Validez, utilidad clínica y seguridad de la nueva plataforma genómica de secuenciación de próxima generación (NGS) FoundationOne® en el cáncer de pulmón no microcítico y otros tipos de tumores sólidos Validity, clinical utility and safety of the next-generation sequencing (NGS) genomic platform FoundationOne® in non-small cell lung cancer and other solid tumors Informes de Evaluación de Tecnologías Sanitarias INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 2018 MINISTERIO DE SANIDAD, CONSUMO Y BIENESTAR SOCIAL Instituto Carlos III de Salud Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias MINISTERIO DE SANIDAD, CONSUMO Y BIENESTAR SOCIAL Validez, utilidad clínica y seguridad de la nueva plataforma genómica de secuenciación de próxima generación (NGS) FoundationOne® en el cáncer de pulmón no microcítico y otros tipos de tumores sólidos Validity, clinical utility and safety of the next-generation sequencing (NGS) genomic platform FoundationOne® in non-small cell lung cancer and other solid tumors Informes de Evaluación de Tecnologías Sanitarias INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 2018 MINISTERIO DE SANIDAD, CONSUMO Y BIENESTAR SOCIAL Validez, utilidad clínica y seguridad de la nueva plataforma genómica de secuenciación de próxima generación (NGS) FoundationOne® en el cáncer de pulmón no microcítico y otros tipos de tumores sólidos. Cristina Asensio del Barrio, Esther Elena García Carpintero, Montserrat Carmona Rodríguez. Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social. Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Salud Carlos III. 2019. 1 archivo pdf;— (Informes, Estudios e Investigación) Palabras clave: FoundationOne; Validez diagnóstica; Utilidad clínica; Evaluación de Tecnologías Sanitarias. Keywords: FoundationOne; Diagnostic validity; Clinic Utility; Health Technology Assessment. Autoras: Cristina Asensio del Barrio Esther Elena García Carpintero Montserrat Carmona Rodríguez Convenio de colaboración/financiación: Este documento ha sido realizado por la Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del ISCIII en el marco de la financiación del Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social para el desarrollo de las actividades del Plan anual de trabajo de la Red Española de Agencias de Evaluación de Tecnologías Sanitarias y Prestaciones del SNS. Para citar este informe: ASENSIO DEL BARRIO C, GARCÍA CARPINTERO EE, CARMONA RODRÍGUEZ M. «Validez, utilidad clínica y seguridad de la nueva plataforma genómica de secuenciación de próxima generación (NGS) FoundationOne® en el cáncer de pulmón no microcítico y otros tipos de tumores sólidos». Red Española de Agencias de Evaluación de Tecnologías y Prestaciones del SNS. Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias (AETS) - Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Madrid. 2019. Informes de Evaluación de Tecnologías Sanitarias. Revisión externa: Este informe de evaluación ha sido sometido a un proceso de revisión externa. La Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Salud Carlos III agradece a la Dra. Carmen Ayuso García y a la Dra. Rosa Riveiro Álvarez, del Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz (Madrid), su colaboración desinteresada y los comentarios aportados. El contenido del presente informe es responsabilidad exclusiva de la Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del Instituto de Salud Carlos III sin que la colaboración de los revisores externos presuponga por su parte la completa aceptación del mismo. Las revisoras externas del documento no suscriben necesariamente todas y cada una de las conclusiones y recomendaciones finales, que son responsabilidad exclusiva de las autoras. Declaración de conflicto de interés: Las autoras declaran que no ha existido ningún tipo de conflicto de interés en la elaboración de este documento. Este documento puede ser reproducido total o parcialmente, por cualquier medio, siempre que se cite explícitamente su procedencia. Edita: Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social (MSCBS) Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias del ISCIII. MSCBS NIPO PDF: 731190852 EPUB: 731190868 MCIU NIPO PDF: 695190059 EPUB: 695190307 Maquetación: DiScript Preimpresión, S. L. Validez, utilidad clínica y seguridad de la nueva plataforma genómica de secuenciación de próxima generación (NGS) FoundationOne® en el cáncer de pulmón no microcítico y otros tipos de tumores sólidos Validity, clinical utility and safety of the next-generation sequencing (NGS) genomic platform FoundationOne® in non-small cell lung cancer and other solid tumors Informes de Evaluación de Tecnologías Sanitarias Instituto Carlos III de Salud Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias MINISTERIO DE SANIDAD, CONSUMO Y BIENESTAR SOCIAL VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 5 Índice Lista de figuras 7 Lista de tabLas 7 Lista de abreviaturas 8 resumen 11 summary 13 aLgunos conceptos o definiciones 15 introducción 22 La tecnología: FoundationOne® y FoundationOne CDx® 25 Otras tecnologías diagnósticas y las NGS 32 El cáncer y su relación con las GAs 37 Sobre la medicina de precisión en oncología 39 objetivo 45 metodoLogía 46 Fuentes de información y estrategias de búsqueda 46 Selección de estudios 48 Criterios de inclusión de los estudios 48 Criterios de exclusión 49 Extracción de datos 50 Síntesis de los datos 51 resuLtados 52 Revisión de las GAs y terapias en los cinco tumores sólidos 52 Resultados de la búsqueda bibliográfica 74 Descripción de la evidencia disponible 74 Ensayos clínicos con F1/F1CDx 89 discusión 94 Calidad de la evidencia 109 Limitaciones de esta revisión 109 concLusiones 111 Conclusiones de la revisión de la literatura 111 Para investigaciones futuras 112 Valoraciones finales 113 bibLiografía 114 anexos 129 ANEXO I. Lista de genes estudiados por F1CDx 129 ANEXO II. Listado de otros tests CDx aprobados por la FDA para las GAs que detecta F1CDx 130 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 6 ANEXO III. Estrategia de búsqueda en PubMed y Cochrane Library 131 ANEXO IV. Diagrama de flujo de selección de estudios 132 ANEXO V. Estudios excluidos y motivo de exclusión 133 ANEXO VI. Tablas de extracción de datos de los artículos incluidos 134 ANEXO VII. Otras plataformas NGS distintas de F1 146 ANEXO VIII. Ensayo clínicos con F1/F1CDx 153 VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 7 Lista de figuras Figura 1. Validez analítica de F1 .................................................................... 26 Figura 2. Estudios clínicos de concordancia entre F1CDx y otros tests ... 28 Figura 3. Indicaciones de F1CDx como companion diagnostic ................. 31 Figura 4. Tratamiento del NSCLC en estadio IV sin GAs intervenibles .... 