tratamiento con dmA, GW4869 mediante análisis por RT-PCR y visualización en gel de agarosa del corte del mensajero de XBP1. Como inductores de estrés reticular se incluyeron las drogas tunicamicina y thapsigardina. En la parte inferior se muestran imágenes representativas obtenidas mediante microscopía confocal correspondientes al retículo endoplásmatico (Calreticulina, verde) donde no se aprecian alteraciones estructurales tras el tratamiento con los inhibidores de exosomas (barra de error, 5 µm). La biogénesis de exosomas es un proceso regulado a través de diferentes mecanismos. Existe una vía dependiente del lípido ceramida y que puede ser inhibida, tal y como se mostró anteriormente por la droga GW4869, que bloquea la actividad de las nSMasas 1 y 2. Sin embargo, existe otro mecanismo alternativo dependiente de la maquinaria ESCRT, que requiere el ensamblaje secuencial de los complejos ESCRT-0, ESCRT-I, ESCRT-II y ESCRT-III. Ambos mecanismos pueden coexistir en los MVBs y estar cada uno de ellos implicado en la formación de poblaciones diferentes de exosomas 121 107. Con el fin de determinar cómo afectaba cada uno de estos sistemas en la secreción de TnC, se llevó a cabo el silenciamiento tanto de las esfingomielinasas 1 y 2 (nSMase1/Smpd2, nSMase2/Smpd3) como de TSG101 (un componente clave del ensamblaje del complejo ESCRT-I) mediante ARNs de interferencia. Tras confirmar la eficiencia en el silenciamiento de estas proteínas en fibroblastos Cav1WT mediante Western Blot y PCR cuantitativa (Figura R30), se analizó su efecto sobre la capacidad para depositar matriz tanto de TnC como de FN en MEFs Cav1WT. Los resultados mostraron una reducción en la secreción de ambas proteínas de matriz (TnC y FN) con todos los ARNi testados. Sin embargo, el efecto era especialmente drástico tras el silenciamiento de la vía de síntesis de ceramida, reforzando los datos previamente obtenidos con el inhibidor farmacológico de esta ruta (GW4869) (Figura R31). Estos datos corroboran el papel de los exosomas como un mecanismo de deposición de ECM general, siendo la biogénesis de exosomas a través de ceramida la principal vía implicada en este proceso.    Pág ina 10 2  Figura R30. Determinación de la eficiencia de silenciamiento de la maquinaria implicada en la biogénesis de los exosomas mediante la utilización de ARNi específicos. (a-b) Análisis de la expresión de TSG101 y de las esfingomielinasas nSMase1 y 2 tras la transfección de MEFs Cav1WT con ARNi específicos frente a dichas proteínas, (a) mediante PCR cuantitativa (b) mediante análisis por Western Blot (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar; n = 4; * p < 0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001). Figura R31. El silenciamiento de la maquinaria implicada en la biogénesis de exosomas inhibe la formación de matriz extracelular rica en TnC y FN. MEFs Cav1WT fueron transfectadas con ARNi para reducir la expresión de TSG101, nSMase 1 y nSMase 2. Posteriormente se procedió a analizar la matriz extracelular producida por las células en dichas condiciones. (a) Proyecciones máximas representativas de imágenes obtenidas mediante microscopía confocal correspondientes a la matriz de TnC (rojo) (barra de escala, 20 µm). Las flechas blancas señalan células que presentan una acumulación intracelular de TnC. El gráfico de barras muestra la cuantificación, mediante un programa informático, del número de fibras producidas      Pág ina 10 3  en presencia de cada uno de los ARNi utilizados (las barras de error indican valores medios ± SEM; n = 5; * p < 0,05, ** p <0,01, *** p < 0,001). (b) Cuantificación mediante análisis por Western Blot de la cantidad de TnC acumulada intracelularmente inducida por los diferentes ARNi empleados (las barras de error indican valores medios ± SEM; n = 9; * p < 0,05). (c) Proyecciones máximas representativas de imágenes obtenidas mediante microscopía confocal correspondientes a la matriz de FN (verde) (barra de escala, 50 µm). El gráfico de barras muestra la cuantificación, mediante un programa informático, del número de fibras producidas en presencia de cada uno de los ARNi utilizados (las barras de error indican valores medios ± SEM; n = 5; * p < 0,05). 4.4 La incorporación de TnC en exosomas se produce a través de su síntesis de novo Con el fin de entender cuáles eran los mecanismos a través de los cuáles se producía la incorporación de TnC en los exosomas llevamos a cabo diferentes abordajes. En primer lugar, y para descartar la posibilidad de que estuviese ocurriendo de forma pasiva una vez que éstos hubieran sido secretados al medio como consecuencia de la unión inespecífica de TnC previamente existente en el medio extracelular, desarrollamos un ensayo basado en la generación de matrices derivadas de células (CDMs: Cell-Derived-Matrices). Para ello, se cultivaron durante 8 días tanto MEFs WT para la expresión de TnC (TnCWT) como MEFs en los que la expresión de esta proteína estaba delecionada (TnCKO). Posteriormente, se llevó a cabo la decelularización mediante lisis alcalina obteniéndose como resultado la matriz extracelular generadas por estas células (CDM TnCWT y CDM TnCKO) (Figura R32a). Mediante microscopía confocal se pudo confirmar la ausencia de TnC en los CDMs generados por los fibroblastos TnCKO, aunque la deposición de otras proteínas de matriz extracelular tales como la FN no se encontraba alterada respecto al control (Figura R32b). Las CDMs derivadas de estas dos líneas celulares se extrajeron y se incubaron a 37ºC junto con exosomas purificados a partir de MEFs TnCKO. Tras la incubación, se procedió a una nueva purificación de los diferentes exosomas, para eliminar así toda la matriz extracelular que no se hubiese unido a éstos. Como control se incluyeron exosomas producidos por fibroblastos TnCWT incubados con CDMs producidas por estas mismas células (Figura R32c). El análisis por Western Blot demostró que, aunque las matrices derivadas de MEFs TnCWT contenía cantidades considerables de TnC, esta proteína no co-precipitaba junto con los exosomas TnCKO (Figura R32c). Este ensayo por tanto demuestra que la incorporación de TnC a los exosomas no se produce por su unión pasiva una vez que estos se han liberado al medio extracelular.    Pág ina 10 4  Figura R32. TnC no tiene la capacidad de unirse a los exosomas una vez que estos se han secretados. (a) Caracterización de los MEFs TnCWT y TnCKO. (Parte superior) Western Blot representativo de los niveles de expresión de TnC, FN y Cav1 en lisados celulares de MEFs TnCWT y TnCKO. (Parte inferior) Imágenes representativas obtenidas mediante microscopía confocal de la matriz de TnC producidos por ambas líneas celulares (barra de escala, 50 µm). (b) Generación de matrices extracelulares tridimensionales (CDMs) producidas por MEFs TnCWT y TnCKO. Las imágenes representativas obtenidas mediante microscopía confocal muestran la presencia y distribución de la matriz de FN (verde) y TnC (rojo) que permanece tras la lisis alcalina de las células que la han producido (ver Materiales y métodos) (barra de escala, 20 µm). (c) (Izquierda) Esquema explicativo del diseño experimental. Los exosomas producidos por MEFs TnCWT (amarillo) y TnCKO (azul) fueron purificados. A continuación, se incubaron en presencia de las CDMs derivadas de MEFs TnCWT y MEFs TnCKO tal y como se muestra en el esquema (TnC, fibras rojas; FN, fibras verdes). Tras la incubación, los exosomas fueron purificados y analizados mediante Western Blot para determinar lo niveles de TnC y FN unidos a los exosomas procedentes de una matriz extracelular preexistente (CDMs). Los datos anteriores sugieren por tanto que la incorporación de esta proteína de matriz a nivel exosomal debe ocurrir intracelularmente planteándose de nuevo dos posibles vías para su incorporación. La primera de ellas implicaría la entrada de TnC al MVB para su posterior envío a los exosomas a través de un mecanismo de endocitosis de esta proteína desde el exterior celular, y otra derivada de su incorporación intracelular, tras su síntesis, hasta los MVBs. Para comprobar la posibilidad de que las células tuviesen la capacidad de endocitar matriz extracelular, internalizando así TnC dentro de la ruta del endosoma/MVB para su posterior incorporación a exosomas, se generaron CDMs tanto de fibroblastos TnCWT como de TnCKO. Tras la decelularización se obtuvieron las CDMs producidas por estas células, sembrándose a continuación sobre ellas MEFs TnCWT o TnCKO tal y como se indica en el esquema de la figura R33. Pasadas 24 h, las células se trataron con la proteasa tripsina para su      Pág ina 10 5  separación de la matriz y los lisados celulares correspondientes se analizaron mediante Western Blot, permitiéndonos evaluar específicamente la cantidad de TnC internalizada procedente del medio extracelular. Además, como control, se incluyeron muestras que fueron directamente lisadas, sin tratamiento con la proteasa, obteniéndose así un lisado del total de proteínas (que incluyen tanto las proteínas celulares como las proteínas presentes en las CDMs sobre las que se han sembrado). Los resultados muestran una ausencia de TnC intracelular dentro de los fibroblastos TnCKO cultivados sobre CDMs ricas en TnC, excluyendo así la endocitosis de TnC extracelular como principal vía de incorporación de esta proteína a los exosomas. Figura R33. La endocitosis de TnC no es la principal vía de incorporación de TnC a los exosomas. (a) Esquema explicativo del diseño experimental. CDMs obtenidas a partir de MEFs TnCWT (amarillo) y TnCKO (azul) fueron generadas tras su decelularización. A continuación, MEFs TnCWT y TnCKO fueron nuevamente sembradas sobre dichas matrices tal y como se indica en la figura. En la parte inferior se muestran las imágenes obtenidas mediante microscopía confocal de las matrices generadas por estas líneas celulares teñidas con TnC (rojo) y de las células sembradas sobre las mismas teñidas con faloidina (actina, blanco) (barra de escala, 20 µm). (b) Análisis por Western Blot de los niveles de TnC y FN presentes en los extractos celulares totales (CDMs + células sembradas) y de los lisados intracelulares (células sembradas y extraídas mediante el tratamiento con proteasas) (ver Materiales y métodos). Tubulina se empleó como control de carga. Todos estos resultados nos llevan por tanto a que el origen de la TnC que se incorpora a los exosomas debe ser completamente intracelular procedente de la ruta biosintética. Apoyando esta hipótesis, resultados previos mostraron cómo tanto la ausencia de Cav1 como la inhibición de la biogénesis/secreción de exosomas producía,    Pág ina 10 6  de manera general, la acumulación de TnC en el interior celular. Para caracterizar en detalle en qué compartimento intracelular se produce la acumulación de TnC, se llevó a cabo un fraccionamiento subcelular mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa de lisados tanto de MEFs Cav1WT (control y tratados con la droga GW4869) como de MEFs Cav1KO. Este método nos permitió separar los MVBs, del retículo endoplásmico/aparato de Golgi (ambos compartimentos fraccionan juntos en este método de separación). El análisis de las fracciones obtenidas se realizó mediante Western Blot usando marcadores específicos de retículo endoplásmico (calreticulina), aparato de Golgi (GM130) y cuerpos multivesiculares (CD63) (Figura R34a). En el caso de los MEFs Cav1WT, TnC co-fraccionaba con CD63 y calreticulina (fracciones 3 – 7). Sin embargo, tras el tratamiento de estas células con el inhibidor de exosomas GW4869, TnC se excluyó prácticamente en su totalidad de las fracciones positivas CD63, distribuyéndose principalmente en las fracciones enriquecidas en el retículo endoplásmico (fracciones 10 – 12), una redistribución que se recapitulaba también en las células Cav1KO. Corroborando estos datos, se pudo observar mediante inmunofluorescencia una elevada colocalización entre TnC y calreticulina en células Cav1WT tratadas con GW4869, colocalización que aumentaba considerablemente tras el tratamiento con cloroquina (un inhibidor de la degradación lisosomal) tanto de las células pretratadas con GW4869 (Figura R34b) como de células Cav1KO (Figura R34c). Finalmente, también se decidió tratar las células con monensina A, un antibiótico poliéter que actúa como ionóforo de Na+/H+, que es capaz de aumentar la secreción de exosomas. Sin embargo, también se ha observado que disrumpe el correcto funcionamiento del retículo 244. Acorde con esto, las células que son tratadas con esta droga presentan acúmulos de TnC, aunque sus exosomas si poseen altos niveles de Cav1, cuya incorporación muestra una mayor dependencia de su endocitosis (Figura R34d). Todos estos resultados sugieren que la transferencia de TnC debe producirse intracelularmente desde el retículo, donde tiene lugar su síntesis, al interior de los MVBs en ruta hacia la formación de exosomas. De manera que una transferencia defectuosa ER-MVB daría como resultado una acumulación de TnC en el retículo, siendo su destino final la degradación como vía de eliminación de este exceso de TnC acumulada. Esto permitiría entender las diferencias en la acumulación de TnC observadas entre las células Cav1KO o las células Cav1WT tratadas con GW4869 o con U18666A.      