60 Figura 5. Proceso de selección de estudios .................................................. 132 Lista de tablas Tabla 1. Concordancia entre F1CDx y F1 LDT........................................... 27 Tabla 2. Respuesta de los NSCLC al tratamiento recomendado por F1. Influencia de F1 en la decisión terapéutica. Tratamiento administrado ... 77 Tabla 3. Artículos excluidos y motivo de exclusión .................................... 133 Tabla 4. Estudios de F1 en pacientes con tumores de pulmón .................. 134 Tabla 5. Estudios de F1 en pacientes con cáncer de mama ....................... 139 Tabla 6. Estudios de F1 en pacientes con melanoma ................................. 145 Tabla 7. Plataformas NGS: principales características ................................ 152 Tabla 8. Ensayos clínicos con F1/F1CDx ..................................................... 153 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 8 Lista de abreviaturas AI Inhibidor de aromatasas ALK Anaplastic lymphoma kinase AKT v-akt murine thymoma viral oncogene homologue ASCO American Society of Clinical Oncology BCRA1/2 Breast cancer gene 1/2 BRAF v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B CAP College of American Pathologists CCR Carcinoma colorrectal CDKN2A/B Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A/B CDx Companion Diagnostic CGP Perfil genómico completo CISH Hibridación in situ cromogénica CLIA Clinical Laboratory Improvement Amendments certified CMI Caris Molecular Intelligence CNA/CVN Alteraciones / Variaciones en el número de copias COSMIC Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer CRGA Clinical relevant genomic alteration CT Tomografía computerizada CTCAE NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events ctDNA DNA tumoral libre circulante CTLA4 Anti-cytotoxic T-Lymphocyte antigen 4 dMMR Deficiencia en la reparación de apareamiento erróneos DNA Ácido desoxirribonucleico EA Eventos adversos ECA Ensayo controlado y aleatorizado ECOG PS Eastern Cooperative Oncology Group Performance Status EMA European Medicines Agency ER Receptor de estrógenos ERBB2 erb-B2 receptor tyrosine kinase 2 ERK Extracellular signal-regulated kinase ESMO European Society for Medical Oncology F1 LDT FoundationOne Laboratory Developed Test F1CDx FoundationOne Diagnostic Companion FDA Food and Drug Administration FFPE Fijado en formalina e incluido o embebido en parafina FGFR Fibroblast growth factor receptor FISH Hibridación in situ fluorescente G360 Guardant 360 GA Alteraciones genómicas VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 9 H&E Hematoxilina y eosina HER2 Receptor 2 de factor de crecimiento epidérmico humano HR Receptores hormonales HRAS Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog HRR Reparación de recombinación homóloga IHC Inmunohistoquímica IMPACT Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets irAE Inmune-related adverse events KRAS Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog MAF Frecuencia del alelo minoritario (minor allele frequency) MAP Molecular Analyses for Personalized Medicine MAPK Mitogen-activated protein kinase MET Mesenchymal epithelial transition MEK mitogen-activated protein kinase MMR Mismatch repair MSI Inestabilidad de microsatélites MSI-H Niveles altos de MSI MSI-L Niveles bajos de MSI MSK Memorial Sloan Kettering MSS Estabilidad de microsatélites mCCR CCR metastásico mTOR Mammalian target of rapamycin NCCN National Comprehensive Cancer Network NICE National Institute for Health and Clinical Excellence NGS Secuenciación de nueva generación / Secuenciación masiva NPA Porcentaje de acuerdo negativo NRAS Neuroblastoma rat sarcoma viral oncogene homolog NSCLC Cáncer de pulmón no microcítico/de células no pequeñas NTRK1 Neurotrophic tyrosine kinase receptor 1 PARP Poli-ADP-ribosa-polimerasa pb Par de bases PCDx Paradigm Cancer Diagnostic PCR Reacción en cadena de la polimerasa PD-1 Proteína de muerte programada 1 PD-L1 Ligando de muerte programada 1 PFS Supervivencia libre de progresión PIK3CA Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic su- bunit alpha PLD Pegylated liposomal doxorubicin PPA Porcentaje de acuerdo positivo PR Receptor de progesterona PTEN Phosphatase and tensin homolog INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 10 QT Quimioterapia RAF Rapidly accelerated fibrosarcoma kinase RAS Rat sarcoma viral oncogene homolog gene RECIST Response Evaluation Criteria in Solid Tumors RET Rearranged during transfection RNA Ácido ribonucleico ROS1 ROS proto-oncogene 1 RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction RTK Receptor de tirosina quinasa SEOM Sociedad Española de Oncología Médica SNC Sistema nervioso central SNP Polimorfismo de nucleótido simple o de único nucleótido SNS Sistema Nacional de Salud SNV Variantes de nucleótido único TAT Turnaround time TCGA The Cancer Genome Atlas TKI Inhibidor de tirosina quinasa TPS Tumor proportion score TMB Carga mutacional tumoral TNT Tiempo hasta el siguiente tratamiento TTF Tiempo hasta el fallo del tratamiento VAS Variant allele fraction VUS Variante de significado desconocido VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 11 Resumen Introducción El avance en las tecnologías de diagnóstico genómico y de la bioinformática ha permitido detectar numerosas alteraciones genómicas (GAs) relaciona- das con el inicio y progresión del cáncer y han contribuido a un cambio de paradigma en el tratamiento oncológico. La secuenciación de nueva genera- ción (NGS) es la base de las plataformas genómicas FoundationOne (F1) y FoundationOne CDx (F1CDx) con las que puede realizar un perfil genómi- co completo (CGP) con el fin de identificar las GAs diana frente a las cuales ejercerán su efecto los fármacos dirigidos. También permiten cuantificar al- gunos biomarcadores predictivos de respuesta al tratamiento como la carga mutacional tumoral (TMB) o la expresión de la proteína de muerte progra- mada 1 o su ligando (PD-1 y PD-L1, respectivamente). Objetivo El objetivo principal de este informe es valorar la validez diagnóstica, utili- dad clínica y seguridad de F1 o F1CDx como plataformas NGS para el diag- nóstico de alteraciones genómicas asociadas a tumores sólidos y su reco- mendación terapéutica. Como objetivos secundarios de este informe, se han realizado revisio- nes breves narrativas sobre las tecnologías diagnósticas de secuenciación y alternativas a F1 o F1CDx para el análisis genómico de los procesos oncoló- gicos, y sobre las principales alteraciones genómicas que caracterizan a los cinco tumores sólidos para los que F1CDx está aprobado por la FDA, que son el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), mama, colorrectal (CCR), ovario y melanoma, y sus correspondientes tratamientos. Metodología Se ha realizado una revisión sistemática de la literatura científica en Pub- Med, la Cochrane Library, Centre for Reviews and Dissemination y en los sitios web de centros relacionados con la Evaluación de Tecnologías Sanita- rias y ensayos clínicos. La búsqueda se limitó a estudios originales publica- dos a partir de 2012, que incluyeran un número mínimo de 10 pacientes con NSCLC, cáncer de mama, CCR, ovario o melanoma, en quienes se hubiera realizado el estudio de perfil genómico con F1/F1CDx. Las variables de resultados han sido las GAs detectadas, la TMB y ex- presión de PD-1 o PD-L1, los fármacos dirigidos o la inmunoterapia indica- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 12 da en cada caso, número de pacientes tratados, la respuesta tumoral al trata- miento, supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad, tiempo hasta la obtención del resultados de F1/F1CDx. Resultados La búsqueda de la literatura localizó 2.320 referencias de las bases de datos electrónicas y búsqueda manual. Se excluyeron 20 duplicadas y otras 2.242 se descartaron tras la lectura de título y abstract. Las restantes 58 referencias fueron recuperadas a texto completo para su lectura en profundidad, lo que llevó a excluir 23 artículos, quedando finalmente seleccionados 33 artículos originales, 1 artículo de revisión de la evidencia sobre F1 y otro de validación de F1. De los 33 artículos incluidos, 10 estudiaban F1/F1CDx en pacientes con NSCLC; 17 artículos, en pacientes con cáncer de mama; 1 artículo, en CCR; 3 publicaciones en melanoma y 2 en ovario. Tras la revisión de estos artículos se ha podido confirmar la capacidad de F1/F1CDx para detectar GAs en los cinco tipos de tumores estudiados. Además, de acuerdo a los datos informados por los autores, el 23% de pa- cientes con NSCLC recibió tratamiento tras disponer de los resultados de F1/F1CDx. Más del 68% de los pacientes presentaron respuesta objetiva (completa y parcial) y un 17,50%, enfermedad estable. F1/F1CDx parece ha- ber influido en la decisión terapéutica en un 19% de los pacientes. Sólo dos artículos evaluaron posibles eventos adversos relacionados con el trata- miento recomendado por F1/F1CDx. Hay que señalar la baja calidad metodológica de los artículos incluidos y una marcada infranotificación de resultados. Conclusiones F1/F1CDx tiene capacidad diagnóstica para identificar las GAs y las dianas terapéuticas en pacientes con cáncer, pero debido a la baja calidad de los estudios incluidos resulta necesario realizar nuevos estudios que permitan confirmar los resultados diagnósticos y de utilidad clínica de la prueba, ade- más de valorar tanto la potencial toxicidad asociada a las terapias recomen- dadas por la prueba como la toxicidad evitada al descartar el uso de fárma- cos no efectivos. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 13 Summary Introduction Advances in genomic diagnosis and bioinformatics technologies have allowed to identify numerous genomic alterations (GAs) related to the on- set and progression of cancer and have contributed to a paradigm change in oncological treatment. New generation sequencing (NGS) is the basis of the genomic platforms FoundationOne (F1) and FoundationOne CDx (F1CDx) that can perform a complete genomic profile (CGP) in order to identify the target GAs against which there are targeted drugs. These genomic platform also make it possible to quantify some biomarkers predictive of response to treatment such as tumor mutational load (TMB) or expression of the pro- tein of programmed death 1 or its ligand (PD-1 and PD-L1, respectively). Objective The main objective of this report is to assess the diagnostic validity, clinical utility and safety of F1 or F1CDx as NGS platforms for the diagnosis of ge- nomic alterations associated with solid tumors and their therapeutic recom- mendation. As secondary objectives of this report, brief narrative reviews have been carried out on diagnostic sequencing technologies and alternatives to F1 or F1CDx for the genomic analysis of oncological processes, and on the main genomic alterations characterizing the five solid tumours for which F1CDx is approved by the FDA, which are non-small-cell lung cancer (NS- CLC), breast cancer, colorectal cancer (CCR), ovarian cancer and melano- ma, and their corresponding treatments. Methodology A systematic review of the scientific literature has been conducted in Pub- Med, the Cochrane Library, Centre for Reviews and Dissemination and on the websites Health Technology Assessment Agencies and clinical trials. The search was limited to original studies published from 2012, including a mini- mum of 10 patients with NSCLC, breast cancer, CRC, ovary or melanoma, in whom the genomic profile study with F1/F1CDx had been performed. The variables of results have been the detected GAs, the TMB and ex- pression of PD-1 or PD-L1, the targeted drugs or immunotherapy indicated in each case, number of patients treated, tumor response to treatment, overall survival and disease-free survival, time until obtaining the results of F1/F1CDx. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 14 Results The literature search located 2,320 references from electronic databases and handsearched. Twenty duplicates were excluded and another 2,242 were dis- carded after reading the title and abstract. The remaining 58 references were retrieved to full text for in-depth reading, which led to the exclusion of 23 articles, leaving 33 original articles finally selected, 1 article reviewing the evidence on F1 and another F1 validation article. Of the 33 articles included, 10 studied F1/F1CDx in patients with NSCLC; 17 articles, in patients with breast cancer; 1 article, in CCR; 3 publications in melanoma and 2 in ovary. A review of these articles has confirmed the ability of F1/F1CDx to detect GAs in the five types of tumors studied. In addition, according to the data reported by the authors, 23% of patients with NSCLC received treat- ment after the results of F1/F1CDx were available. More than 68% of the patients presented objective response (complete and partial) and 17.50%, stable disease. F1/F1CDx seems to have influenced the therapeutic decision in 19% of patients. Only two articles evaluated possible adverse events rela- ted to the treatment recommended by F1/F1CDx. The low methodological quality of the included articles and a marked underreporting of results should be noted. Conclusions F1/F1CDx has the diagnostic capacity to identify GAs and therapeutic tar- gets in patients with cancer, but due to the low quality of the included stu- dies, it is necessary to carry out new studies to confirm the diagnostic results and the clinical usefulness of the test, as well as to evaluate both the poten- tial toxicity associated with the therapies recommended by the test and the toxicity avoided by ruling out the use of ineffective drugs. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 15 Algunos conceptos o definiciones A continuación se presentan algunos conceptos o definiciones en orden al- fabético. Adaptador: se trata de una secuencia corta de DNA que se añade a los ex- tremos de cada fragmento de DNA durante el proceso de preparación de las librerías. Estas secuencias son complementarias con la plataforma de se- cuenciación empleada. Alelo: cada una de las formas alternativas que puede tener un mismo gen localizado en una posición concreta (locus) de un cromosoma determinado, que se diferencian en su secuencia y que se pueden manifestar en modifica- ciones concretas de la función de ese gen. Alelo mutante: el que difiere del alelo estándar o salvaje, en la secuencia de referencia. Alteraciones genómicas intervenibles: aquellas mutaciones que tienen aso- ciada una terapia (que son dianas de fármacos dirigidos) o, en sentido más amplio, las que tienen asociada una medida preventiva. Alteraciones genómicas biológicamente relevantes: variantes que pueden tener significación funcional o que se han observado en la literatura médica asociadas a una anomalía clínica, aunque no estén asociadas a una terapia específica. Alteraciones genómicas clínicamente relevantes (CRGAs, clinically relevant genomic alterations): en el contexto del cáncer somático, se definen como aquellas GAs que son diana de fármacos antitumorales dirigidos, bien sean fármacos aprobados para un tumor concreto por las autoridades competen- tes y comercializados, o aprobados para otro tumor diferente, o para uso en ensayos clínicos. Amplicón: es una copia sintética de una secuencia de DNA o RNA que re- sulta de la amplificación de una secuencia de interés. Durante la amplifica- ción, se produce un incremento exponencial del número de copias, a partir de un fragmento de DNA o RNA. Amplificación: producción de múltiples copias de DNA o de una secuencia. Amplitud de Cobertura: (o cobertura “horizontal”) cantidad o porcentaje de secuencia de un gen (o de un conjunto de genes o del exoma completo) que está representado en la región de captura (región a analizar). Base calling: es el proceso de asignación de bases a cada señal detectada durante una reacción de secuenciación. Cada secuenciador tiene integrado un software específico con el que se realiza este proceso. Carga mutacional tumoral (TMB): número total de mutaciones somáticas identificadas por megabase en una región concreta del genoma tumoral. Los tumores con alta TMB se asocian a mejor respuesta a la inmunoterapia. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 16 Cobertura vertical: es la profundidad de lectura. Se mide en nº de lecturas para una región de secuencia dada. Es importante establecer un porcentaje mínimo de cobertura y, si no se alcanza, descartar la muestra y tomar una nueva para dar un diagnóstico fiable. Cromosoma: cada paquete ordenado de DNA que se encuentra en el núcleo de la célula y se hace visible como estructura durante mitosis celular. En los humanos hay 23 pares de cromosomas (22 pares autosómicos y un par de cromosomas sexuales, X e Y) que se encuentran en el núcleo celular, así como un pequeño cromosoma que se encuentra en las mitocondrias de la célula. Cada conjunto de 23 cromosomas contiene aproximadamente 3,1 mil millones de bases de la secuencia de DNA. Deleción: tipo de alteración genética que consiste en la pérdida de un frag- mento de DNA dentro de un cromosoma o gen. DNA: polímero que almacena y transmite información del código genético en los seres vivos. Consta de una doble hélice. Cada cadena tiene una parte central formada por azúcares (desoxirribosa) y grupos fosfato. Unido a cada azúcar hay una de las siguientes bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G), y timina (T). Las dos cadenas se mantienen unidas por enlaces entre las bases; la A se enlaza con la T, y la C con la G. DNA mitocondrial: es un pequeño cromosoma circular que se encuentra dentro de la mitocondria. Sólo tiene unos 16.569 pares de bases y 37 genes. Codifica diferentes proteínas y RNAs que son específicas de la mitocondria. El DNA mitocondrial se hereda sólo de la madre mientras que el DNA nu- clear se hereda de ambos progenitores. Ensayos cesta (basket trials): incluyen pacientes con tumores de diferentes tipos histológicos, seleccionados por tener la misma mutación diana y que pueden ser tratados con el mismo fármaco. Estudian el efecto de uno o más fármacos sobre una misma mutación en diferentes tipos de tumores. Se asig- nan los pacientes a un tratamiento concreto dependiendo de las GAs identi- ficadas, independientemente del tipo de tumor que tengan. Una ventaja de estos ensayos es que pueden estudiarse tumores raros que, de otra manera no se podrían incluir en ensayos controlados y aleatorizados. Estos ensayos pueden incluir un fármaco y varios tipos de tumor; 1 fármaco y una GA en varios tipos de tumor; o 1 fármaco con varias GAs y varios tipos de tumor. Un ejemplo de ensayo cesta es el NCI-MATCH que incluyó pacientes con linfomas, mielomas y varios tumores sólidos avanzados y refractarios al trata- miento para comparar la terapia dirigida frente al tratamiento convencional. Ensayo clínico pivotal: aquel ensayo que ha conducido a la aprobación de un medicamento por la agencia reguladora y es la base de la ficha técnica. Ensayos paraguas (umbrella trials): están diseñados para estudiar el impac- to de diferentes fármacos sobre diferentes mutaciones en un mismo tipo de VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 17 cáncer, basándose en el perfil molecular. Por ejemplo, el ensayo BATTLE en pacientes con NSCLC; los tumores son biopsiados y se analizan diversos marcadores como EGFR, ALK, ROS1, etc; después, los pacientes son alea- torizados para recibir un tratamiento dirigido concreto o un tratamiento convencional. Exones: regiones codificantes, es decir, aquellas porciones de un gen que contienen la información para codificar aminoácidos. Las que pueden expre- sarse y dar lugar a proteínas. Gen: es la unidad física básica de la herencia. Los genes están dispuestos, uno tras otro, en estructuras llamadas cromosomas. Los seres humanos tie- nen aproximadamente 22.000 genes organizados en sus cromosomas. Gen de fusión: está formado por la unión de partes de dos genes diferentes. Los genes de fusión se producen cuando parte del DNA de un cromosoma pasa a otro cromosoma o región del genoma. Estos genes, y las proteínas de fusión (quiméricas) que codifican, se han visto implicados en el origen de algunos tipos de cáncer como sarcoma de partes blandas, cáncer de próstata, mama, pulmón, vejiga, CCR y del SNC. Por ejemplo, el gen y la proteína de fusión