Pág ina 10 7  Figura R34. La incorporación de TnC a los exosomas ocurre intracelularmente a través de la ruta retículo endoplasmático-endosoma/MVB. (a) (Parte superior) Análisis mediante Western Blots de la distribución intracelular de TnC en MEFs Cav1WT control y tratados con el inhibidor de exosomas GW4869 y de MEFs Cav1KO tras fraccionamiento subcelular en gradientes de sacarosa. Se analizó la correlación en el patrón de distribución de TnC a lo largo del gradiente con respecto a los marcadores de retículo endoplásmatico (calreticulina) y el marcador de MVB (CD63). El área enmarcada con la línea discontinua indica las fracciones enriquecidas en MVBs. (Parte inferior) La gráfica representa el porcentaje de los niveles de TnC en cada fracción con respecto al total (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 3). (b) Estudio mediante inmunofluorescencia de la colocalización de TnC (rojo) y calreticulina (verde) en MEFs Cav1WT control, tratados con GW4869 y con GW4869 + cloroquina (inhibidor lisosomal) (barra de escala, 40 µm). Las imágenes magnificadas muestran    Pág ina 10 8  zonas representativas en las que se aprecia una clara colocalización entre ambas proteínas cuando las células son tratadas con GW4869 siendo incluso más evidente tras el tratamiento combinado GW4869 + cloroquina (barra de escala, 15 µm). (c) Inmunofluorescencia representativa de la colocalización existente entre TnC (rojo) y calreticulina (verde) en MEFs Cav1KO tratadas con cloroquina. Las flechas blancas muestran zonas de acumulación intracelular de TnC (barra de escala, 15 µm). (d) Estudio de la colocalización entre TnC (rojo) y LBPA (MVBs, verde) en MEFs Cav1WT tratados con monensina, un ionóforo que promueve la desorganización del retículo endoplasmático (barra de escala, 15 µm). La cuantificación muestra la reducción de la colocalización entre TnC y LBPA tras el tratamiento con dicha droga (las barras indican valores medios ± desviación estándar, n = 3, *** p < 0,001). 4.5 Los exosomas generan puntos de nucleación de TnC. Implicaciones funcionales A continuación, decidimos estudiar si los exosomas purificados son capaces de generar nuevos puntos de nucleación para la formación de nueva matriz, así como el efecto funcional que esta nueva matriz provocaba sobre la motilidad y capacidad invasiva de células tumorales en diferentes modelos. 4.5.1 Modelos bidimensionales En primer lugar, se evaluó la capacidad de los exosomas purificados a partir de MEFs Cav1WT o Cav1KO de depositar directamente TnC en cultivos en dos dimensiones (2D) de la línea celular no invasiva MDA-MB-468. Se trata de una línea de cáncer de mama que presenta un fenotipo altamente epitelial caracterizada por la ausencia de expresión tanto de Cav1 como de TnC. Tras tratar estas células con exosomas Cav1WT y Cav1KO previamente marcados con una sonda fluorescente denominada PKH67 (en verde), se observó cómo las células MDA-MB-468 eran capaces de internalizar ambos tipos de exosomas con una eficacia similar, apreciándose también que parte de los exosomas se quedaban depositados en el exterior celular (figura R35). Sin embargo, sólo los exosomas Cav1WT mostraron la capacidad de desarrollar tinción positiva para TnC en áreas cercanas a la periferia celular (Figura R35 en rojo), mostrando la aparición de nuevos puntos de nucleación de matriz de TnC. Por el contrario, los cultivos MDA-MB-468 expuestos a los exosomas Cav1KO mostraron niveles basales de deposición de TnC similares a los mostrados por los cultivos control (expuestos a PBS). Estos resultados indicaban que los exosomas por sí mismos son capaces de generar núcleos ricos en matriz extracelular de manera efectiva in vitro.      Pág ina 10 9  Figura R35. Los exosomas generan puntos de nucleación de TnC alrededor de las células aceptoras. Microscopía confocal de células MDA-MB-468 tratadas con exosomas producidos por MEFs Cav1WT y Cav1KO marcados con la sonda PKH67 (verde). Se analizó la capacidad de los exosomas de depositar TnC (rojo) en un cultivo 2D (barra de escala, 20 µm). E-Cadherina se utilizó como marcador para definir la morfología celular (en gris). Las imágenes magnificadas corresponden al área enmarcada (barra de escala, 10 µm). Las flechas blancas muestran la presencia de los exosomas depositados en el espacio extracelular. Las flechas grises señalan regiones dónde se observa la presencia de depósitos extracelulares de TnC. Esta deposición de TnC mediada por los exosomas Cav1WT indujo importantes cambios morfológicos en las células MDA-MB-468, provocando la pérdida de adhesión célula-célula que caracteriza a esta línea celular y favoreciendo la internalización del marcador epitelial E-cadherina. Asociado a esta reducción en las uniones celulares se observó un aumento del número de protrusiones y de emisión de filopodios (Figura R36a). Estos cambios, además provocaron una reestructuración del citoesqueleto de actina sugiriendo un proceso similar a una transición epitelio-mesénquima (EMT; Epithelial-Mesenchymal Transition) (Figura R36a y b). En consonancia con estos cambios morfológicos similares a la EMT, las células MDA-MB-468 mostraron una mayor capacidad migratoria y un aumento en su capacidad invasiva tal y como se demostró mediante estudios de cierre de herida y de migración en transwell o en cámara de Boyden (Figura R36c y d). En el primer caso, se generó una monocapa de células MDA-MB-468 y se procedió a realizar una “herida” o área libre de células mediante raspado. Posteriormente, y mediante la captura periódica de imágenes, se evaluó el efecto que los exosomas provocaban sobre la capacidad migratoria de estas células para recubrir esta zona. La exposición de MDA-MB-468 a exosomas Cav1WT permitió a estas células cerrar la herida a mayor velocidad que aquellas que habían sido tratadas con los exosomas Cav1KO. De manera similar,    Pág ina 11 0  ensayos de transwell o en cámara de Boyden en los que se mide la capacidad de las células de atravesar una membrana de policarbonato (capacidad migratoria-invasiva) permitió nuevamente confirmar cómo los exosomas Cav1WT conferían una mayor capacidad migratoria a las células MDA-MB-468 en comparación con los exosomas Cav1KO (Figura R36d). Figura R36. La deposición de TnC mediada por exosomas induce la motilidad de las células MDA-MB-468 en un sistema 2D. Exosomas procedentes de MEFs Cav1WT y Cav1KO fueron purificados y añadidos a cultivos de células MDA-MB-468. (a) Microscopía de contraste de fases de células MDA-MB-468 tratadas durante 36h con dichos exosomas (paneles superiores). Para los estudios realizados mediante microscopía confocal las células se tiñeron con faloidina (marcador de actina) y los núcleos se marcaron con Hoescht (paneles centrales) o con el marcador de transición epitelio-mesénquima, E-cadherina (paneles inferiores) (barra de escala 20 µm). Las imágenes magnificadas muestran la redistribución de E-cadherina desde los contactos célula-célula a los compartimentos intracelulares (barra de escala, 10 µm). (b) Análisis por Western Blot de los niveles de E-cadherina en células MDA-MB-468 tratadas con exosomas Cav1WT y Cav1KO. (c) Ensayo de cierre de herida de las células MDA-MB-468 en presencia de los exosomas producidos por MEFs Cav1WT y MEFs Cav1KO. (Izquierda) Microscopía de contrate de fase mostrando el avance de las células hacia la zona de cierre (la línea blanca indica la posición del frente de avance a tiempo inicial y la línea roja su posición a tiempo final. (Derecha) Cuantificación del área relativa de la herida en los tiempos indicados (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 6). (d) Ensayo de migración en cámara de Boyden o Transwell. Se determinó el número de células MDA-MB-468 capaces de atravesar      Pág ina 11 1  la membrana tras el tratamiento con los exosomas indicados (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 3, ** p < 0,01). 4.5.2 Modelos tridimensionales In vivo, las células y la matriz extracelular constituyen un entramado tridimensional (3D). Con el fin de aproximarnos a estas condiciones más fisiológicas, decidimos evaluar la capacidad de los exosomas de depositar matriz en un sistema tridimensional basado en la generación de esferoides a partir de las células tumorales MDA-MB-468. Estos esferoides son estructuras tridimensionales que se generan mediante ensamblaje de las células y que dependen tanto de la comunicación intercelular como de la organización de la ECM para su formación. Para ello, se cultivó el número de células deseado (en nuestro caso utilizamos 5000 células MDA-MB-468) en presencia de metilcelulosa y en suspensión, permitiendo su agregación hasta conseguir la formación de estructuras esféricas y compactas (ver materiales y métodos). De este modo, se generaron esferoides incluyendo en la preparación exosomas derivados de fibroblastos Cav1WT y Cav1KO, además se incluyeron también en estos estudios exosomas producidos por MEFs Cav1WT silenciadas para la expresión de Cav1 (Cav1KD). De manera similar a lo observado en los estudios en dos dimensiones, los exosomas ricos en TnC derivados de los fibroblastos Cav1WT, pero no aquellos derivados de células Cav1KO o Cav1KD permitieron la formación de depósitos de TnC en el interior de los esferoides (Figura R37a). Además, en este modelo 3D se aprecia la presencia de TnC no sólo en forma de pequeños acúmulos sino formando estructuras fibrilares (no presentes en los modelos 2D), sugiriendo que fuerzas generadas por las propias células en este sistema tridimensional permiten el remodelado estructural de los depósitos, induciendo la formación de fibras de TnC. La reconstrucción tridimensional de la distribución de las fibras de TnC formadas en el interior del esferoide en presencia de exosomas Ca1WT mostraba una localización preferentemente en los espacios intersticiales formados entre las células (Figura R37b). Estos datos respaldarían nuevamente el papel de los exosomas como mecanismos transportadores de proteínas de matriz extracelular implicados en su deposición.    Pág ina 11 2  Figura R37. Los exosomas generan una matriz extracelular de TnC en modelos tridimensionales. (a) (Izquierda) Proyecciones máximas obtenidas por microscopía confocal de esferoides de MDA-MB-468 generados en presencia exosomas producidos por MEFs Cav1WT, Cav1KO y Cav1KD. TnC se marcó en rojo y los núcleos aparecen teñidos con Hoechst (azul) (barra de escala, 150 µm). Las imágenes magnificadas muestran la distribución de TnC en el interior del esferoide (barra de escala, 50 µm). Las flechas blancas indican la presencia de TnC organizada en forma de estructuras fibrilares. (Derecha) Cuantificación de la formación de fibras en el interior de los esferoides en cada una de las condiciones indicadas anteriormente (las barras de error indican valores medios ± SEM, n = 3, * p < 0,05). (b) Reconstrucción tridimensional de la disposición de las fibras de TnC (rojo) en los esferoides. La delimitación de la periferia celular se realizó mediante tinción de la actina con el marcador faloidina (verde). Para caracterizar los efectos inducidos por los exosomas Cav1WT y Cav1KO sobre los esferoides formados a partir de las células MDA-MB-468, éstos se depositaron sobre una superficie plana y se monitorizó in vivo el comportamiento migratorio de las células que los constituyen mediante microscopía de campo claro durante un periodo de 72 h. Los esferoides generados en presencia de exosomas derivados de los fibroblastos Cav1WT mostraron una migración significativamente mayor de las células periféricas del esferoide hacia el exterior comparados con los esferoides tratados con los exosomas Cav1KO (Figura R38a), que permanecieron altamente compactados. Para confirmar el papel de TnC en este proceso se llevó cabo el mismo ensayo utilizando exosomas derivados de fibroblastos TnCKO (Figura R38d). Los resultados mostraron que los exosomas TnCKO apenas estimulaban la capacidad migratoria de las células del esferoide en comparación con su control.      Pág ina 11 3  A continuación, evaluamos si estos cambios fenotípicos promovidos por exosomas Cav1WT sobre los esferoides tumorales se traducían también en cambios en su capacidad invasiva a través de diferentes sustratos. Para ello se llevaron a cabo ensayos de invasión en Matrigel (Figura R38b) y ensayos de invasión 3D en geles de colágeno (Figura R38c). Los resultados mostraron cómo los esferoides tratados con exosomas Cav1KO tenían una capacidad de invasión reducida respecto a los controles, similar a la producida por tratamiento de los esferoides con exosomas TnCKO (Figura R38e). Todo esto apoya nuevamente el hecho de que la capacidad de los exosomas producidos por los fibroblastos Cav1WT de inducir estos cambios fenotípicos y funcionales sobre los esferoides se deriva principalmente de la presencia de TnC y su capacidad para depositarla.    Pág ina 11 4  Figura R38. La matriz de TnC generada por los exosomas en el interior de los esferoides promueve la migración e invasión celular. (a-c) Estudio del efecto de los exosomas producidos por MEFs Cav1WT y Cav1KO sobre la capacidad migratoria e invasiva de los esferoides de células MDA-MB-468. (a) Los esferoides generados en presencia de los exosomas indicados se colocaron sobre una placa de 96 pocillos y se mantuvieron en cultivo durante 72 h para evaluar la capacidad migratoria de las células hacia el exterior del esferoide mediante microscopía de contraste de fase (barra de escala, 150 µm). Las líneas blancas indican el lugar del frente de avance en momento inicial, mientras que las líneas rojas muestran la localización de su posición a tiempo final (72h). El gráfico muestra la cuantificación del área relativa de los esferoides en los tiempos indicados (las barras de error indican valores medios ± SEM, n = 11, ** p < 0,01, *** p < 0,001). (b) Ensayo de invasión de los esferoides incluidos en Matrigel durante 24, 48 y 144h. Se muestran imágenes de microscopía de contraste de fase (barra de escala, 75 µm). (c) Ensayo de invasión de los esferoides incluidos en geles de colágeno tipo I. La microscopía confocal muestra la tinción de los esferoides para la actina (usando faloidina, rojo) y los núcleos celulares (utilizando Hoescht, azul) que permite observar las células que han sido capaces de migrar a través del colágeno (flechas blancas) (barra de escala 50 µm). En la parte inferior se muestra la cuantificación de la invasión relativa (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 24 esferoides, * p < 0,05). (d-e) Estudio de la migración e invasión de los esferoides de células MDA-MB-468 generados en presencia de exosomas producidos por MEFs TnCWT y TnCKO. (d) (Izquierda) El análisis mediante Western Blot muestra los niveles de TnC en los exosomas producidos por MEFs WT y TnCKO. (Derecha) Los esferoides generados en presencia de los exosomas TnCWT y TnCKO se depositaron sobre una placa de 96 pocillos y se mantuvieron en cultivo durante 72 h para evaluar la capacidad migratoria de las células hacia el exterior del esferoide mediante microscopía de contraste de fase. El gráfico muestra la cuantificación del área relativa de los esferoides en los tiempos indicados (las barras de error indican valores medios ± SEM, n = 11, * p < 0,05). (e) Ensayo de invasión de los esferoides generados como en d) tras su inclusión en geles de colágeno tipo I. La capacidad invasiva se evaluó mediante microscopía confocal realizando la tinción de la actina celular con faloidina (rojo) y de los núcleos celulares con Hoechst (azul). Las flechas blancas muestran células que han sido capaces de invadir a través de la matriz de colágeno. (barra de escala 75 µm). En la derecha se muestra la cuantificación de la invasión relativa (las barras de error indican valores medios ± desviación estándar, n = 15 esferoides, * p < 0,05). 4.5.3 Los exosomas Cav1WT crean nichos ricos en TnC en un modelo animal in vivo Los exosomas son secretados al medio extracelular y ocasionalmente pueden llegar al torrente sanguíneo para su diseminación por todo el organismo, pudiendo actuar como mensajeros entre diferentes órganos. De hecho, estudios previos muestran la capacidad de los exosomas producidos a partir de un tumor primario de inducir la formación de nichos pre-metastáticos en localizaciones distantes al lugar donde se han producido 157,158 . Por este motivo, se decidió evaluar la capacidad de los exosomas de generar puntos de nucleación de matriz extracelular en diferentes órganos mediante su diseminación a través del torrente sanguíneo. Para ello, marcamos exosomas Cav1WT y Cav1KO con la sonda fluorescente PKH67 inyectándose a través de la vena caudal de ratones TnCKO, cada 24h durante un periodo correspondiente a una semana. Pasado ese tiempo, se extrajeron los diferentes órganos pudiéndose apreciar mediante los estudios histopatológicos que tanto los pulmones como el hígado eran los órganos en los que se producía una acumulación preferencial de los exosomas inyectados      Pág ina 11 5  (Figura R39a). El posterior análisis de la presencia de TnC en estos órganos, reveló que sólo aparecían depósitos significativos de TnC en el caso de los ratones tratados con los exosomas Cav1WT, a pesar de que la cantidad de ambos tipos de exosomas alcanzaban de manera similar ambos órganos (Figura R39b y R40). En el caso del hígado, la acumulación de TnC producida por los exosomas Cav1WT se localizaba principalmente en los sinusoides de este órgano, no apreciándose depósitos ni en los ratones inyectados con el vehículo (PBS) ni en aquellos tratados con exosomas Cav1KO (Figura R39b). Respecto al pulmón, los niveles de exosomas que alcanzaron este órgano, fueron menores que los observados en el caso del hígado apareciendo parcialmente internalizados a nivel de ciertas células constituyentes de este órgano. Nuevamente la presencia de TnC en este órgano se produjo tras el tratamiento con exosomas Cav1WT localizándose preferentemente en la periferia de estas células (Figura R40). Todos estos datos demuestran que los exosomas pueden actuar como generadores de nuevos puntos de nucleación de matriz extracelular in vivo, creando así microambientes ricos en TnC que podrían potencialmente actuar como promotores para el desarrollo de futuras metástasis.    Pág ina 11 6  Figura R39. Los exosomas favorecen la deposición de TnC in vivo en diferentes tejidos: Hígado. (a) Esquema explicativo del procedimiento experimental. Los exosomas producidos por MEFs Cav1WT y Cav1KO fueron purificados y marcados con la sonda fluorescente PKH67. Los exosomas correspondientes a 7 µg de proteína fueron inyectados en ratones carentes de la expresión de TnC (ratones TnCKO). A continuación, se procedió a la eutanasia de los ratones y extracción de los diferentes órganos para su evaluación. Hígado y pulmones son los órganos principales de acumulación de los exosomas circulantes. (b) Análisis por microscopía confocal de la capacidad de los exosomas de generar nuevos puntos de nucleación en el hígado. Se muestran proyecciones máximas representativas obtenidas mediante microscopía confocal de cortes correspondientes a los hígados de los ratones tratados. La actina se marcó con faloidina (blanco), y la TnC aparece en rojo. Los exosomas marcados con PKH67 se muestran en verde (barra de escala, 60 µm). (Derecha) Imágenes ampliadas de la zona enmarcada muestran la presencia de depósitos de TnC generados por deposición a través de exosomas (flechas blancas) a nivel de los sinusoides hepáticos (barra de escala, 30 µm). Figura R40. Los exosomas favorecen la deposición de TnC in vivo en diferentes tejidos: Pulmón. Análisis por microscopía confocal de la capacidad de los exosomas de generar nuevos puntos de nucleación de TnC en el pulmón. En las imágenes se muestran las proyecciones máximas obtenidas mediante microscopía confocal de los cortes correspondientes a los pulmones de los ratones tratados con exosomas. La actina se marcó con faloidina (blanco), y la TnC aparece en rojo. Los exosomas marcados con PKH67 se encuentran en verde (barra de escala, 60 µm). (Derecha) Las imágenes ampliadas de la zona enmarcada muestran la presencia de depósitos de TnC generados por deposición a través de exosomas (flechas blancas) a nivel de las células pulmonares (barra de escala, 30 µm).      Pág ina 11 7     Pág ina 11 8         Pág ina 11 9  5. DISCUSIÓN   DISCUSIÓN    Pág ina 12 0       Pág ina 12 1  Desde su descubrimiento, los exosomas se han convertido en uno de los campos más prometedores en el área de investigación biomédica dado su carácter ubicuo (al ser producidos por la mayoría de tipos celulares y estar presentes en la mayoría de los fluidos corporales  150) y por su amplio abanico de funciones en situaciones fisiopatológicas. Uno de los marcos más estudiados es el papel de los exosomas en la comunicación entre las células tumorales y el estroma, en el que actúan no solo a nivel local sino también a distancia, permitiendo la modulación de diferentes respuestas a nivel sistémico 147 148 158 245. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la biogénesis, la determinación de sus cargos y su funcionalidad siguen siendo desconocidos en muchos aspectos. A lo largo de esta Tesis Doctoral se ha abordado el papel de Caveolina-1 (Cav1) como elemento modulador en la biogénesis de exosomas y su impacto funcional. Mediante estudios comparativos de proteómica y lipidómica, hemos podido demostrar que Cav1 modula de manera específica los cargos que se incorporan a los exosomas a través de la segregación de diferentes subpoblaciones de exosomas mediante de su capacidad para regular los niveles de colesterol a nivel de los cuerpos multivesiculares (MVB, MultiVesicular Body). En concreto, nuestros datos muestran que los exosomas derivados de fibroblastos que expresan Cav1 se encuentran significativamente enriquecidos en componentes de la matriz extracelular (ECM, ExtraCellular Matrix), siendo especialmente relevante la presencia de TnC, proteína de gran interés dada su implicación en la progresión tumoral 242 246.  Además, hemos visto que la inhibición de la biogénesis y secreción de exosomas impacta directamente en la deposición de ciertos componentes de matriz mostrando la importancia de estas nanovesículas como un nuevo mecanismo implicado en su deposición. Apoyando el papel relevante de Cav1 en este proceso, se ha demostrado que los exosomas derivados de fibroblastos que expresan Cav1 dan lugar a depósitos de TnC en áreas de la periferia de las células de tumor de mama (MDA-MB-468) lo que resulta en cambios en su migración e invasión. Por otro lado, el papel de los exosomas en la deposición de ECM, se ha podido recapitular in vivo, lo que sugiere un papel fundamental de Cav1 en la modulación no sólo del estroma que rodea al tumor, sino también en la posible generación de nuevos nichos premetastáticos en órganos distantes. Nuestro trabajo nos permite proponer a Cav1 como un elemento clave en la organización del microambiente tumoral a nivel local y en órganos distantes. Gracias a su capacidad de modular la plasticidad de los MVBs, Cav1 es capaz de modular la biogénesis de exosomas ricos en componentes de matriz que actúan como nuevos    Pág ina 12 2  vehículos para su deposición (Figura D1, modelo). Las posibles implicaciones de los resultados obtenidos, así como las propuestas para futuros trabajos y sus posibles aplicaciones se delinean en este trabajo. 5.1 Cav1 en la biogénesis de exosomas Cav1, es un elemento clave para la formación de caveolas y participa en la transducción y modulación de diversas rutas de señalización, estando implicada en multitud de procesos. Entre otros mecanismos, Cav1 interviene en la compartimentación e integración de señales gracias a su capacidad no sólo de modular la organización de la membrana mediante la generación de microdominios ricos en colesterol, sino de regular su dinámica a través de procesos de internalización168 197 198. Ejemplo de ello es el control de los niveles de integrinas presentes en la membrana plasmática, así como de canales de iones o de ciertos receptores de hormonas como la insulina 184 247 248. Numerosos trabajos se han enfocado a entender cómo se regula la internalización de Cav1, aunque las señales que la desencadenan, así como sus posibles implicaciones funcionales aún se encuentran en estudio 166. Una vez producida la endocitosis, Cav1 puede continuar en la vía endosomal, donde tal y como se ha observado, puede actuar como regulador de microdominios especializados en la compartimentación de cascadas de señalización 206 207. A continuación, aunque clásicamente se ha considerado esta internalización de Cav1 a los MVBs como una vía directa para su degradación a nivel lisosomal, recientes estudios muestran cómo estímulos tales como la perturbación del pH lisosomal, o cambios en los niveles de colesterol celular promueven la presencia de Cav1 en MVBs sin alterar su tasa de degradación 195, lo que apunta a la existencia de vías de regulación alternativas para esta población de Cav1. Nuestros datos muestran cómo los exosomas constituyen una de estas posibles vías. En este trabajo hemos observado que al menos parte de la Cav1 que se endocita a través del sistema endosomal tiene como destino final su incorporación a los exosomas, a través de un proceso constituido por dos etapas consecutivas. Una primera, en la que la fosforilación en el residuo Y14 de Cav1 (inducida bien por estimulación por vanadato, o mediante desensamblaje de la caveolas a través de la eliminación de la expresión de PTRF) promueve su incorporación hasta la membrana externa de los endosomas tardíos/MVBs (Figura R2). Una vez allí, Cav1 puede incorporarse en las vesículas intraluminales (ILVs, IntraLuminal Vesicle) localizadas en el lumen de los endosomas tardíos a través de un proceso que depende directamente de su monoubiquitinación en los residuos de lisina localizados en su extremo N-terminal.      