BCR-ABL (citogenéticamente, cromosoma Ph) se relacionan con ciertos tipos de leucemia. Genoma: es el conjunto completo de instrucciones genéticas de un organis- mo, es decir, todo su DNA, tanto el DNA cromosómico como el DNA mito- condrial. Hibridación: proceso por el cual se combinan dos cadenas complementarias simples de ácidos nucleicos (DNA o RNA) y se permite que forme una única molécula de doble cadena por apareamiento de sus bases. Y el proceso inverso, una doble cadena de moléculas de DNA (o RNA o DNA/RNA) puede ser ca- lentada para romper el apareamiento de las bases y separar las dos hebras. Hibridación fluorescente in situ (FISH): técnica de laboratorio para detectar y localizar una secuencia específica de DNA en un cromosoma. La técnica se basa en exponer los cromosomas a una pequeña secuencia de DNA llamado sonda que tiene una molécula fluorescente unida a ella. La secuencia de la sonda se une a su secuencia homóloga correspondiente en el cromosoma. Es una técnica rápida, que no necesita cultivo celular. Permite detectar aneu- ploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones o traslocaciones, pero no pequeñas deleciones o inserciones, o mutaciones puntuales, en general. Indel: acrónimo que indica un tipo de alteración genética de tamaño gene- ralmente pequeño (menores de 1 kb) y que consiste en una inserción o una deleción. Índice: 6-8 pb del adaptador que se utilizan como código de barras identifi- cativo de la muestra. Inestabilidad de microsatélites (MSI): es una condición de hipermutabilidad genética que viene ocasionada por un fallo en el sistema de reparación del INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 18 DNA (MMR, mismatch repair). Una alta MSI se correlaciona con un incre- mento en la carga de neoantígenos, que se asocia a mayor probabilidad de respuesta a la inmunoterapia. Inserción: tipo de alteración genética que consiste en la incorporación de un fragmento de DNA dentro de un cromosoma, procedente de otra región del genoma Intrón: región no codificante de un gen que se encuentra entre 2 exones. Lectura (Read): en la secuenciación de ADN, una lectura es una secuencia inferida de pares de bases (o probabilidades de pares de bases) correspon- dientes a todo o parte de un solo fragmento de ADN. Por extensión, la lec- tura es la secuencia corta que se obtiene, durante la secuenciación por NGS. Librería: es el conjunto de fragmentos (millones de moléculas) de DNA que se obtiene de una muestra a secuenciar, de un determinado tamaño, que en sus extremos contiene los índices y los adaptadores. Ligando 1 de muerte programada (PD-L1): se trata de una proteína inmu- nológica de punto de control que media la supresión inducida del tumor a través de la downregulation de células T. La expresión del PD-L1 puede con- siderarse un biomarcador predictivo de respuesta a la inmunoterapia. Longitud de lectura: se mide en pares de bases (pb). Microsatélites: son pequeñas secuencias de DNA de entre 2 a 5 pares de bases que se repiten en tándem un número variable de veces, generalmente entre 10 y 60 veces. Se encuentran distribuidos a lo largo del genoma, gene- ralmente en las regiones no codificadoras. Durante la replicación del DNA, los microsatélites tienen tendencia a sufrir errores en el emparejamiento o apareamiento de bases que de manera habitual se van reparando mediante un sistema especifico de MMR. Pero si el nuevo sistema de MMR se altera, se produce un estado de hipermutabilidad genética cuyo resultado es la ines- tabilidad de los microsatélites (MSI). Se ha descrito una relación entre nive- les altos de MSI (MSI-H) y una buena respuesta a la inmunoterapia. Mismatch: se refiere a la discrepancia de secuencias entre las lecturas y el genoma de referencia. Se detecta después de haber alineado la secuencia de la muestra que se está analizando frente al genoma de referencia. Mismatch repair (MMR): es un sistema para reconocer y reparar la inser- ción, eliminación o incorporación erróneas de bases que pueden surgir du- rante la replicación y recombinación del DNA. Mutación: se define como cualquier cambio permanente en la secuencia del genoma. Las mutaciones varían en tamaño; pueden presentarse en cualquier lugar, y afectar desde un solo par de bases hasta un gran segmento de un cro- mosoma que incluye múltiples genes. Pueden ser de distintos tipos, incluyendo también deleciones, inserciones, amplificaciones o translocaciones. Las muta- ciones pueden ser el resultado de errores en la copia del DNA durante la divi- sión celular, la exposición a radiaciones ionizantes o a sustancias químicas VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 19 denominadas mutágenos, o infección por virus, de forma que puede aumentar el riesgo de padecer cáncer o defectos congénitos. Las mutaciones de la línea germinal están presentes en los gametos (óvulos o espermatozoides) y pueden transmitirse a la descendencia, mientras que las mutaciones somáticas se pro- ducen en algunas células del cuerpo y no se transmiten a los hijos. NGS: Secuenciación masiva o de nueva generación, durante la cual millones de fragmentos de DNA a partir de una sola muestra se secuencian al simul- táneamente. Nucleótido: es la unidad básica de los ácidos nucleicos. El RNA y el DNA son polímeros formados por largas cadenas de nucleótidos. Cada nucleótido está formado por un grupo fosfato y un azúcar (que es la parte fija) y por una base nitrogenada (que diferencia cada tipo de nucleótido). El azúcar puede ser desoxirribosa en el DNA y ribosa en el RNA. Las bases nitrogenadas son adenina (A), guanina (G), timina (T) o citosina (C) en DNA; y adenina (A), guanina (G), uracilo (U) o citosina (C) en RNA. Por lo tanto, habrá cuatro tipos de nucleótidos. OMIM (http://www.omim.org): es una base de datos de genes y enfermeda- des humanas. También contiene una muestra representativa de las variantes genéticas asociadas con las enfermedades. Oncogén: gen anormal o activado que procede de la mutación de un alelo de un gen normal llamado protooncogén. Es decir, es un gen que ha mutado y contribuye al desarrollo de un cáncer. En su estado normal, no mutado, los oncogenes son llamados proto-oncogenes. Polimorfismo o Variante de nucleótido único o de un solo nucleótido (SNP/ SNV, single nucleotide polymorphism): es una variación en la secuencia de DNA que afecta a una sola base o nucleótido que ocurre en una posición concreta del genoma y es el polimorfismo más común. Está presente en más del 1% de la población (frecuencia alélica >1%), si no se llega al 1% no se considera SNP y sí una mutación puntual. La mayoría de los SNP /SNVs no tienen mucho significado, porque están en una parte del genoma que no tiene una función crítica. Sin embargo, algunos de ellos confieren un riesgo (generalmente