Pág ina 12 3  Finalmente, si los MVBs son dirigidos hacia la membrana plasmática, Cav1 será secretada formando parte de la membrana de los exosomas. Estos datos ponen de manifiesto la existencia de una estrecha relación entre la fosforilación y ubiquitinación de Cav1, a través de la cual se conectan las señales que inducen su endocitosis con su tráfico intracelular y su presencia en exosomas. El estudio de las conexiones existentes entre diferentes modificaciones post- traduccionales de proteínas es un campo emergente. En la actualidad se ha observado que ciertas modificaciones pueden afectar a otras presentes en diferentes dominios de una misma proteína, y que la regulación de un gran número de funciones celulares se encuentra condicionado por este tipo de interacciones, determinando las interacciones proteína-proteína 249 250, el anclaje de proteínas a membranas específicas 251 e incluso su tráfico intracelular 252. Por otro lado, diferentes trabajos señalan que cambios en las modificaciones post-traduccionales de proteínas localizadas en los MVBs pueden jugar un papel importante en la configuración de su destino hacia la fusión con el lisosoma o con la membrana plasmática para la liberación de los exosomas 121 129  253. En el caso de Cav1, además de la fosforilación en su residuo de tirosina en posición 14 y su ubiquitinación a nivel amino terminal, otras modificaciones post-traduccionales tales como palmitoilación, podrían ser fundamentales para modular dinámicamente el balance de caveolina entre su degradación o su secreción exosomal 254 y actuar como mecanismo de incorporación selectiva a uno y otro tipo de MVBs. Estímulos específicos tales como la privación de suero o el tratamiento con rapamicina, redireccionan los MVBs para su fusión con el compartimento lisosomal  255. Nuevos estudios serán necesarios para evaluar el impacto que estos y otros estímulos tienen sobre Cav1 y/o sus diferentes modificaciones post-traduccionales para especificar su incorporación y liberación a través de los exosomas, así como el posible papel de Cav1 en la redirección de los MVBs. Aunque nuestros datos demuestran que la endocitosis de Cav1 es una de las vías de entrada para su secreción a través de exosomas, no podemos descartar que otros compartimentos intracelulares tales como el retículo endoplasmático (ER) pueden también servir también como fuente de Cav1 para su incorporación exosomal. Cav1 es un transportador del colesterol capaz de modular sus niveles en diferentes membranas celulares 193. Como ejemplo, se ha observado que Cav1 promueve el transporte de colesterol de nueva síntesis desde el ER hasta la membrana plasmática 208. En este sentido, la ausencia de Cav1 a nivel celular reduce la secreción    Pág ina 12 4  de colesterol provocando la acumulación de esta molécula en el ER, y favoreciendo su transporte hasta las mitocondrias mediante los contactos que se establecen entre ambos compartimentos a través de las MAMs 214 216. Por otro lado, una acumulación aberrante de Caveolina también puede generar un impacto en cuerpos lipídicos, provocando un desequilibrio en los niveles de colesterol 212,256 257. En este trabajo hemos observado que, en las células carentes de la expresión de Cav1, los MVBs también muestran una acumulación de colesterol (Figura R13). Aunque nuestros datos no nos permiten descartar que parte de este colesterol acumulado en los MVBs provenga de procesos de endocitosis desde la membrana plasmática, una de las hipótesis más plausibles es que, de forma similar a lo que sucede a nivel mitocondrial y en cuerpos lipídicos, el tráfico de colesterol a este compartimento se produzca a través de los contactos existentes entre el ER y los MVBs 238, pudiendo producirse una transferencia bidireccional de colesterol entre ambos compartimentos dependiendo de los niveles de Cav1 209. Alteraciones en los niveles de colesterol en los MVBs pueden afectar la plasticidad y estructura de sus membranas, influyendo en los procesos de formación de las ILVs que se originan en su interior (futuros exosomas) condicionando tanto el número de invaginaciones como a su morfología 238. De hecho, elevados niveles de colesterol promueven la escisión temprana de las ILVs impidiendo que puedan progresar a estructuras de mayor tamaño 239. Nuestros datos apoyarían esto ya que, por un lado, muestran que la acumulación de colesterol en los MVBs en células que no expresan Cav1 o en células Cav1WT tratadas con el inhibidor farmacológico U18666A, resulta en la formación de única población de exosomas homogénea y de menor tamaño comparada con la heterogeneidad observada en los exosomas producidos por las células Cav1WT control (Figura R14). Pero, además, hemos podido observar que este exceso de colesterol también genera una alteración en la estructura de la membrana de los exosomas y su composición lipídica, así como un aumento en su secreción. Estos datos, por tanto, confirman la importancia de Cav1 como modulador de la plasticidad del MVBs en la formación de exosomas presumiblemente a través de su capacidad para generar microdominios de membrana ricos reguladores de colesterol a nivel de los endosomas. Los exosomas pueden contener un gran número de cargos, cuya selección se produce durante el proceso de biogénesis. Es sabido que la maquinaria ESCRT participa en este proceso a través de la detección de proteínas monoubiquitinadas 103, sin embargo aún se desconocen con exactitud qué otros mecanismos participan en la selección específica de los diferentes cargos durante la biogénesis de exosomas.      Pág ina 12 5  Nuestros resultados proteómicos tanto de exosomas como de lisados celulares muestran como la presencia o ausencia de Cav1 impactan de manera diferencial en la naturaleza de los componentes proteicos que se incorporan de forma selectiva a los exosomas. En concreto, una de las familias de proteínas enriquecidas en exosomas que expresan Cav1 corresponde a las proteínas relacionadas con la biogénesis y funciones endosomales (Figura R18b). Estos datos refuerzan por tanto la importancia de Cav1 en la formación de exosomas permitiendo la integridad y correcto funcionamiento de los MVBs durante el proceso de formación de ILVs. En contraste con los exosomas producidos por las células Cav1WT, la población homogénea de exosomas secretados por las células Cav1KO muestra un significativo reclutamiento de anexinas. Esta familia de proteínas es capaz de unir colesterol en un proceso dependiente de Ca2+ 258 por lo que su incorporación en exosomas confirmaría el incremento en colesterol observado en MVBs Cav1KO que además, puede estar directamente relacionado con la tendencia de estos exosomas a agregar (datos observados), así como con la alteración observada en su arquitectura de membrana (Figura R15). En este mismo sentido hemos observado que en MEFs Cav1WT tratados con U18666A se produce una acumulación de Cav1 tanto en MVBs como en exosomas. Sin embargo, este aumento es menos significativo en el caso de la anexina A6 (datos no mostrados) comparado con exosomas Cav1KO, lo cual indicaría el papel de Cav1 en la regulación del colesterol endosomal y que de la misma manera que las anexinas tienen un papel en el tráfico de Cav1 196 237 esta última podría también interferir en su biología. Una de las enfermedades que cursa con una acumulación de colesterol a nivel de los endosomas tardíos es la enfermedad de Niemann-Pick C (NPC). Se trata de un síndrome genético autosómico recesivo que presenta un amplio espectro en su sintomatología, y aunque sus alteraciones más estudiadas son las que afectan al sistema neurológico, otros órganos como el hígado y el pulmón también se encuentran afectados 259. Esta enfermedad se produce principalmente como consecuencia de un desorden a nivel lisosomal, que provoca un defecto en el reciclaje y transferencia de este colesterol desde el MVB hacia otros compartimentos celulares como consecuencia de mutaciones en las proteínas NPC1 y NPC2 260 261 262. Este defecto en la dinámica de colesterol genera una reducción de este componente tanto a nivel del ER como de la PM provocando alteraciones relacionadas con la regulación del calcio lisosomal, el estrés oxidativo o el tráfico vesicular 260 261.     Pág ina 12 6  Este secuestro del colesterol en los MVBs en la enfermedad de NPC induce el reclutamiento tanto de anexina A6 263 264 como de Cav1, lo que provoca una reducción de los niveles de esta última en la PM 195. Estos cambios en la distribución de Cav1 podrían estar afectando a las vías de señalización dependientes de caveolas localizadas en la membrana plasmática. En este sentido, resulta interesante el estudio en el que se ha observado deficiencias en la señalización de insulina, vía dependiente de Cav1, en cerebros de animales deficientes en NPC 265,266. Nuestro trabajo muestra cómo las células carentes de Cav1 se caracterizan por presentar una acumulación del colesterol a nivel endosomal acompañado de un reclutamiento de anexinas, simulando el fenotipo observado en células NPC. Estos datos indicarían un posible papel de Cav1 como mecanismo protector en el desarrollo de esta enfermedad de Niemann-Pick y opuesto al papel desempeñado por la anexinas 196 238. Futuros estudios serán necesarios para entender cuál es la dinámica y la regulación bidireccional que existe entre Cav1 y anexinas a nivel endosomal como elementos moduladores del colesterol en este compartimento. Este aspecto sugiere la posibilidad de que cambios en el tráfico de Cav1 a MVBs en respuesta a estímulos específicos podrían ser usado para el desarrollo de dianas terapéuticas frente a esta enfermedad, así como una mejor comprensión de la sintomatología. Junto al enriquecimiento en anexinas, los estudios proteómicos también nos permitieron identificar una acumulación de histonas y otras proteínas relacionadas con la regulación del ADN y ARN en exosomas producidos por células carentes de Cav1. Estos datos resultan de gran interés dado que la distribución canónica de este tipo de proteínas y de moléculas es principalmente nuclear. Recientes estudios muestran la presencia de histonas en los cuerpos lipídicos, en los que su unión se produce a través de proteínas de anclaje situadas específicamente en su membrana 267 jugando un papel fundamental en la respuesta antibacteriana 268. Estos estudios, junto con los datos obtenidos en este trabajo, sugieren la existencia de funciones de histonas más allá de la compactación de cromatina, y una posible relación de éstas con la regulación de las membranas lipídicas celulares. Sin embargo, estos aspectos deben ser aún ampliamente investigados con el fin de entender el vínculo entre estos elementos. 5.2 Caveolina y la regulación de la entrada de proteínas de matriz extracelular en los exosomas Dentro del conjunto de proteínas específicamente incorporadas en los exosomas derivados de células Cav1WT, se identificó un subconjunto de proteínas correspondiente a proteínas de matriz extracelular (Figura R18). Dado el      Pág ina 12 7  desconocimiento que hasta el momento se tiene sobre los mecanismos implicados en la secreción de este tipo de proteínas al medio extracelular  81, estos resultados son especialmente relevantes, apuntando a los exosomas como un nuevo vehículo para el transporte de estas proteínas. El único caso de proteínas de matriz para el que se ha descrito su mecanismo de secreción es el de los colágenos. Los colágenos son transportados a través de la ruta exocítica dependiente del tráfico mediado por vesículas positivas para COPII 82, siguiendo la ruta secretora clásica a través del Golgi hasta la membrana plasmática. Entre las proteínas de ECM que encontramos en exosomas positivos para Cav1, los colágenos apenas se encuentran representados, a excepción del colágeno tipo VI apoyando los datos anteriores que excluyen los exosomas como mecanismo para su transporte y secreción. De hecho, diferentes estudios han mostrado una correlación negativa entre la expresión de Cav1 y la deposición de colágenos durante los procesos fibróticos 229,269 270, confirmando que en el caso de los colágenos, los exosomas no serían los responsables de su secreción. Sin embargo, otras muchas proteínas fundamentales para la estructura de la ECM como FN, TnC, nidógeno o emilina sí que se encuentran significativamente enriquecidas en exosomas derivados de células Cav1WT, corroborando la selectividad de los exosomas como vehículo de secreción de ciertos componentes de esta familia de proteínas de matriz. La confirmación de la implicación de los exosomas como mecanismo regulador en la formación de ECM se llevó a cabo utilizando diferentes estrategias, basadas tanto en el tratamiento farmacológico como por el silenciamiento de los componentes específicos implicados en la biogénesis y secreción de exosomas. En todos los casos, la inhibición de la ruta de formación de exosomas provocó una reducción en la deposición de algunas de las proteínas de matriz más relevantes, entre las que destacan TnC y FN (Figura R26 y R27) asociada, en la mayor parte de los casos, con una acumulación de estos componentes a nivel intracelular (principalmente en ER). Es importante destacar, que esta acumulación no mostraba un mismo patrón en todas las condiciones estudiadas (en unos casos la acumulación era más evidente que en otros), postulando que estas diferencias pueden ser debidas a una distinta tasa en la capacidad de degradación de estos acúmulos intracelulares. Apoyando esta hipótesis, nuestros datos confirman que la adición de cloroquina, un bloqueante de la actividad lisosomal, dio lugar a un incremento en la presencia de estos acúmulos intracelulares de componentes de matriz (Figura R34b y c).    Pág ina 12 8  Tal y como se indicó en la introducción, dentro de los mecanismos de biogénesis se han identificado mecanismos dependientes e independientes de la maquinaria ESCRT. Nuestros datos muestran cómo tanto la vía dependiente de ESCRT como la vía mediada por ceramida influyen en la deposición de TnC y FN, aunque es esta última la que impacta de forma más drástica en su deposición. Tras la inhibición de la actividad de las SMasas neutrales (nSMasas), la incapacidad de secreción de TnC y FN a través de los exosomas provoca su acumulación intracelular, mostrando un fenotipo similar al de las células carentes de Cav1 (Figura R28 y R31). La esfingomielinasas se caracterizan por catalizar la conversión de esfingomielina a ceramida y fosforilcolina 120. Por tanto, su inhibición provoca una reducción de los niveles de ceramida en las membranas celulares, incluida la membrana de los MVBs. Esta disminución, tal y como se ha descrito, conlleva una reducción en la formación de ILVs, aunque el mecanismo por el cual ocurre aún no se ha determinado 121. Curiosamente además, diferentes estudios han descrito la capacidad de ceramida para actuar como mecanismo de regulación del colesterol de los DRMs permitiendo el desplazamiento de este componente fuera de estos microdominios 271. Estos resultados sugieren que la inhibición de las esfingomielinasas provocaría un descenso en los niveles de ceramida a nivel de los MVB resultando en una elevación del colesterol en los microdominios presentes en este compartimento, dando lugar a un fenotipo similar al mostrado por las células sin Cav1, o a las situaciones en las que se fuerza una acumulación de colesterol en los MVBs (mediante tratamiento con U18666A). Esto explicaría la incapacidad de incorporar TnC o FN a los exosomas en células tratadas con GW4869 resultando en una reducción en la deposición de estos componentes a nivel extracelular vía exosomas, concomitante con su acumulación a nivel intracelular tal y como sucede en células que no expresan Cav1. Para poder entender en más detalle el mecanismo molecular a través del cual se produce la incorporación de TnC a los exosomas, se realizaron diferentes abordajes bioquímicos que nos permitieron descartar tanto la vía endocítica como la unión inespecífica (unión de TnC a los exosomas con posterioridad a su secreción) como vías de entrada de este componente de matriz. Nuestros datos apuntan a una incorporación de TnC a nivel intracelular desde el retículo, donde se sintetiza 272 hasta los MVBs. Cómo se produce esta transferencia entre ambos compartimentos, es algo que aún no se conoce y que, por tanto, abre un nuevo campo de investigación. Sin embargo, recientes estudios señalan la naturaleza dinámica del ER como un compartimento capaz de establecer contactos de membrana con multitud de orgánulos intracelulares, entre los que se incluyen los endosomas tardíos/MVBs 214 273,274. Estas uniones se ha      Pág ina 12 9  visto que participan en la maduración de los endosomas, así como en su posicionamiento celular, en la selección de cargos o en la transferencia bidireccional de colesterol entre ambos compartimentos 273 275, pudiendo por tanto servir como vía para la incorporación de TnC a los exosomas. El contacto entre RE-MVBs se ha descrito que depende de la interacción entre diferentes proteínas, especialmente miembros de la familia ORP (ORP1L y ORP5) 276. Nuestro grupo ha demostrado recientemente la importancia de Cav1 como un elemento modulador en el establecimiento de los contactos que se producen entre el ER y las mitocondrias 214, sugiriendo la posibilidad de que Cav1 pueda estar también implicada en el establecimiento de los contactos ER-MVBs a través de su capacidad de modular el colesterol entre estos compartimentos, y por tanto participando activamente en la regulación de la transferencia de TnC entre ellos. Por otro lado, recientes estudios muestran cómo durante la biogénesis de lisosomas, se produce la incorporación de proteínas a este compartimento directamente tras su síntesis de novo a través de un sistema vesicular que se origina desde el ER en ruta hacia los lisosomas 277 278. En nuestro caso, no podemos descartar que un mecanismo de naturaleza vesicular similar pueda estar también operando en el tráfico de TnC a los MVBs originándose desde el ER o desde el Golgi hasta los MVBs. Nuevos estudios enfocados a bloquear el tráfico desde el ER o el Golgi, o dirigidos a alterar los contactos ER-MVBs mediante silenciamiento de componentes implicados en estos contactos, nos permitirán tener una visión clara sobre cuál es la ruta concreta a través de la cual TnC se específicamente incorporada a los exosomas. 5.3 Los exosomas como vehículos para depositar y generar una matriz rica en TnC. Implicaciones funcionales La formación de la matriz extracelular es un proceso complejo que requiere no sólo de la deposición de proteínas de matriz sino de su adecuado ensamblaje y organización en estructuras fibrilares, permitiendo la generación de un soporte estructural. Experimentos realizados in vitro han demostrado que en el caso de la fibronectina inicialmente se produce su deposición formando núcleos/puntos de ensamblaje a partir de los cuales tiene lugar su polimerización en estructuras de mayor tamaño molecular 279. En el remodelado posterior sin embargo es necesaria la fuerza de tracción que ejercen las células para la formación de fibras a través de las uniones focales provocando cambios en la arquitectura final de la matriz 62.    Pág ina 13 0  En nuestro trabajo, hemos podido demostrar que los exosomas producidos por los MEFs Cav1WT, y que se encuentran enriquecidos en TnC, son capaces de generar depósitos de TnC tanto en ensayos 2D como en ensayos 3D (esferoides). Sin embargo, sólo en esta última condición, la TnC depositada es capaz de reorganizarse en fibras de mayor longitud visibles en el interior del esferoide con consecuencia de las fuerzas que se ejercen por parte de las células en condiciones 3D (Figura R37). La similitud en la respuesta celular mediada por los exosomas producidos por fibroblastos que carecen de la expresión de TnC y aquellos que carecen de la expresión de Cav1 (Figura R38) en comparación con el efecto producido por los exosomas producidos por fibroblastos Cav1WT sugieren un papel principal de la presencia de TnC en éstos últimos. De hecho, nuestros resultados muestran cómo los exosomas derivados de células Cav1WT, ricos en TnC, producen un doble efecto sobre las células tumorales. Por un lado, la deposición de TnC mediada por estos exosomas en áreas de la periferia celular promueve cambios en su morfología similares a un proceso de transición epitelio mesénquima, resultando en un incremento de su capacidad migratoria y de su capacidad invasiva (en ensayos 2D y 3D). Estos resultados son similares a los descritos en otros trabajos en los que la adición de TnC recombinante al medio de cultivo de las células provoca cambios morfológicos de una naturaleza similar a la inducida por los exosomas ricos en TnC 280, reforzando la importancia de TnC a nivel exosomal. Por otro lado, además de este efecto local, nuestros datos in vivo muestran cómo los exosomas son capaces de ser transportados a través del torrente sanguíneo hasta alcanzar diferentes órganos, observándose una mayor acumulación de estas nanovesículas tanto en el hígado como en el pulmón, tejidos en los que aparecen nuevos núcleos ricos en TnC (Figura R39 y R40) Estos datos son especialmente relevantes, porque señalan la posibilidad de que los exosomas puedan actuar como un nuevo mecanismo en la generación de cambios en la composición de matriz en tejidos distantes. Numerosos estudios demuestran que el microambiente necesario para la formación de los futuros sitios de metástasis, conocidos como nichos premetastáticos, se generan incluso antes de la llegada y colonización de las células tumorales, como consecuencia de cambios en la composición y organización de la matriz extracelular de los tejidos diana 76  78,155. Aunque aún no se conocen con exactitud los mecanismos subyacentes a este proceso, trabajos recientes muestran cómo las células tumorales podrían influir en la formación de estos nichos premetastáticos mediante la activación secuencial y a distancia de diferentes tipos celulares a través de exosomas que las      Pág ina 13 1  propias células tumorales secretan, provocando en último término un incremento en su capacidad de metastatizar 158. Nuestros datos, apuntan a que es posible que no sólo los exosomas tumorales sino los producidos por el propio estroma tumoral (fibroblastos) sean capaces de modular la formación de estos nichos, mediante el envío selectivo de proteínas de matriz extracelular a través de exosomas hasta los órganos diana donde posteriormente se producirá la metástasis. Nuevos estudios serán necesarios para evaluar el impacto que estos depósitos de TnC mediado por los exosomas producen sobre la capacidad de reclutamiento de las células tumorales a órganos específicos para generar metástasis. El papel de Cav1 durante la progresión tumoral es muy complejo. A nivel de las células tumorales, se ha visto que los niveles de expresión de Cav1 fluctúan dependiendo de la fase en la que se encuentra en tumor. En etapas iniciales, la expresión de Cav1 en los tumores se reduce considerablemente, produciéndose un incremento de su expresión en aquellos tumores más agresivos y con una mayor capacidad de producir metástasis 281. En el desarrollo de la progresión tumoral, las investigaciones que se han realizado se han centrado principalmente en la compresión de la biología de las células tumorales. Sin embargo, en la actualidad, cada vez existen más evidencias de que el ambiente que rodea los tumores juega un papel crucial en la progresión tumoral, e incluso en la propia transformación de las células de tejidos sanos 9 54 64 66. Este aspecto aumenta considerablemente la complejidad del papel de Cav1 en el desarrollo tumoral. Por un lado, la ausencia de expresión de Cav1 en TAFs se ha visto que influye directamente en la desregulación metabólica del tumor favoreciendo el proceso tumoral 225,228, mientras que otros grupos incluidos el nuestro hemos observado que un aumento de Cav1 en estos fibroblastos promueven el remodelado de la matriz favoreciendo su capacidad de generar metástasis 70 282. El trabajo mostrado en esta tesis, nos permite extender el conocimiento sobre la implicación de Cav1 en cáncer, postulando que cambios en los niveles de Cav1 en los TAFs a lo largo de la progresión tumoral podrían servir como mecanismo de regulación del tipo de proteínas de matriz específicamente secretadas por estas células. Múltiples trabajos muestran cómo la pérdida de expresión de Cav1 en los fibroblastos se correlaciona con un aumento en su capacidad para depositar colágeno, siguiendo la vía exocítica ER-Golgi 82 229 y dando lugar a un proceso fibrótico 283. Por tanto, es posible que, en etapas iniciales de la progresión tumoral, los TAFs muestren bajos niveles de Cav1 promoviendo un enriquecimiento en colágeno del estroma    Pág ina 13 2  tumoral. El endurecimiento y rigidez que esta proteína de matriz confiere, serviría como mecanismo de encapsulamiento del tumor. Sin embargo, una secreción sostenida de colágeno a lo largo del tiempo provocaría una rigidez extrema del estroma tumoral provocando una inducción de la expresión de Cav1 en los TAFs 55 60. En esta segunda etapa, la elevación de la expresión de Cav1 provocaría que estos fibroblastos redujesen la secreción de colágeno, activándose las rutas de secreción de otras proteínas de matriz tales como TnC o FN a través de exosomas. Estas dos proteínas (TnC y FN) se encuentran estrechamente relacionadas con la migración celular y la adquisición de marcadores mesenquimales 69,242,280 en las células epiteliales, por lo que un aumento en su deposición provocaría la ruptura de ese encapsulamiento tumoral promoviendo su capacidad invasiva. Nuevos estudios serán necesarios para confirmar esta hipótesis, y para entender cómo es realmente la dinámica de regulación de Cav1 en el estroma tumoral a lo largo del tiempo, abriendo la posibilidad de identificar nuevos mecanismos para la actuación contra la progresión tumoral. Por otro lado, se ha visto que alteraciones en la matriz extracelular se encuentran asociadas al desarrollo de diferentes enfermedades que cursan con fibrosis 5  10 y en las que Cav1 también podría estar jugando un papel fundamental 229. Aunque la deposición de ECM es un proceso que se encuentra exacerbado en numerosas patologías, constituye al mismo tiempo un mecanismo esencial para el mantenimiento de múltiples procesos fisiológicos, entre los que se incluye la mineralización ósea 284. Diferentes estudios muestran cómo la nucleación de ECM en los huesos sirve de soporte para su posterior calcificación. Trabajos recientes muestran cómo los exosomas están implicados en la regulación de este proceso y que ratones deficientes en las esfingomielinasas neutrales 1 y 2 presentan una displasia severa a nivel del tejido óseo 285 286. Nuevos estudios empleando estos modelos animales de ratón serán necesarios para entender la importancia relativa de los exosomas en la composición y deposición de la matriz extracelular en los diferentes órganos. Además del papel de los exosomas en cáncer, se ha visto que la secreción de estas nanovesículas también se encuentra alterada en diferentes enfermedades metabólicas, con especial atención en el caso de la aterosclerosis, donde los exosomas se ha visto que están implicados en el metabolismo de colesterol de los monocitos y macrófagos, la activación de las células endoteliales y las plaquetas y en la proliferación del músculo liso 148 287. Además, también se ha apreciado que la secreción de exosomas puede mejorar los niveles de colesterol en células NPC 288. Por otro lado, se ha observado que Cav1 es un componente esencial para la transcitosis de LDL a través del endotelio 289 290 291. Curiosamente, la ausencia de Cav1 produce hipercolesterolemia,      Pág ina 13 3  pero al mismo tiempo protege contra el desarrollo de las placas de ateroma. Nuevos estudios serán necesarios para confirmar si la modulación de la biogénesis de exosomas a través de Cav1 podría proporcionar una forma alternativa de regular los niveles de colesterol, así como la carga específica de moléculas pro-aterogénicas. Por último, en el plasma de pacientes con melanoma se han detectado exosomas que expresan elevados niveles de Cav1 230. Nosotros proponemos que el análisis de la expresión de Cav1 en los exosomas podrían ser un valioso marcador de prognosis de la capacidad de metástasis y malignidad tumoral, así como de otras enfermedades relacionadas con alteraciones del colesterol. Los resultados obtenidos en la presente tesis, abren nuevas vías para el diagnóstico, prevención e incluso para la intervención terapéutica basada en el papel de Cav1 en la regulación de la comunicación estroma-tumor a través de exosomas. Figura D1. Modelo general. Modelo propuesto del papel de Cav1 en la deposición de ECM a través de exosomas. (I) La Cav1 endocitada entra en los MVBs, donde promueven la heterogeneidad en tamaño y composición de los exosomas, favoreciendo la entrada de componentes de ECM. (II) Los exosomas derivados de fibroblastos Cav1WT estimulan la formación de protrusiones y la actividad motil de células derivadas de cáncer de mama mediante la nucleación de ECM (TnC) local, rodeando las células tumorales. (III) Los exosomas derivados de fibroblastos Cav1WT pueden también generar depósitos ricos en ECM a largas distancias de donde se secretan a través del torrente sanguíneo, permitiendo la formación de posibles nichos pre-metastáticos.    