poligénico o aditivo) para una enfermedad, por ejemplo, dia- betes o enfermedades cardiacas. Otros SNP/SNVs en el genoma humano se correlacionan con la respuesta a determinados fármacos y con otros fenoti- pos. Profundidad de cobertura (Depth of coverage o coverage): número de veces que cada base del genoma está presente en los reads (lecturas) de secuencia- ción producidos. Es un factor muy importante para determinar la fiabilidad del nucleótido asignado a esa posición del genoma, especialmente importan- tes cuando se cuantifican las deleciones y duplicaciones. A mayor profundidad de cobertura, mayor capacidad para detectar las GA y mayor confianza en la identificación de la variante. Pero una mayor INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 20 cobertura supone un mayor coste, por eso es necesario un equilibrio entre ambos elementos. Proto-oncogenes: desempeñan un papel importante en el control de la divi- sión celular y la muerte celular durante nuestro crecimiento y desarrollo. Sin embargo, si un proto-oncogén muta, o si la célula hace copias adicionales de ese proto-oncogén, podrán activarse y producir una división celular descon- trolada. De esta manera un proto-oncogén contribuye al desarrollo de una célula de cáncer partiendo de una célula normal. Una vez que un proto-on- cogén es activado por una mutación, se le denomina oncogén. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de DNA, es decir, para crear un gran número de copias de un fragmento concreto de DNA. El método utiliza se- cuencias cortas de DNA llamados cebadores para seleccionar la parte del genoma a amplificar. Se trata de un proceso enzimático en el que la tempe- ratura de la muestra se sube y se baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicación del DNA a duplicar la secuencia del DNA que está siendo copiada. Con esta técnica se pueden producir un billón de copias de la se- cuencia en estudio en sólo unas pocas horas. La amplificación del DNA nos permite estudiar la molécula del DNA en detalle en el laboratorio. Utiliza ciclos repetidos, cada uno de los cuales consiste en tres fases: 1) desnaturalizacion o separación de las dos hebras de DNA; 2) hibridación del cebador, o unión a su secuencia complementaria, en el DNA molde; 3) elon- gación, la polimerasa, tomando el DNA molde, sintetiza la cadena comple- mentaria. Reordenamiento (Rearrangement): Alteración estructural de un cromoso- ma que implica normalmente la rotura y/o la reunión de un segmento de material cromosómico, que da lugar a una configuración anormal. Los 4 ti- pos de reordenamientos básicos son: deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones. Secuenciación: Determinación del orden exacto de los pares de bases de una región específica de DNA. Time to next therapy (TNT): se define como el tiempo transcurrido desde la fecha de inicio del primer tratamiento recibido hasta la fecha de inicio del segundo tratamiento. El TNT se utiliza como marcador subrogado de la PFS, porque generalmente está infranotificada la información sobre progresión de la enfermedad. Translocación: es un tipo de reordenamiento en el que un cromosoma se rompe y una parte de él se vuelve a unir a otro cromosoma diferente. Pueden ser translocaciones equilibradas (no se produce ni aumento ni pérdida de material cromosómico) o desequilibradas (sí se produce aumento o pérdida de material cromosómico; el efecto será variable dependiendo de los seg- mentos cromosómicos implicados). VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 21 Utilidad clínica de una prueba diagnóstica: es la relevancia y utilidad de una intervención (en este caso una prueba diagnóstica) para la mejora de la atención clínica de un paciente. Se refiere al balance entre los beneficios y los riesgos asociados a la prueba e indica si su uso va a proporcionar una mejora en los resultados en salud del paciente y si va a implicar cambios en la práctica clínica. Validez diagnóstica de una prueba: es la capacidad de una prueba para iden- tificar de forma precisa y fiable a los pacientes. Se suele presentar en térmi- nos de sensibilidad, especificidad y exactitud diagnóstica. Variaciones de un solo nucleótido (SNV, single nucleotide variant) o susti- tuciones: son el tipo más frecuente de variaciones en el genoma. La mayoría de ellas son polimórficas en la población, pero no todas las SNVs son poli- morfismos. Variantes de significado incierto (VUS): aquellas variantes cuyo efecto fun- cional no está claro y/o que no están identificadas en la literatura. Whole Genome Sequencing (WGS) - secuenciación del genoma completo: determinación de la secuencia del genoma completo de un organismo inclu- yendo, además del DNA cromosómico, el DNA mitocondrial. Whole Exome Sequencing (WES) - secuenciación del exoma: determina- ción de la secuencia del exoma, es decir, sólo la parte codificante del DNA genómico. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 22 Introducción El avance en las tecnologías de diagnóstico genético unido al gran desarrollo de la bioinformática ha llevado a un mayor conocimiento sobre el origen y la progresión de la mayoría de los tumores malignos, entre otras enfermeda- des. Se acepta que es la acumulación de diversas alteraciones genómicas (GAs) lo que subyace en los procesos cancerígenos1. En el estudio de dichas GAs se han ido empleando diversas pruebas diagnósticas cuya evolución tecnológica ha resultado fundamental para pro- fundizar en la biología molecular del cáncer. Hoy día se conocen muchas GAs que desencadenan la transformación de células sanas en células malig- nas, y otras GAs que estimulan la proliferación celular e inhiben su apopto- sis. En las células cancerígenas se reconoce la presencia de multitud de GAs y de alteraciones epigenéticas aunque parece que de todas ellas sólo una o un número muy pequeño de GAs serían las alteraciones críticas que habrían desencadenado el inicio y crecimiento del tumor. La identificación de estas GAs, conocidas como alteraciones drivers o conductoras, ha contribuido a una nueva forma de clasificar y caracterizar a los tumores malignos. Pero, además, gracias a la identificación de esas GAs, se ha producido un cambio de paradigma en el tratamiento del cáncer, pasando de terapias sistémicas basadas en el tipo de tumor, en sus características histopatológicas y locali- zación, a un tratamiento dirigido frente a dichas GAs, que constituye la base de la denominada medicina de precisión o medicina personalizada. Con la medicina de precisión y el desarrollo de la denominada terapia dirigida y la inmunoterapia, entre otras terapias, se ha modificado sustancialmente el tra- tamiento de los pacientes oncológicos, buscando una mejoría en los paráme- tros de calidad de vida, en el control sintomático y