Pág ina 13 4         Pág ina 13 5  6. CONCLUSIONES   CONCLUSIONES    Pág ina 13 6       Pág ina 13 7  - Cav1 se encuentra presente en los exosomas derivados de la gran mayoría de tipos celulares que la expresan. - La entrada de Cav1 en los exosomas es dependiente de su endocitosis y consiste en un proceso divido en dos etapas consecutivas en las que Cav1 es primero fosforilada y posteriormente ubiquitinada. - Cav1 es capaz de regular los niveles de colesterol en los cuerpos multivesiculares, influyendo directamente en la biogénesis de exosomas - La selección e incorporación de proteínas de matriz extracelular como cargos específicos en exosomas es dependiente de la presencia de Cav1. - Los exosomas actúan como elemento clave en la deposición y la formación de matriz de TnC y FN. - La incorporación de TnC a los exosomas se produce a través de su síntesis de novo. - La TnC localizada en exosomas promueve un fenotipo similar a una transición epitelio-mesénquima en células tumorales, induciendo un incremento en su motilidad y capacidad invasiva. - Los exosomas que circulan a través del torrente sanguíneo son capaces de generar nuevos puntos de nucleación de matriz extracelular en órganos distantes.    Pág ina 13 8         Pág ina 13 9  7. 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MATERIAL SUPLEMENTARIO                                                         MATERIAL SUPLEMENTARIO    P á g i n a 1 5 8   Tabla S1. Análisis proteómico de lisados celulares y exosomas derivados de MEFs Cav1WT y Cav1KO. Se muestran proteínas que presentan niveles similares entre lisados celulares (-1,5 ≤ Zq ≤ 1,5) y enriquecidas en exosomas derivados de MEFs Cav1WT (Zq ≥ 1,5). Proteínas enriquecidas en muestras Cav1WT Proteínas enriquecidas en muestras Cav1KO fasta proteína Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas Q9WV54 ASAH1_MOUSE ASAH1_MOUSE Acid ceramidase OS=Mus musculus GN=Asah1 PE=1 SV=1 0.78392745 4.336153 Q9R118 HTRA1_MOUSE HTRA1_MOUSE Serine protease HTRA1 OS=Mus musculus GN=Htra1 PE=1 SV=2 0.33184315 4.328745 P46718 PDCD2_MOUSE PDCD2_MOUSE Programmed cell death protein 2 OS=Mus musculus GN=Pdcd2 PE=2 SV=2 0.90756925 4.3019925 Q8R4X3 RBM12_MOUSE RBM12_MOUSE RNA-binding protein 12 OS=Mus musculus GN=Rbm12 PE=1 SV=3 0.114948248 4.2897575 Q9ESJ1 CABL1_MOUSE CABL1_MOUSE CDK5 and ABL1 enzyme substrate 1 OS=Mus musculus GN=Cables1 PE=1 SV=2 -0.81621195 3.9317435 Q9WTJ8 FA50B_MOUSE FA50B_MOUSE Protein FAM50B OS=Mus musculus GN=Fam50b PE=2 SV=1 0.13549215 3.903764 B2RWG1 B2RWG1_MOUSE B2RWG1_MOUSE 1700101E01Rik protein OS=Mus musculus GN=1700101E01Rik PE=2 SV=1 -0.125391739 3.879301 Q8K482 EMIL2_MOUSE EMIL2_MOUSE EMILIN-2 OS=Mus musculus GN=Emilin2 PE=1 SV=1 0.0423805 3.6890135 C0IQA4 C0IQA4_MOUSE C0IQA4_MOUSE MCG64379 OS=Mus musculus GN=Spanxn4 PE=2 SV=1 -0.71804545 3.331964 Q6XBG2 Q6XBG2_MOUSE Q6XBG2_MOUSE ATP-binding cassette transporter sub-family A member 15 OS=Mus musculus GN=Abca15 PE=2 SV=1 0.41893005 3.2316165 Q60932 VDAC1_MOUSE VDAC1_MOUSE Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 OS=Mus musculus GN=Vdac1 PE=1 SV=3 -0.084288975 3.074369 Q9R1R2 TRIM3_MOUSE TRIM3_MOUSE Tripartite motif-containing protein 3 OS=Mus musculus GN=Trim3 PE=1 SV=1 0.2934282 3.068363 Q9R159 ADA25_MOUSE ADA25_MOUSE Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 25 OS=Mus musculus GN=Adam25 PE=2 SV=1 -0.6659502 3.048651 Q64337 SQSTM_MOUSE SQSTM_MOUSE Sequestosome-1 OS=Mus musculus GN=Sqstm1 PE=1 SV=1 -0.179680485 3.027232 Q80YX1 TENA_MOUSE TENA_MOUSE Tenascin OS=Mus musculus GN=Tnc PE=1 SV=1 -0.98165065 3.0236015 P97449 AMPN_MOUSE AMPN_MOUSE Aminopeptidase N OS=Mus musculus GN=Anpep PE=1 SV=4 0.9788574 3.0217055 Q810A7 DDX42_MOUSE DDX42_MOUSE ATP-dependent RNA helicase DDX42 OS=Mus musculus GN=Ddx42 PE=1 SV=3 -0.434245703 3.011201 P52785 GUC2E_MOUSE GUC2E_MOUSE Guanylyl cyclase GC-E OS=Mus musculus GN=Gucy2e PE=2 SV=2 0.905745 2.9570065 Q9ER00 STX12_MOUSE STX12_MOUSE Syntaxin-12 OS=Mus musculus GN=Stx12 PE=1 SV=1 0.447242263 2.938017 Q8BL99 DOP1_MOUSE DOP1_MOUSE Protein dopey-1 OS=Mus musculus GN=Dopey1 PE=1 SV=2 0.39597874 2.905634 Q9DCZ4 APOO_MOUSE APOO_MOUSE Apolipoprotein O OS=Mus musculus GN=Apoo PE=2 SV=1 -1.007922175 2.86806725 O35188 X3CL1_MOUSE X3CL1_MOUSE Fractalkine OS=Mus musculus GN=Cx3cl1 PE=2 SV=3 0.09547645 2.8670793 Q9ESN2 TRI39_MOUSE TRI39_MOUSE E3 ubiquitin-protein ligase TRIM39 OS=Mus musculus GN=Trim39 PE=2 SV=1 -0.15674985 2.8543595 Q61009 SCRB1_MOUSE SCRB1_MOUSE Scavenger receptor class B member 1 OS=Mus musculus GN=Scarb1 PE=1 SV=1 1.185963525 2.8415575 Q8CHK3 MBOA7_MOUSE MBOA7_MOUSE Lysophospholipid acyltransferase 7 OS=Mus musculus GN=Mboat7 PE=2 SV=1 1.1417149 2.815465 Q3UQ28 PXDN_MOUSE PXDN_MOUSE Peroxidasin homolog OS=Mus musculus GN=Pxdn PE=2 SV=2 0.540062 2.76277 P18242 CATD_MOUSE CATD_MOUSE Cathepsin D OS=Mus musculus GN=Ctsd PE=1 SV=1 0.773206825 2.7282835 E9PWQ3 E9PWQ3_MOUSE E9PWQ3_MOUSE Protein Col6a3 OS=Mus musculus GN=Col6a3 PE=4 SV=2 -0.1807033 2.7264675 Q9DCD6 GBRAP_MOUSE GBRAP_MOUSE Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein OS=Mus musculus GN=Gabarap PE=1 SV=2 1.209291 2.674758 Q3TMP1 Q3TMP1_MOUSE Q3TMP1_MOUSE General transcription factor IIIC, polypeptide 3 OS=Mus musculus GN=Gtf3c3 PE=2 SV=1 -0.46729295 2.601646 Q01320 TOP2A_MOUSE TOP2A_MOUSE DNA topoisomerase 2-alpha OS=Mus musculus GN=Top2a PE=1 SV=2 0.037450628 2.5989933 Q9ERU9 RBP2_MOUSE RBP2_MOUSE E3 SUMO-protein ligase RanBP2 OS=Mus musculus GN=Ranbp2 PE=1 SV=2 0.27990246 2.596589 Q8K297 GT251_MOUSE GT251_MOUSE Procollagen galactosyltransferase 1 OS=Mus musculus GN=Glt25d1 PE=1 SV=2 1.465486225 2.5892185 Q04857 CO6A1_MOUSE CO6A1_MOUSE Collagen alpha-1(VI) chain OS=Mus musculus GN=Col6a1 PE=2 SV=1 1.449959575 2.5845805 O88322 NID2_MOUSE NID2_MOUSE Nidogen-2 OS=Mus musculus GN=Nid2 PE=1 SV=2 -1.1068702 2.5778585      P á g i n a 1 5 9   fasta proteína Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas Q9ET22 DPP2_MOUSE DPP2_MOUSE Dipeptidyl peptidase 2 OS=Mus musculus GN=Dpp7 PE=2 SV=2 0.2904772 2.5555365 Q3UKC1 TAXB1_MOUSE TAXB1_MOUSE Tax1-binding protein 1 homolog OS=Mus musculus GN=Tax1bp1 PE=1 SV=2 0.07988715 2.548679 Q3U1N2 SRBP2_MOUSE SRBP2_MOUSE Sterol regulatory element-binding protein 2 OS=Mus musculus GN=Srebf2 PE=1 SV=2 -1.42626695 2.5442075 Q5SS00 ZDBF2_MOUSE ZDBF2_MOUSE DBF4-type zinc finger-containing protein 2 homolog OS=Mus musculus GN=Zdbf2 PE=2 SV=1 -0.46733685 2.526584 Q91W10 S39A8_MOUSE S39A8_MOUSE Zinc transporter ZIP8 OS=Mus musculus GN=Slc39a8 PE=2 SV=1 -0.76057773 2.523536 O88738 BIRC6_MOUSE BIRC6_MOUSE Baculoviral IAP repeat-containing protein 6 OS=Mus musculus GN=Birc6 PE=1 SV=2 0.115002505 2.5139935 P97313 PRKDC_MOUSE PRKDC_MOUSE DNA-dependent protein kinase catalytic subunit OS=Mus musculus GN=Prkdc PE=1 SV=3 1.0161486 2.5035225 P60521 GBRL2_MOUSE GBRL2_MOUSE Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 2 OS=Mus musculus GN=Gabarapl2 PE=1 SV=1 0.06845555 2.4852225 Q9JJX6 P2RX4_MOUSE P2RX4_MOUSE P2X purinoceptor 4 OS=Mus musculus GN=P2rx4 PE=1 SV=1 -0.36373225 2.484015 P55850 DSC3_MOUSE DSC3_MOUSE Desmocollin-3 OS=Mus musculus GN=Dsc3 PE=1 SV=2 0.085902618 2.46269195 B9EJ54 B9EJ54_MOUSE B9EJ54_MOUSE MCG21756, isoform CRA_b OS=Mus musculus GN=Nup205 PE=2 SV=1 -0.425688875 2.4445325 Q923Z0 GPC5B_MOUSE GPC5B_MOUSE G-protein coupled receptor family C group 5 member B OS=Mus musculus GN=Gprc5b PE=2 SV=1 -0.4581425 2.4212405 Q8CDG3 VCIP1_MOUSE VCIP1_MOUSE Deubiquitinating protein VCIP135 OS=Mus musculus GN=Vcpip1 PE=2 SV=1 -0.261339875 2.415296 A2AWA9 RBGP1_MOUSE RBGP1_MOUSE Rab GTPase-activating protein 1 OS=Mus musculus GN=Rabgap1 PE=2 SV=1 0.570538703 2.4007205 A2RTH5 A2RTH5_MOUSE A2RTH5_MOUSE Leucine carboxyl methyltransferase 1 OS=Mus musculus GN=Lcmt1 PE=2 SV=1 0.2172642 2.360012 Q8BIQ5 CSTF2_MOUSE CSTF2_MOUSE Cleavage stimulation factor subunit 2 OS=Mus musculus GN=Cstf2 PE=1 SV=2 -0.4521907 2.350102 Q8CG46 SMC5_MOUSE SMC5_MOUSE Structural maintenance of chromosomes protein 5 OS=Mus musculus GN=Smc5 PE=2 SV=1 0.0126489 2.3312955 Q8BKJ9 SIR7_MOUSE SIR7_MOUSE NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-7 OS=Mus musculus GN=Sirt7 PE=1 SV=2 -0.4998911 2.3035535 Q8K010 OPLA_MOUSE OPLA_MOUSE 5-oxoprolinase OS=Mus musculus GN=Oplah PE=2 SV=1 1.034229 2.2996924 Q9D082 Q9D082_MOUSE Q9D082_MOUSE Protein Zfp715 OS=Mus musculus GN=Zfp715 PE=2 SV=2 1.00270415 2.28918505 P11276 FINC_MOUSE FINC_MOUSE Fibronectin OS=Mus musculus GN=Fn1 PE=1 SV=4 0.1896813 2.271737 Q8BHL4 RAI3_MOUSE RAI3_MOUSE Retinoic acid-induced protein 3 OS=Mus musculus GN=Gprc5a PE=2 SV=1 1.16802375 2.266714 P24638 PPAL_MOUSE PPAL_MOUSE Lysosomal acid phosphatase OS=Mus musculus GN=Acp2 PE=2 SV=2 0.846061075 2.26446 Q8BJU2 TSN9_MOUSE TSN9_MOUSE Tetraspanin-9 OS=Mus musculus GN=Tspan9 PE=1 SV=1 -0.0154478 2.2523295 F7BEU1 F7BEU1_MOUSE F7BEU1_MOUSE Sorbin and SH3 domain-containing protein 2 (Fragment) OS=Mus musculus GN=Sorbs2 PE=4 SV=1 -0.75528655 2.2480974 E9Q9Q5 E9Q9Q5_MOUSE E9Q9Q5_MOUSE Protein 1700113H08Rik OS=Mus musculus GN=1700113H08Rik PE=4 SV=1 0.9350357 2.21912 Q6Y7W8 PERQ2_MOUSE PERQ2_MOUSE PERQ amino acid-rich with GYF domain-containing protein 2 OS=Mus musculus GN=Gigyf2 PE=1 SV=2 -0.284491373 2.2161159 P29391 FRIL1_MOUSE FRIL1_MOUSE Ferritin light chain 1 OS=Mus musculus GN=Ftl1 PE=1 SV=2 0.97054925 2.206739 Q8VC57 KCTD5_MOUSE KCTD5_MOUSE BTB/POZ domain-containing protein KCTD5 OS=Mus musculus GN=Kctd5 PE=2 SV=1 0.0861098 2.1945155 Q8R4B8 NALP3_MOUSE NALP3_MOUSE NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 OS=Mus musculus GN=Nlrp3 PE=2 SV=1 0.7662384 2.1897236 Q9CR84 AT5G1_MOUSE AT5G1_MOUSE ATP synthase lipid-binding protein, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Atp5g1 PE=2 SV=1 -0.86372805 2.1828295 Q9R117 TYK2_MOUSE TYK2_MOUSE Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2 OS=Mus musculus GN=Tyk2 PE=1 SV=2 -0.824255 2.1766775 P70297 STAM1_MOUSE STAM1_MOUSE Signal transducing adapter molecule 1 OS=Mus musculus GN=Stam PE=2 SV=3 0.909257925 2.171165 P32233 DRG1_MOUSE DRG1_MOUSE Developmentally-regulated GTP-binding protein 1 OS=Mus musculus GN=Drg1 PE=1 SV=1 1.040028375 2.1705615 Q8R2U6 NUDT4_MOUSE NUDT4_MOUSE Diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase 2 OS=Mus musculus GN=Nudt4 PE=1 SV=1 -0.404222775 2.1683798 P09528 FRIH_MOUSE FRIH_MOUSE Ferritin heavy chain OS=Mus musculus GN=Fth1 PE=1 SV=2 0.26264675 2.142144 P51910 APOD_MOUSE APOD_MOUSE Apolipoprotein D OS=Mus musculus GN=Apod PE=2 SV=1 0.11741715 2.1237195 F7BE84 F7BE84_MOUSE F7BE84_MOUSE Protein Ankrd50 (Fragment) OS=Mus musculus GN=Ankrd50 PE=4 SV=1 -1.086270275 2.107991 Q91XB7 YIF1A_MOUSE YIF1A_MOUSE Protein YIF1A OS=Mus musculus GN=Yif1a PE=2 SV=1 -0.96543655 2.098649 B1B0C7 B1B0C7_MOUSE B1B0C7_MOUSE Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein OS=Mus musculus GN=Hspg2 PE=4 SV=1 0.40560075 2.0968645 Q05793 PGBM_MOUSE PGBM_MOUSE Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein OS=Mus musculus GN=Hspg2 PE=1 SV=1 -0.093233675 2.08989    P á g i n a 1 6 0   fasta proteína Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas Q8CGU1 CACO1_MOUSE CACO1_MOUSE Calcium-binding and coiled-coil domain-containing protein 1 OS=Mus musculus GN=Calcoco1 PE=1 SV=2 -0.0673214 2.071684 P41731 CD63_MOUSE CD63_MOUSE CD63 antigen OS=Mus musculus GN=Cd63 PE=1 SV=2 -0.6401162 2.0652935 A2ANY6 A2ANY6_MOUSE A2ANY6_MOUSE Midasin OS=Mus musculus GN=Mdn1 PE=3 SV=1 0.470651875 2.058062 P03995 GFAP_MOUSE GFAP_MOUSE Glial fibrillary acidic protein OS=Mus musculus GN=Gfap PE=1 SV=4 1.366023575 2.0507295 Q8VHE6 DYH5_MOUSE DYH5_MOUSE Dynein heavy chain 5, axonemal OS=Mus musculus GN=Dnah5 PE=1 SV=2 -0.239992575 2.035527 O08983 HPS1_MOUSE HPS1_MOUSE Hermansky-Pudlak syndrome 1 protein homolog OS=Mus musculus GN=Hps1 PE=2 SV=2 -0.5669905 2.0310925 P23780 BGAL_MOUSE BGAL_MOUSE Beta-galactosidase OS=Mus musculus GN=Glb1 PE=2 SV=1 1.3736035 2.0117755 Q99LI8 HGS_MOUSE HGS_MOUSE Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate OS=Mus musculus GN=Hgs PE=1 SV=2 0.970713625 2.009634 Q91VN6 DDX41_MOUSE DDX41_MOUSE Probable ATP-dependent RNA helicase DDX41 OS=Mus musculus GN=Ddx41 PE=1 SV=2 -0.02863132 2.00456295 Q3ULB0 Q3ULB0_MOUSE Q3ULB0_MOUSE Protein Rbm6 OS=Mus musculus GN=Rbm6 PE=2 SV=1 0.2640209 1.996537 Q62210 BIRC2_MOUSE BIRC2_MOUSE Baculoviral IAP repeat-containing protein 2 OS=Mus musculus GN=Birc2 PE=1 SV=1 -1.397086 1.9903882 Q6P2K6 P4R3A_MOUSE P4R3A_MOUSE Serine/threonine-protein phosphatase 4 regulatory subunit 3A OS=Mus musculus GN=Smek1 PE=1 SV=1 0.26841807 1.9755245 Q9CWR1 WDR73_MOUSE WDR73_MOUSE WD repeat-containing protein 73 OS=Mus musculus GN=Wdr73 PE=2 SV=1 0.191813188 1.95389 O08992 SDCB1_MOUSE SDCB1_MOUSE Syntenin-1 OS=Mus musculus GN=Sdcbp PE=2 SV=1 0.574791575 1.946372 A2AN33 A2AN33_MOUSE A2AN33_MOUSE Novel protein (5830434P21Rik) (Fragment) OS=Mus musculus GN=Prrc2b PE=4 SV=1 0.80901875 1.94125 P97927 LAMA4_MOUSE LAMA4_MOUSE Laminin subunit alpha-4 OS=Mus musculus GN=Lama4 PE=1 SV=2 0.020546815 1.920444 P60469 LIPA3_MOUSE LIPA3_MOUSE Liprin-alpha-3 OS=Mus musculus GN=Ppfia3 PE=1 SV=1 0.52541115 1.90227825 Q80U87 UBP8_MOUSE UBP8_MOUSE Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 8 OS=Mus musculus GN=Usp8 PE=1 SV=2 -0.99877395 1.8993925 P70699 LYAG_MOUSE LYAG_MOUSE Lysosomal alpha-glucosidase OS=Mus musculus GN=Gaa PE=1 SV=2 0.399695325 1.8963755 Q8C052 MAP1S_MOUSE MAP1S_MOUSE Microtubule-associated protein 1S OS=Mus musculus GN=Map1s PE=1 SV=2 0.997152975 1.891214 Q8R143 PTTG_MOUSE PTTG_MOUSE Pituitary tumor-transforming gene 1 protein-interacting protein OS=Mus musculus GN=Pttg1ip PE=1 SV=1 0.10862892 1.8887255 P17439 GLCM_MOUSE GLCM_MOUSE Glucosylceramidase OS=Mus musculus GN=Gba PE=1 SV=1 0.52844506 1.8695675 P25085 IL1RA_MOUSE IL1RA_MOUSE Interleukin-1 receptor antagonist protein OS=Mus musculus GN=Il1rn PE=2 SV=1 0.119502303 1.865456 D3Z6E8 D3Z6E8_MOUSE D3Z6E8_MOUSE Deleted in lung and esophageal cancer protein 1 homolog OS=Mus musculus GN=Dlec1 PE=4 SV=1 -1.43041295 1.8502895 Q9QVP9 FAK2_MOUSE FAK2_MOUSE Protein-tyrosine kinase 2-beta OS=Mus musculus GN=Ptk2b PE=1 SV=2 0.84712695 1.8424734 Q5H8C4 VP13A_MOUSE VP13A_MOUSE Vacuolar protein sorting-associated protein 13A OS=Mus musculus GN=Vps13a PE=1 SV=1 -0.5867027 1.836893 Q9DCM0 ETHE1_MOUSE ETHE1_MOUSE Protein ETHE1, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Ethe1 PE=1 SV=2 0.14963035 1.8148855 Q8K1G9 Q8K1G9_MOUSE Q8K1G9_MOUSE DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 35 OS=Mus musculus GN=Dhx35 PE=2 SV=1 -0.4495439 1.8041685 O08999 LTBP2_MOUSE LTBP2_MOUSE Latent-transforming growth factor beta-binding protein 2 OS=Mus musculus GN=Ltbp2 PE=1 SV=2 -1.381954 1.8009296 Q9JHZ2 ANKH_MOUSE ANKH_MOUSE Progressive ankylosis protein OS=Mus musculus GN=Ankh PE=2 SV=1 1.2508773 1.7891245 Q8CDI7 CC150_MOUSE CC150_MOUSE Coiled-coil domain-containing protein 150 OS=Mus musculus GN=Ccdc150 PE=2 SV=2 -1.107584 1.78608615 E9Q9B7 E9Q9B7_MOUSE E9Q9B7_MOUSE Protein Kidins220 OS=Mus musculus GN=Kidins220 PE=4 SV=1 -0.48420846 1.7768329 Q9WU78 PDC6I_MOUSE PDC6I_MOUSE Programmed cell death 6-interacting protein OS=Mus musculus GN=Pdcd6ip PE=1 SV=3 0.732154025 1.7659175 O35316 SC6A6_MOUSE SC6A6_MOUSE Sodium- and chloride-dependent taurine transporter OS=Mus musculus GN=Slc6a6 PE=1 SV=2 0.6854966 1.7488495 P63038 CH60_MOUSE CH60_MOUSE 60 kDa heat shock protein, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Hspd1 PE=1 SV=1 -1.18113905 1.7473635 Q9WUU7 CATZ_MOUSE CATZ_MOUSE Cathepsin Z OS=Mus musculus GN=Ctsz PE=2 SV=1 -0.986859688 1.747167 Q9CR89 ERGI2_MOUSE ERGI2_MOUSE Endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 2 OS=Mus musculus GN=Ergic2 PE=2 SV=1 0.634107985 1.7400865 P97864 CASP7_MOUSE CASP7_MOUSE Caspase-7 OS=Mus musculus GN=Casp7 PE=1 SV=2 -1.466913 1.7390065 P16675 PPGB_MOUSE PPGB_MOUSE Lysosomal protective protein OS=Mus musculus GN=Ctsa PE=1 SV=1 -0.355063865 1.7368905 Q00623 APOA1_MOUSE APOA1_MOUSE Apolipoprotein A-I OS=Mus musculus GN=Apoa1 PE=1 SV=2 0.1591697 1.7347475 P12265 BGLR_MOUSE BGLR_MOUSE Beta-glucuronidase OS=Mus musculus GN=Gusb PE=2 SV=2 0.104365108 1.726214      P á g i n a 1 6 1   fasta proteína Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas Q9D7P9 SPB12_MOUSE SPB12_MOUSE Serpin B12 OS=Mus musculus GN=Serpinb12 PE=2 SV=1 -1.2247078 1.72473115 P48381 RFX3_MOUSE RFX3_MOUSE Transcription factor RFX3 OS=Mus musculus GN=Rfx3 PE=1 SV=2 -1.376425275 1.719215 O35988 SDC4_MOUSE SDC4_MOUSE Syndecan-4 OS=Mus musculus GN=Sdc4 PE=1 SV=1 -0.1060065 1.713113 O09159 MA2B1_MOUSE MA2B1_MOUSE Lysosomal alpha-mannosidase OS=Mus musculus GN=Man2b1 PE=2 SV=4 0.0172945 1.710113 Q02788 CO6A2_MOUSE CO6A2_MOUSE Collagen alpha-2(VI) chain OS=Mus musculus GN=Col6a2 PE=2 SV=3 1.08820545 1.697079 P28574 MAX_MOUSE MAX_MOUSE Protein max OS=Mus musculus GN=Max PE=1 SV=1 0.635077293 1.6964885 Q7TS99 HELT_MOUSE HELT_MOUSE Hairy and enhancer of split-related protein HELT OS=Mus musculus GN=Helt PE=1 SV=1 1.34337525 1.6856635 E9Q394 E9Q394_MOUSE E9Q394_MOUSE Protein Akap13 OS=Mus musculus GN=Akap13 PE=4 SV=1 -1.30285005 1.6745905 Q99JH8 ERD21_MOUSE ERD21_MOUSE ER lumen protein retaining receptor 1 OS=Mus musculus GN=Kdelr1 PE=2 SV=1 0.09843285 1.6731315 E9Q5M6 E9Q5M6_MOUSE E9Q5M6_MOUSE Protein Wdr52 OS=Mus musculus GN=Wdr52 PE=4 SV=1 0.033608475 1.667401 P63082 VATL_MOUSE VATL_MOUSE V-type proton ATPase 16 kDa proteolipid subunit OS=Mus musculus GN=Atp6v0c PE=2 SV=1 0.487737343 1.6601835 Q3UHF7 ZEP2_MOUSE ZEP2_MOUSE Transcription factor HIVEP2 OS=Mus musculus GN=Hivep2 PE=1 SV=1 0.625228 1.64478355 Q3UH68 LIMC1_MOUSE LIMC1_MOUSE LIM and calponin homology domains-containing protein 1 OS=Mus musculus GN=Limch1 PE=1 SV=2 -0.841204689 1.6310477 Q9QWR8 NAGAB_MOUSE NAGAB_MOUSE Alpha-N-acetylgalactosaminidase OS=Mus musculus GN=Naga PE=2 SV=2 -1.28979805 1.6237445 P21956 MFGM_MOUSE MFGM_MOUSE Lactadherin OS=Mus musculus GN=Mfge8 PE=1 SV=3 0.2424041 1.615049 D3Z623 D3Z623_MOUSE D3Z623_MOUSE MCG7194, isoform CRA_a OS=Mus musculus GN=9330159F19Rik PE=4 SV=2 -1.10424985 1.6131325 Q9D2F7 P210L_MOUSE P210L_MOUSE Nuclear pore membrane glycoprotein 210-like OS=Mus musculus GN=Nup210l PE=2 SV=2 0.373082575 1.6102342 Q9ES74 NEK7_MOUSE NEK7_MOUSE Serine/threonine-protein kinase Nek7 OS=Mus musculus GN=Nek7 PE=2 SV=1 0.89487005 1.60979875 Q32NZ6 TMC5_MOUSE TMC5_MOUSE Transmembrane channel-like protein 5 OS=Mus musculus GN=Tmc5 PE=2 SV=1 -0.06643125 1.59121865 Q9CQW9 IFM3_MOUSE IFM3_MOUSE Interferon-induced transmembrane protein 3 OS=Mus musculus GN=Ifitm3 PE=1 SV=1 -0.3668547 1.578817 E9Q2I4 E9Q2I4_MOUSE E9Q2I4_MOUSE Uncharacterized protein OS=Mus musculus GN=Elmsan1 PE=4 SV=1 -1.3351723 1.5784745 Q9CXF4 TBC15_MOUSE TBC15_MOUSE TBC1 domain family member 15 OS=Mus musculus GN=Tbc1d15 PE=1 SV=1 1.326292825 1.5667525 Q3UE31 K0930_MOUSE K0930_MOUSE Uncharacterized protein KIAA0930 homolog OS=Mus musculus PE=1 SV=2 -0.168702105 1.5655737 Q9JIP7 S15A1_MOUSE S15A1_MOUSE Solute carrier family 15 member 1 OS=Mus musculus GN=Slc15a1 PE=1 SV=2 -0.56940705 1.5604861 Q03265 ATPA_MOUSE ATPA_MOUSE ATP synthase subunit alpha, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Atp5a1 PE=1 SV=1 -1.34324565 1.557187 Q1WG82 ZGLP1_MOUSE ZGLP1_MOUSE GATA-type zinc finger protein 1 OS=Mus musculus GN=Zglp1 PE=2 SV=1 0.173817145 1.547324 Q9R0Q6 ARC1A_MOUSE ARC1A_MOUSE Actin-related protein 2/3 complex subunit 1A OS=Mus musculus GN=Arpc1a PE=1 SV=1 -0.38585062 1.53921945 Q99JW2 ACY1_MOUSE ACY1_MOUSE Aminoacylase-1 OS=Mus musculus GN=Acy1 PE=1 SV=1 0.79768725 1.53567265 Q9DBM1 GPTC1_MOUSE GPTC1_MOUSE G patch domain-containing protein 1 OS=Mus musculus GN=Gpatch1 PE=2 SV=1 1.032124525 1.5331435 Q61838 A2M_MOUSE A2M_MOUSE Alpha-2-macroglobulin OS=Mus musculus GN=A2m PE=1 SV=3 0.29355033 1.5290635 O08749 DLDH_MOUSE DLDH_MOUSE Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Dld PE=1 SV=2 -0.548929145 1.523671 A2RT91 ANKAR_MOUSE ANKAR_MOUSE Ankyrin and armadillo repeat-containing protein OS=Mus musculus GN=Ankar PE=2 SV=1 -1.0796173 1.52167125 D3Z2Q7 D3Z2Q7_MOUSE D3Z2Q7_MOUSE Protein Hmcn1 OS=Mus musculus GN=Hmcn1 PE=4 SV=1 -0.2365211 1.52080025 Q62187 TTF1_MOUSE TTF1_MOUSE Transcription termination factor 1 OS=Mus musculus GN=Ttf1 PE=1 SV=2 -0.136151475 1.51941415 Q8BM75 ARI5B_MOUSE ARI5B_MOUSE AT-rich interactive domain-containing protein 5B OS=Mus musculus GN=Arid5b PE=1 SV=3 0.514485678 1.5011009          P á g i n a 1 6 2       Tabla S2. Análisis proteómico de lisados celulares y exosomas derivados de MEFs Cav1WT y Cav1KO. Se muestran proteínas que presentan niveles similares entre lisados celulares (-1,5 ≤ Zq ≤ 1,5) y enriquecidas en exosomas derivados de MEFs Cav1KO (Zq ≤ 1,5). Proteinas enriquecidas en muestras Cav1WT Proteinas enriquecidas en muestras Cav1KO fasta proteina Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas Q8CIG0 DEP1A_MOUSE DEP1A_MOUSE DEP domain-containing protein 1A OS=Mus musculus GN=Depdc1a PE=1 SV=1 0.492053875 -7.139197 O55103 PRAX_MOUSE PRAX_MOUSE Periaxin OS=Mus musculus GN=Prx PE=1 SV=1 0.289042 -6.678576 Q3URD3 SLMAP_MOUSE SLMAP_MOUSE Sarcolemmal membrane-associated protein OS=Mus musculus GN=Slmap PE=1 SV=2 -0.61783492 -6.391332 Q3UXZ6 FA81A_MOUSE FA81A_MOUSE Protein FAM81A OS=Mus musculus GN=Fam81a PE=2 SV=2 -1.0614964 -5.580975 Q8CH09 SUGP2_MOUSE SUGP2_MOUSE SURP and G-patch domain-containing protein 2 OS=Mus musculus GN=Sugp2 PE=2 SV=2 -0.63230825 -5.4315825 Q61704 ITIH3_MOUSE ITIH3_MOUSE Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3 OS=Mus musculus GN=Itih3 PE=1 SV=3 0.634889435 -5.4309515 Q5QNR3 Q5QNR3_MOUSE Q5QNR3_MOUSE Ankyrin repeat domain 36 (Fragment) OS=Mus musculus GN=Ankrd36 PE=4 SV=2 0.14663565 -5.381203 P60041 SMS_MOUSE SMS_MOUSE Somatostatin OS=Mus musculus GN=Sst PE=2 SV=1 0.0800093 -4.838257 Q9D0M5 DYL2_MOUSE DYL2_MOUSE Dynein light chain 2, cytoplasmic OS=Mus musculus GN=Dynll2 PE=1 SV=1 -1.39417195 -4.6404315 P48759 PTX3_MOUSE PTX3_MOUSE Pentraxin-related protein PTX3 OS=Mus musculus GN=Ptx3 PE=1 SV=2 -1.489377875 -4.5634045 O88879 APAF_MOUSE APAF_MOUSE Apoptotic protease-activating factor 1 OS=Mus musculus GN=Apaf1 PE=1 SV=3 0.07667068 -4.351049 O70439 STX7_MOUSE STX7_MOUSE Syntaxin-7 OS=Mus musculus GN=Stx7 PE=1 SV=3 -0.678975125 -4.0837535 Q8CIM1 LRC45_MOUSE LRC45_MOUSE Leucine-rich repeat-containing protein 45 OS=Mus musculus GN=Lrrc45 PE=2 SV=2 1.19418255 -3.994488 Q8K0Z7 TACO1_MOUSE TACO1_MOUSE Translational activator of cytochrome c oxidase 1 OS=Mus musculus GN=Taco1 PE=2 SV=1 -0.070446115 -3.912003 Q8C6P5 Q8C6P5_MOUSE Q8C6P5_MOUSE MCG118654 OS=Mus musculus GN=E230019M04Rik PE=2 SV=1 -0.10734535 -3.85474 Q6PHQ8 NAA35_MOUSE NAA35_MOUSE N-alpha-acetyltransferase 35, NatC auxiliary subunit OS=Mus musculus GN=Naa35 PE=1 SV=1 0.289695113 -3.8043265 P14824 ANXA6_MOUSE ANXA6_MOUSE Annexin A6 OS=Mus musculus GN=Anxa6 PE=1 SV=3 -0.1089906 -3.707107 Q8C1A3 MTRR_MOUSE MTRR_MOUSE Methionine synthase reductase OS=Mus musculus GN=Mtrr PE=2 SV=2 -0.86639315 -3.6848055 Q6ZWY9 H2B1C_MOUSE H2B1C_MOUSE Histone H2B type 1-C/E/G OS=Mus musculus GN=Hist1h2bc PE=1 SV=3 -0.26717725 -3.5709335 Q05512 MARK2_MOUSE MARK2_MOUSE Serine/threonine-protein kinase MARK2 OS=Mus musculus GN=Mark2 PE=1 SV=3 -1.2945246 -3.4789985 Q8BGA5 KRR1_MOUSE KRR1_MOUSE KRR1 small subunit processome component homolog OS=Mus musculus GN=Krr1 PE=2 SV=1 -0.23709815 -3.43994 P56564 EAA1_MOUSE EAA1_MOUSE Excitatory amino acid transporter 1 OS=Mus musculus GN=Slc1a3 PE=1 SV=2 -0.159957275 -3.382943 Q5DU37 ZFY26_MOUSE ZFY26_MOUSE Zinc finger FYVE domain-containing protein 26 OS=Mus musculus GN=Zfyve26 PE=2 SV=2 -0.72484869 -3.37957 Q9QYX7 PCLO_MOUSE PCLO_MOUSE Protein piccolo OS=Mus musculus GN=Pclo PE=1 SV=4 0.43473455 -3.3379555 Q09XV5 CHD8_MOUSE CHD8_MOUSE Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 8 OS=Mus musculus GN=Chd8 PE=1 SV=1 0.29407045 -3.2994605 Q08481 PECA1_MOUSE PECA1_MOUSE Platelet endothelial cell adhesion molecule OS=Mus musculus GN=Pecam1 PE=1 SV=1 -0.1334888 -3.2882955 Q64522 H2A2B_MOUSE H2A2B_MOUSE Histone H2A type 2-B OS=Mus musculus GN=Hist2h2ab PE=1 SV=3 0.4528265 -3.287061 F8WIT2 F8WIT2_MOUSE F8WIT2_MOUSE Annexin OS=Mus musculus GN=Anxa6 PE=3 SV=1 -1.15266515 -3.276662 Q8CDM4 CCD73_MOUSE CCD73_MOUSE Coiled-coil domain-containing protein 73 OS=Mus musculus GN=Ccdc73 PE=1 SV=2 0.69508935 -3.276174 B2RXC6 B2RXC6_MOUSE B2RXC6_MOUSE DNA-directed RNA polymerase OS=Mus musculus GN=Polr3a PE=2 SV=1 0.56381955 -3.2355195      P á g i n a 1 6 3   fasta proteina Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas P62806 H4_MOUSE H4_MOUSE Histone H4 OS=Mus musculus GN=Hist1h4a PE=1 SV=2 -0.2806253 -3.158023 Q8BGC0 HTSF1_MOUSE HTSF1_MOUSE HIV Tat-specific factor 1 homolog OS=Mus musculus GN=Htatsf1 PE=1 SV=1 -0.4277447 -3.1530725 Q3USW5 FXRD2_MOUSE FXRD2_MOUSE FAD-dependent oxidoreductase domain-containing protein 2 OS=Mus musculus GN=Foxred2 PE=2 SV=1 1.144015525 -3.149493 P68433 H31_MOUSE H31_MOUSE Histone H3.1 OS=Mus musculus GN=Hist1h3a PE=1 SV=2 -1.06596385 -3.1307975 Q8CGP0 H2B3B_MOUSE H2B3B_MOUSE Histone H2B type 3-B OS=Mus musculus GN=Hist3h2bb PE=1 SV=3 -1.381308425 -3.1213465 Q80VI1 TRI56_MOUSE TRI56_MOUSE E3 ubiquitin-protein ligase TRIM56 OS=Mus musculus GN=Trim56 PE=1 SV=1 0.4141244 -3.095956 P22752 H2A1_MOUSE H2A1_MOUSE Histone H2A type 1 OS=Mus musculus GN=Hist1h2ab PE=1 SV=3 -1.0177139 -3.0830405 O35600 ABCA4_MOUSE ABCA4_MOUSE Retinal-specific ATP-binding cassette transporter OS=Mus musculus GN=Abca4 PE=2 SV=1 0.3378392 -3.060893 P97868 RBBP6_MOUSE RBBP6_MOUSE E3 ubiquitin-protein ligase RBBP6 OS=Mus musculus GN=Rbbp6 PE=1 SV=5 -0.1679444 -3.007676 Q70FJ1 AKAP9_MOUSE AKAP9_MOUSE A-kinase anchor protein 9 OS=Mus musculus GN=Akap9 PE=2 SV=2 0.22078809 -2.9942545 Q9WVB4 SLIT3_MOUSE SLIT3_MOUSE Slit homolog 3 protein OS=Mus musculus GN=Slit3 PE=2 SV=2 0.2308981 -2.927334 Q9JIQ3 DBLOH_MOUSE DBLOH_MOUSE Diablo homolog, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Diablo PE=1 SV=2 0.2715241 -2.919587 O08808 DIAP1_MOUSE DIAP1_MOUSE Protein diaphanous homolog 1 OS=Mus musculus GN=Diaph1 PE=1 SV=1 0.7310884 -2.884417 Q6KAR6 EXOC3_MOUSE EXOC3_MOUSE Exocyst complex component 3 OS=Mus musculus GN=Exoc3 PE=1 SV=2 0.181928605 -2.870761 A2AFR3 FRPD4_MOUSE FRPD4_MOUSE FERM and PDZ domain-containing protein 4 OS=Mus musculus GN=Frmpd4 PE=1 SV=1 1.201638375 -2.8594015 Q7M6Y6 HTRB2_MOUSE HTRB2_MOUSE HEAT repeat-containing protein 7B2 OS=Mus musculus GN=Heatr7b2 PE=1 SV=2 -0.24368275 -2.856035 Q91ZV8 GP124_MOUSE GP124_MOUSE G-protein coupled receptor 124 OS=Mus musculus GN=Gpr124 PE=2 SV=2 -0.77948585 -2.8019115 Q3V300 KIF22_MOUSE KIF22_MOUSE Kinesin-like protein KIF22 OS=Mus musculus GN=Kif22 PE=2 SV=2 0.56344495 -2.755578 Q3THW5 H2AV_MOUSE H2AV_MOUSE Histone H2A.V OS=Mus musculus GN=H2afv PE=1 SV=3 -0.43509165 -2.7245435 Q8R1U1 COG4_MOUSE COG4_MOUSE Conserved oligomeric Golgi complex subunit 4 OS=Mus musculus GN=Cog4 PE=2 SV=1 0.4550031 -2.689075 Q9JLZ3 AUHM_MOUSE AUHM_MOUSE Methylglutaconyl-CoA hydratase, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Auh PE=2 SV=1 -0.0526517 -2.679432 Q8VDP4 K1967_MOUSE K1967_MOUSE DBIRD complex subunit KIAA1967 homolog OS=Mus musculus PE=1 SV=2 0.065294825 -2.651144 Q9QUG2 POLK_MOUSE POLK_MOUSE DNA polymerase kappa OS=Mus musculus GN=Polk PE=1 SV=1 0.711130722 -2.6414295 P10922 H10_MOUSE H10_MOUSE Histone H1.0 OS=Mus musculus GN=H1f0 PE=2 SV=4 -0.981066675 -2.606747 P10852 4F2_MOUSE 4F2_MOUSE 4F2 cell-surface antigen heavy chain OS=Mus musculus GN=Slc3a2 PE=1 SV=1 -1.492468125 -2.5860915 Q04750 TOP1_MOUSE TOP1_MOUSE DNA topoisomerase 1 OS=Mus musculus GN=Top1 PE=1 SV=2 -0.6614879 -2.578468 Q8K4S1 PLCE1_MOUSE PLCE1_MOUSE 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase epsilon-1 OS=Mus musculus GN=Plce1 PE=1 SV=3 0.2880974 -2.5754195 Q61464 ZN638_MOUSE ZN638_MOUSE Zinc finger protein 638 OS=Mus musculus GN=Znf638 PE=1 SV=2 0.387129 -2.5643985 Q921G8 GCP2_MOUSE GCP2_MOUSE Gamma-tubulin complex component 2 OS=Mus musculus GN=Tubgcp2 PE=2 SV=2 -0.255987483 -2.5029685 Q5U4C3 SFR19_MOUSE SFR19_MOUSE Splicing factor, arginine/serine-rich 19 OS=Mus musculus GN=Scaf1 PE=1 SV=1 -0.1009311 -2.4749055 Q80T85 DCAF5_MOUSE DCAF5_MOUSE DDB1- and CUL4-associated factor 5 OS=Mus musculus GN=Dcaf5 PE=1 SV=2 -0.8107547 -2.4575655 P97384 ANX11_MOUSE ANX11_MOUSE Annexin A11 OS=Mus musculus GN=Anxa11 PE=1 SV=2 -0.388739375 -2.443557 A2AG06 CQ104_MOUSE CQ104_MOUSE Uncharacterized protein C17orf104 homolog OS=Mus musculus GN=Gm1564 PE=2 SV=1 -0.991816 -2.4380715 E9PUS4 E9PUS4_MOUSE E9PUS4_MOUSE Protein Zfp944 OS=Mus musculus GN=Zfp944 PE=4 SV=1 0.64590455 -2.4367035 Q80WE4 KI20B_MOUSE KI20B_MOUSE Kinesin-like protein KIF20B OS=Mus musculus GN=Kif20b PE=1 SV=3 0.7062975 -2.421928 E9Q3P4 E9Q3P4_MOUSE E9Q3P4_MOUSE Protein Cenpf OS=Mus musculus GN=Cenpf PE=4 SV=1 0.1351035 -2.4155335 A2A7F4 A2A7F4_MOUSE A2A7F4_MOUSE MCG122876 OS=Mus musculus GN=Rlf PE=4 SV=1 -0.92340135 -2.414259 Q6ZWR6 SYNE1_MOUSE SYNE1_MOUSE Nesprin-1 OS=Mus musculus GN=Syne1 PE=1 SV=2 0.237680725 -2.412317 Q62293 Q62293_MOUSE Q62293_MOUSE Interferon-gamma-inducible GTPase Ifggb5 protein OS=Mus musculus GN=Tgtp PE=2 SV=1 -0.7969779 -2.391253 Q8R4U6 TOP1M_MOUSE TOP1M_MOUSE DNA topoisomerase I, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Top1mt PE=2 SV=1 0.2492915 -2.3825325 B1AQJ2 UBP36_MOUSE UBP36_MOUSE Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 36 OS=Mus musculus GN=Usp36 PE=2 SV=1 0.152612425 -2.3764055    P á g i n a 1 6 4   fasta proteina Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas A3KG81 A3KG81_MOUSE A3KG81_MOUSE Multiple PDZ domain protein OS=Mus musculus GN=Mpdz PE=4 SV=1 0.98571325 -2.372374 Q8C4Y3 NELFB_MOUSE NELFB_MOUSE Negative elongation factor B OS=Mus musculus GN=Cobra1 PE=2 SV=2 0.0578979 -2.3721825 Q8BUV3 GEPH_MOUSE GEPH_MOUSE Gephyrin OS=Mus musculus GN=Gphn PE=1 SV=2 -0.96703745 -2.3437155 Q8BTS4 NUP54_MOUSE NUP54_MOUSE Nuclear pore complex protein Nup54 OS=Mus musculus GN=Nup54 PE=1 SV=1 0.318808315 -2.313369 Q61235 SNTB2_MOUSE SNTB2_MOUSE Beta-2-syntrophin OS=Mus musculus GN=Sntb2 PE=1 SV=2 -0.9237506 -2.302934 P31750 AKT1_MOUSE AKT1_MOUSE RAC-alpha serine/threonine-protein kinase OS=Mus musculus GN=Akt1 PE=1 SV=2 0.157577475 -2.293791 Q9QZZ4 MYO15_MOUSE MYO15_MOUSE Unconventional myosin-XV OS=Mus musculus GN=Myo15a PE=1 SV=2 0.842512 -2.262373 Q8C166 CPNE1_MOUSE CPNE1_MOUSE Copine-1 OS=Mus musculus GN=Cpne1 PE=1 SV=1 -0.106032535 -2.198329 P25976 UBF1_MOUSE UBF1_MOUSE Nucleolar transcription factor 1 OS=Mus musculus GN=Ubtf PE=1 SV=1 0.16988003 -2.1711105 Q8BH66 ATLA1_MOUSE ATLA1_MOUSE Atlastin-1 OS=Mus musculus GN=Atl1 PE=1 SV=1 -1.14690585 -2.1637945 Q80XJ3 TTC28_MOUSE TTC28_MOUSE Tetratricopeptide repeat protein 28 OS=Mus musculus GN=Ttc28 PE=2 SV=2 0.0725544 -2.1628035 Q99PP2 ZN318_MOUSE ZN318_MOUSE Zinc finger protein 318 (Fragment) OS=Mus musculus GN=Znf318 PE=1 SV=2 -1.0659272 -2.1491575 Q99MJ9 DDX50_MOUSE DDX50_MOUSE ATP-dependent RNA helicase DDX50 OS=Mus musculus GN=Ddx50 PE=2 SV=1 -0.437810413 -2.1045935 Q8BTJ4 ENPP4_MOUSE ENPP4_MOUSE Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 4 OS=Mus musculus GN=Enpp4 PE=1 SV=1 -1.3537899 -2.0994985 Q8JZZ7 LPHN2_MOUSE LPHN2_MOUSE Latrophilin-2 (Fragment) OS=Mus musculus GN=Lphn2 PE=1 SV=2 -1.3852275 -2.0980885 Q61735 CD47_MOUSE CD47_MOUSE Leukocyte surface antigen CD47 OS=Mus musculus GN=Cd47 PE=1 SV=2 0.05880495 -2.0940625 Q80W49 CRBG3_MOUSE CRBG3_MOUSE Beta/gamma crystallin domain-containing protein 3 OS=Mus musculus GN=Crybg3 PE=2 SV=2 0.200417 -2.0379395 E0CZ16 KLHL3_MOUSE KLHL3_MOUSE Kelch-like protein 3 OS=Mus musculus GN=Klhl3 PE=1 SV=2 -0.6835018 -2.020152 Q07076 ANXA7_MOUSE ANXA7_MOUSE Annexin A7 OS=Mus musculus GN=Anxa7 PE=2 SV=2 -0.1334569 -2.0198945 Q6NV83 SR140_MOUSE SR140_MOUSE U2 snRNP-associated SURP motif-containing protein OS=Mus musculus GN=U2surp PE=1 SV=3 -0.26062885 -2.015169 P97376 FRG1_MOUSE FRG1_MOUSE Protein FRG1 OS=Mus musculus GN=Frg1 PE=1 SV=2 -0.126245748 -2.0098715 P10107 ANXA1_MOUSE ANXA1_MOUSE Annexin A1 OS=Mus musculus GN=Anxa1 PE=1 SV=2 0.819101575 -2.008743 Q9Z1W8 AT12A_MOUSE AT12A_MOUSE Potassium-transporting ATPase alpha chain 2 OS=Mus musculus GN=Atp12a PE=1 SV=3 0.533568275 -2.003361 Q3UKJ7 SMU1_MOUSE SMU1_MOUSE WD40 repeat-containing protein SMU1 OS=Mus musculus GN=Smu1 PE=2 SV=2 0.431808125 -1.9910455 Q9R002 IFI2_MOUSE IFI2_MOUSE Interferon-activable protein 202 OS=Mus musculus GN=Ifi202 PE=1 SV=3 -0.2884163 -1.979839 Q6VNS1 NTRK3_MOUSE NTRK3_MOUSE NT-3 growth factor receptor OS=Mus musculus GN=Ntrk3 PE=1 SV=1 -0.9486528 -1.978329 D3YZU1 SHAN1_MOUSE SHAN1_MOUSE SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 1 OS=Mus musculus GN=Shank1 PE=2 SV=1 1.1795551 -1.975272 Q7TPV4 MBB1A_MOUSE MBB1A_MOUSE Myb-binding protein 1A OS=Mus musculus GN=Mybbp1a PE=1 SV=2 -0.197273475 -1.9673355 Q99LB6 MAT2B_MOUSE MAT2B_MOUSE Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta OS=Mus musculus GN=Mat2b PE=2 SV=1 -1.025617325 -1.954822 P05622 PGFRB_MOUSE PGFRB_MOUSE Platelet-derived growth factor receptor beta OS=Mus musculus GN=Pdgfrb PE=1 SV=1 -1.4780345 -1.952385 Q8BWM0 PGES2_MOUSE PGES2_MOUSE Prostaglandin E synthase 2 OS=Mus musculus GN=Ptges2 PE=1 SV=3 0.27492953 -1.9409392 Q3TEA8 HP1B3_MOUSE HP1B3_MOUSE Heterochromatin protein 1-binding protein 3 OS=Mus musculus GN=Hp1bp3 PE=1 SV=1 -0.31185695 -1.940511 Q7TMY8 HUWE1_MOUSE HUWE1_MOUSE E3 ubiquitin-protein ligase HUWE1 OS=Mus musculus GN=Huwe1 PE=1 SV=5 -1.3550889 -1.93579 O54734 OST48_MOUSE OST48_MOUSE Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase 48 kDa subunit OS=Mus musculus GN=Ddost PE=1 SV=2 -0.268782555 -1.905627 Q3TWW8 Q3TWW8_MOUSE Q3TWW8_MOUSE Protein Srsf6 OS=Mus musculus GN=Srsf6 PE=2 SV=1 -0.4380179 -1.89574 Q9Z277 BAZ1B_MOUSE BAZ1B_MOUSE Tyrosine-protein kinase BAZ1B OS=Mus musculus GN=Baz1b PE=1 SV=2 0.408102675 -1.8779685 P30658 CBX2_MOUSE CBX2_MOUSE Chromobox protein homolog 2 OS=Mus musculus GN=Cbx2 PE=1 SV=2 0.84694175 -1.87706495 P19137 LAMA1_MOUSE LAMA1_MOUSE Laminin subunit alpha-1 OS=Mus musculus GN=Lama1 PE=1 SV=1 0.974480825 -1.86619 Q3UTQ8 CDKL5_MOUSE CDKL5_MOUSE Cyclin-dependent kinase-like 5 OS=Mus musculus GN=Cdkl5 PE=2 SV=1 0.154849 -1.8277985 O54824 IL16_MOUSE IL16_MOUSE Pro-interleukin-16 OS=Mus musculus GN=Il16 PE=1 SV=3 -0.52242825 -1.8223295 Q9CZW4 ACSL3_MOUSE ACSL3_MOUSE Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 3 OS=Mus musculus GN=Acsl3 PE=2 SV=2 -1.379620225 -1.815814      P á g i n a 1 6 5   fasta proteina Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas Q09143 CTR1_MOUSE CTR1_MOUSE High affinity cationic amino acid transporter 1 OS=Mus musculus GN=Slc7a1 PE=2 SV=1 -0.553424075 -1.8122005 Q61656 DDX5_MOUSE DDX5_MOUSE Probable ATP-dependent RNA helicase DDX5 OS=Mus musculus GN=Ddx5 PE=1 SV=2 0.128016975 -1.8074435 Q6PHS9 CA2D2_MOUSE CA2D2_MOUSE Voltage-dependent calcium channel subunit alpha-2/delta-2 OS=Mus musculus GN=Cacna2d2 PE=1 SV=1 0.789331875 -1.8031655 Q63829 COMD3_MOUSE COMD3_MOUSE COMM domain-containing protein 3 OS=Mus musculus GN=Commd3 PE=2 SV=1 -0.61347 -1.7785064 E9PYK3 E9PYK3_MOUSE E9PYK3_MOUSE Protein Parp4 OS=Mus musculus GN=Parp4 PE=4 SV=1 -0.299329 -1.7700899 Q8VHI3 OFUT2_MOUSE OFUT2_MOUSE GDP-fucose protein O-fucosyltransferase 2 OS=Mus musculus GN=Pofut2 PE=1 SV=1 0.176851473 -1.7498815 Q9R008 KIME_MOUSE KIME_MOUSE Mevalonate kinase OS=Mus musculus GN=Mvk PE=2 SV=1 -0.4667503 -1.74041 Q8BLN5 ERG7_MOUSE ERG7_MOUSE Lanosterol synthase OS=Mus musculus GN=Lss PE=2 SV=2 0.3823731 -1.729372 Q01279 EGFR_MOUSE EGFR_MOUSE Epidermal growth factor receptor OS=Mus musculus GN=Egfr PE=1 SV=1 -0.593740675 -1.717385 Q9WVG6 CARM1_MOUSE CARM1_MOUSE Histone-arginine methyltransferase CARM1 OS=Mus musculus GN=Carm1 PE=1 SV=2 0.29961271 -1.7078905 Q6P9P6 KIF11_MOUSE KIF11_MOUSE Kinesin-like protein KIF11 OS=Mus musculus GN=Kif11 PE=2 SV=1 0.860283223 -1.703483 P59242 CING_MOUSE CING_MOUSE Cingulin OS=Mus musculus GN=Cgn PE=1 SV=1 -0.6399701 -1.700078 Q8CC70 Q8CC70_MOUSE Q8CC70_MOUSE Protein 9230110C19Rik OS=Mus musculus GN=9230110C19Rik PE=2 SV=1 -0.54603065 -1.687325 Q9D7P6 ISCU_MOUSE ISCU_MOUSE Iron-sulfur cluster assembly enzyme ISCU, mitochondrial OS=Mus musculus GN=Iscu PE=1 SV=1 -0.365224985 -1.6843985 Q8VDN2 AT1A1_MOUSE AT1A1_MOUSE Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1 OS=Mus musculus GN=Atp1a1 PE=1 SV=1 -0.5416816 -1.6791835 Q9QUJ7 ACSL4_MOUSE ACSL4_MOUSE Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 4 OS=Mus musculus GN=Acsl4 PE=2 SV=2 -0.7774958 -1.675535 P40224 SDF1_MOUSE SDF1_MOUSE Stromal cell-derived factor 1 OS=Mus musculus GN=Cxcl12 PE=2 SV=2 -0.94043435 -1.674403 P59108 CPNE2_MOUSE CPNE2_MOUSE Copine-2 OS=Mus musculus GN=Cpne2 PE=2 SV=1 -0.551229175 -1.664166 A2A6A1 GPTC8_MOUSE GPTC8_MOUSE G patch domain-containing protein 8 OS=Mus musculus GN=Gpatch8 PE=2 SV=1 1.13310405 -1.6641445 Q8BFY6 PEF1_MOUSE PEF1_MOUSE Peflin OS=Mus musculus GN=Pef1 PE=2 SV=1 0.037529375 -1.663258 P20444 KPCA_MOUSE KPCA_MOUSE Protein kinase C alpha type OS=Mus musculus GN=Prkca PE=1 SV=3 -0.10052165 -1.6609865 Q9EQK5 MVP_MOUSE MVP_MOUSE Major vault protein OS=Mus musculus GN=Mvp PE=1 SV=4 -0.0356334 -1.659332 Q8R146 APEH_MOUSE APEH_MOUSE Acylamino-acid-releasing enzyme OS=Mus musculus GN=Apeh PE=2 SV=3 -0.207562815 -1.651233 P53690 MMP14_MOUSE MMP14_MOUSE Matrix metalloproteinase-14 OS=Mus musculus GN=Mmp14 PE=2 SV=3 -0.342394325 -1.6383805 Q8BK62 OLFL3_MOUSE OLFL3_MOUSE Olfactomedin-like protein 3 OS=Mus musculus GN=Olfml3 PE=2 SV=2 0.08579105 -1.6320145 Q9WTS6 TEN3_MOUSE TEN3_MOUSE Teneurin-3 OS=Mus musculus GN=Tenm3 PE=1 SV=1 1.269845 -1.630478 Q60838 DVL2_MOUSE DVL2_MOUSE Segment polarity protein dishevelled homolog DVL-2 OS=Mus musculus GN=Dvl2 PE=1 SV=2 -0.23034338 -1.6227015 P30412 PPIC_MOUSE PPIC_MOUSE Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase C OS=Mus musculus GN=Ppic PE=1 SV=1 -0.692046725 -1.598411 Q80T74 KLH29_MOUSE KLH29_MOUSE Kelch-like protein 29 OS=Mus musculus GN=Klhl29 PE=2 SV=2 1.250241 -1.5943585 E9Q6P5 E9Q6P5_MOUSE E9Q6P5_MOUSE Protein Ttc7b OS=Mus musculus GN=Ttc7b PE=4 SV=1 -1.01614145 -1.58779 Q9EPK6 SIL1_MOUSE SIL1_MOUSE Nucleotide exchange factor SIL1 OS=Mus musculus GN=Sil1 PE=1 SV=2 1.4380755 -1.5828995 Q9D1M1 Q9D1M1_MOUSE Q9D1M1_MOUSE DNA-directed RNA polymerases I and III subunit RPAC2 OS=Mus musculus GN=Polr1d PE=2 SV=1 -0.39317485 -1.579408 P0C027 NUD10_MOUSE NUD10_MOUSE Diphosphoinositol polyphosphate phosphohydrolase 3-alpha OS=Mus musculus GN=Nudt10 PE=1 SV=1 -0.9874414 -1.577782 P17918 PCNA_MOUSE PCNA_MOUSE Proliferating cell nuclear antigen OS=Mus musculus GN=Pcna PE=1 SV=2 -1.134103825 -1.5689185 Q64430 ATP7A_MOUSE ATP7A_MOUSE Copper-transporting ATPase 1 OS=Mus musculus GN=Atp7a PE=1 SV=3 -1.38178745 -1.564196 Q9R1T2 SAE1_MOUSE SAE1_MOUSE SUMO-activating enzyme subunit 1 OS=Mus musculus GN=Sae1 PE=2 SV=1 -0.408654175 -1.5640595 Q9Z0T6 PKDRE_MOUSE PKDRE_MOUSE Polycystic kidney disease and receptor for egg jelly-related protein OS=Mus musculus GN=Pkdrej PE=2 SV=1 0.2310716 -1.562343 Q80UZ0 FGD5_MOUSE FGD5_MOUSE FYVE, RhoGEF and PH domain-containing protein 5 OS=Mus musculus GN=Fgd5 PE=1 SV=2 -0.8966598 -1.561054 P21279 GNAQ_MOUSE GNAQ_MOUSE Guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha OS=Mus musculus GN=Gnaq PE=1 SV=4 -0.480527925 -1.5580455 P31786 ACBP_MOUSE ACBP_MOUSE Acyl-CoA-binding protein OS=Mus musculus GN=Dbi PE=1 SV=2 -0.80820145 -1.557912 Q8CDL9 CCD87_MOUSE CCD87_MOUSE Coiled-coil domain-containing protein 87 OS=Mus musculus GN=Ccdc87 PE=2 SV=2 -0.9034457 -1.5538812    P á g i n a 1 6 6   fasta proteina Descripción Zq medio en lisados celulares Zq medio en exosomas P28653 PGS1_MOUSE PGS1_MOUSE Biglycan OS=Mus musculus GN=Bgn PE=2 SV=1 0.763910375 -1.5513725 Q80U72 SCRIB_MOUSE SCRIB_MOUSE Protein scribble homolog OS=Mus musculus GN=Scrib PE=1 SV=2 -0.28618435 -1.5426335 O88866 HUNK_MOUSE HUNK_MOUSE Hormonally up-regulated neu tumor-associated kinase OS=Mus musculus GN=Hunk PE=2 SV=1 0.26816725 -1.538813 Q61234 SNTA1_MOUSE SNTA1_MOUSE Alpha-1-syntrophin OS=Mus musculus GN=Snta1 PE=1 SV=1 -0.469388898 -1.53714 O54962 BAF_MOUSE BAF_MOUSE Barrier-to-autointegration factor OS=Mus musculus GN=Banf1 PE=1 SV=1 -0.141920808 -1.532403 B2RT41 B2RT41_MOUSE B2RT41_MOUSE Protein Zfc3h1 OS=Mus musculus GN=Zfc3h1 PE=2 SV=1 1.16211915 -1.52911505 P25206 MCM3_MOUSE MCM3_MOUSE DNA replication licensing factor MCM3 OS=Mus musculus GN=Mcm3 PE=1 SV=2 -1.008582025 -1.5172475 Q3V0M1 Q3V0M1_MOUSE Q3V0M1_MOUSE Gene model 906, (NCBI) OS=Mus musculus GN=Gm906 PE=2 SV=1 0.13860632 -1.514371 Q9JJE7 FADS3_MOUSE FADS3_MOUSE Fatty acid desaturase 3 OS=Mus musculus GN=Fads3 PE=2 SV=2 -1.34789725 -1.511395 Q8BWZ3 NAA25_MOUSE NAA25_MOUSE N-alpha-acetyltransferase 25, NatB auxiliary subunit OS=Mus musculus GN=Naa25 PE=1 SV=1 0.2478496 -1.506909          P á g i n a 1 6 7