funcional, además de re- trasar el tiempo hasta el deterioro clínico del paciente. Se estima que un 30% de los pacientes tratados podrían obtener algún beneficio clínico en forma de incremento de la supervivencia o mejor calidad de vida2. La marcada evolución de las pruebas diagnósticas en el campo de la ge- nómica ha permitido pasar del estudio de la expresión proteica o del análisis de un único gen a disponer de paneles amplios de genes que son analizados simultáneamente en un único test mediante la tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS). El uso de las NGS ha sido clave en este cambio en la concepción y el tratamiento de los tumores malignos3. La NGS ha permitido la secuenciación masiva y en paralelo del genoma, contribuyendo a la implan- tación de la medicina personalizada en el ámbito de la práctica clínica, aunque en España todavía son pocos los hospitales que cuentan con esta tecnología. Con las NGS se detectan las GAs presentes en cada tumor y se deter- minará si para cada una de ellas existe un tratamiento dirigido específico, ya VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 23 aprobado por las autoridades competentes de cada país o bien fármacos que estén siendo utilizando en el contexto de ensayos clínicos a los que se pue- dan incorporar los pacientes. Por ello, en los últimos años se ha producido en paralelo el desarrollo de las pruebas para detectar las GAs asociadas al cáncer y el desarrollo de los fármacos frente a dichas GAs. En este contexto surgieron los “compa- nion diagnostics” (CDx) que son dispositivos médicos, tanto de diagnóstico in vitro como herramientas de imagen, que ayudan a los profesionales en la toma de decisiones terapéuticas sobre el fármaco más adecuado para cada paciente en concreto, lo que convierte a estas CDx en herramientas esencia- les para la seguridad y efectividad en el uso de los fármacos. Entre estas plataformas de genes de NGS se incluyen FoundationOne® LDT (laboratory developed test) (F1) y FoundationOne CDx® (F1CDx). Foundation Medicine, Inc. (Cambridge, MA, EEUU) lanzó al mercado en 2012 el test F1, que en 2014 recibió el marcado CE para diagnóstico de GAs en tumores sólidos pero no llegó a ser aprobado por la FDA (Food and Drug Administration). En 2017, F1CDx fue aprobado por la FDA4 y tiene cobertu- ra nacional para pacientes de Medicare y para todos los tumores sólidos. Desde primeros de noviembre de 2018, F1CDx ha reemplazado a F1. F1CDx también tiene marcado CE. F1CDx se presenta como una plataforma integral de diagnóstico y para el tratamiento personalizado de tumores sólidos malignos. F1CDx permite estudiar el perfil genómico completo (CGP, comprehensive genomic profile) con el que se determinan las GAs concretas presentes en los tumores sólidos. Inicialmente, F1 se utilizaba en casos avanzados, recidivantes o refractarios al tratamiento convencional cuando se habían agotado las opciones terapéu- ticas, pero el número de terapias dirigidas aprobadas como primera línea terapéutica ha experimentado un progresivo aumento, por lo que cada vez se hace más necesario disponer de la información genómica del tumor desde el momento del diagnóstico inicial. F1CDx está destinado, por tanto, para ser solicitado por los clínicos como herramienta diagnóstica y de apoyo a la toma de decisiones terapéuticas, referidas a la selección de los fármacos más específicos para cada tumor en función del perfil genómico detectado, y de acuerdo a las recomendaciones de las guías de práctica clínica oncológicas. Las NGS se han ido utilizando en la práctica clínica como un método eficiente, rápido y preciso para identificar GAs que puedan ser dianas tera- péuticas o intervenibles, lo que está contribuyendo al desarrollo de nuevos fármacos5. Por tanto, la información de las NGS contribuye de forma clara a la toma de decisiones clínicas en cuanto a prevención, detección temprana, diagnóstico y tratamiento de pacientes oncológicos. Esto unido al mayor co- nocimiento de los defectos moleculares específicos de cada tumor, ha sido determinante para pasar de una oncología basada en la histología a la onco- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 24 logía de precisión, aplicando un tratamiento personalizado con fármacos di- rigidos contra los defectos moleculares concretos encontrados de cada tumor. Además de estudiar las GAs del proceso tumoral, las NGS estarían indicadas para la monitorización de la respuesta tumoral y la evolución de la enfermedad. El perfil genómico tumoral tiene también un valor pronóstico y predictivo, este último por su capacidad de detección de biomarcadores de respuesta a la inmunoterapia además de ofrecer información sobre posibles resistencias a determinados tratamientos de manera individualizada6. No obstante, hasta la fecha, no está claro el papel en la práctica clínica de estas tecnologías NGS para el estudio del perfil genómico. La decisión sobre si estas nuevas pruebas deben incorporarse al sistema sanitario y a la práctica clínica debería basarse en evidencia científica que demuestren su validez analítica, validez diagnóstica y su utilidad clínica para los pacientes en quienes se utilicen, y esto se debe establecer para cada laboratorio7-9. Va- lidez analítica en el sentido de estudiar su fiabilidad, sensibilidad y/o especi- ficidad, es decir, la capacidad del test para hacer una medición exacta y fiable de los biomarcadores. Tambien debe quedar claro si el uso de cada una de las NGS, en concreto, permite excluir o confirmar un diagnóstico. Asi, se debe medir su validez clínica, o la capacidad del test para identificar de forma exacta y fiable o predecir un resultado clínico relevante. Y por último su utilidad clínica, para evaluar si las decisiones terapéuticas basadas en los resultados del test genómico han llevado a una mejoría en los resultados en salud. Para cada una de estas plataformas genómica habría que determinar su valor pronóstico (riesgo de recurrencia) como predictivo (potencial bene- ficio del tratamiento). También se hace necesario estudiar la seguridad de estas NGS así como la repercusión económica, y establecer protocolos de utilización de estas plataformas genómicas en la rutina asistencial. La Orden SSI/2065/2014, de 31 de octubre, por la que se modifican los anexos I, II y III del Real Decreto 1030/2006, de 15 de septiembre, por el que se establece la cartera de servicios comunes del Sistema Nacional de Salud y el procedimiento para su actualización, regula la cartera común de genética detallando los tipos de análisis genéticos que forman parte de la misma se- ñalando que las pruebas que se faciliten han de estar respaldadas por la evidencia científica y ser de utilidad clínica. Este informe surge a petición de la Comisión de prestaciones, asegura- miento y financiación en el proceso de identificación y priorización de nece- sidades de evaluación que se lleva a cabo para conformar el Plan de Trabajo Anual de la Red Española de Agencias de Evaluación de Tecnologías Sani- tarias y prestaciones del SNS. En este contexto, se encargó a la AETS-ISCIII la elaboración de un informe sobre la efectividad diagnóstica y clínica y so- bre la seguridad de F1/F1CDx para el estudio genómico de tumores malig- nos sólidos. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 25 La tecnología: FoundationOne® y FoundationOne CDx® F1CDx es un dispositivo de diagnóstico in vitro que analiza el perfil genómi- co mediante la técnica de NGS del DNA tumoral. Mediante captura híbrida estudia los exones de 309 genes relacionados con tumores, una región pro- motora, una no-codificante (ncRNA) y regiones intrónicas seleccionadas de 34 genes frecuentemente reordenados, 21 de los cuales también incluyen los exones codificantes10. Por tanto, este test detecta GAs incluidas en un total de 324 genes. Los genes estudiados por F1CDx se presentan en el anexo I. A diferencia de F1CDx, el test anterior F1 permitía estudiar las regiones codi- ficantes de 315 genes relacionados con el cáncer y los intrones de 28 genes que frecuentemente presentan reordenamientos. El método NGS permite la detección e identificación, de forma simultá- nea y en un único análisis, de las siguientes alteraciones genómicas: sustitucio- nes de bases, inserciones y deleciones (indels), alteraciones en el número de copias (CNAs) del DNA y algunos reordenamientos genómicos (por ejemplo, fusiones de genes). F1CDx identifica GAs tanto somáticas (adquiridas) como de la línea germinal (hereditarias) pero no diferencia entre unas y otras. A finales de 2013, Frampton y cols11 publicaron un artículo sobre el proceso de validación de F1 como test para el estudio del perfil genómico de tumores. F1 interrogaba (captura basada en la hibridación) 4.557 exones de 287 genes relacionados con el cáncer y 47 intrones de 19 genes que con fre- cuencia sufren reordenamientos en tumores sólidos. Se estudiaron sustitu- ciones de bases, indels, amplificaciones focales de genes, deleciones de genes homocigóticos y fusiones de genes, en 2.221 muestras tumorales fijadas en formalina y embebidas en bloque de parafina (FFIP/FFPE, formalin-fixed/ paraffin-embedded) de pacientes, no en muestras especiales para investiga- ción. Estas muestras se analizaron en un laboratorio con certificado CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) y acreditación CAP (Co- llege of American Pathologists). Se extrajo una cantidad de 50-200 ng de DNA de muestras FFPE de biopsia o quirúrgicas. Se utilizó el secuenciador Illumina HiSeq2000. En general, el rendimiento global de F1 fue alto. Ver figura 1. La sensibilidad para detección de sustituciones de bases fue >99%, 98% para detección de indels y >95% para CNAs. El valor predictivo positi- vo para todas las GAs fue >99%. Debido a la heterogeneidad tumoral, al escaso contenido tumoral en las muestras tisulares y a que estas muestras suelen ser de pequeño tamaño, es un requisito imprescindible que el test sea capaz de detectar de forma sensible y específica aquellas GAs poco frecuentes. F1 ha sido validado para detectar sustituciones de bases a una frecuencia del alelo mutante (MAF) de ≥10% con una sensibilidad ≥99% (IC 95%: 99,6-100%); para detectar pe- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 26 queñas inserciones y deleciones a una MAF ≥20% con una sensibilidad/ exactitud diagnóstica >97%; para detectar las alteraciones en el número de copias (deleciones homocigóticas vs genes altamente amplificados) con una sensibilidad/exactitud diagnóstica >95%; y para reordenamientos, >97%. Figura 1. Validez analítica de F1. Tomado de Foundation Medicine. Adaptado de Frampton y cols11, 2013. Los autores encontraron una concordancia >95% entre los resultados obtenidos con F1 y los de otras pruebas diagnósticas como espectrometría de masas, FISH (hibridación in situ por fluorescencia) e IHC (análisis inmu- nohistoquímico) en un núvmero elevado de muestras FFPE y analizaron la reproducibilidad de F1 observando la consistencia de resultados de las muestras procesadas de forma independiente. En global, F1 fue capaz de detectar el 95,1% de más de 2.200 casos clínicos consecutivos e identificó más alteraciones intervenibles (en 75% de pacientes) que las otras pruebas diagnósticas de rutina y en especial cuando la muestra de tejido disponible era escasa. Los autores destacaron la detección de un número muy elevado de al- teraciones diferentes, hasta 1.579 distintas. Y recalcaron el interés de este hallazgo poniendo el ejemplo del ERBB2: en la práctica clínica, su amplifi- cación o sobreexpresión suele considerarse como diana terapéutica en cán- cer de mama y cáncer gastroesofágico, pero en este trabajo se constató en otros 12 tipos más de tumores sólidos. Además, hasta un 40% de las altera- ciones en el ERBB2 fueron mutaciones puntuales o indels y no amplificacio- nes, por lo que con otros test diagnósticos utilizados en clínica no se hubie- ran podido detectar. Además de la identificación de las GAs en determinados genes, F1CDx analiza ciertas características genómicas como son la inestabi- lidad de microsatélites (MSI) y la carga mutacional tumoral (TMB)12,13, am- bos biomarcadores que pueden ayudar a estimar la respuesta a la inmunote- rapia y, por tanto, informar las decisiones sobre su uso. La TMB viene VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 27 definida por F1CDx como el número total de todas las variantes sinónimas y no-sinónimas presentes a una frecuencia alélica ≥5% y se expresa en uni- dades de mutaciones por megabase (mut/Mb) en el genoma tumoral exami- nado10. TMB se puede determinar, también, mediante secuenciación del geno- ma completo y del exoma pero estos procedimientos son más complejos y difíciles de trasladar a la práctica clínica. En cambio, la determinación me- diante secuenciación de paneles de genes, como es el caso de F1 y F1CDx, es más rápida y sencilla. Con el fin de respaldar el uso de los datos retrospectivos generados por F1, Foundation Medicine desarrolló un estudio de concordancia entre F1C- Dx y F1 LDT14. En el estudio se analizaron 165 muestras y se determinó el grado de acuerdo positivo (PPA) y negativo (NPA) para los tipos de GAs, considerando F1 como método de referencia. Se incluyeron, en total, 2.325 variantes: 2.026 mutaciones, 266 CNAs y 33 reordenamientos. Los resultados del PPA y NPA fueron muy elevados, especialmente, este último. Para todas las variantes, el PPA entre F1CDx y F1 LDT fue del 98,6% y el NPA, del 99,99%. Ver Tabla 1. Tabla 1. concordancia entre f1cdx y f1 Ldt. ppa npa Todas las variantes 98,6% 99,99% Variantes cortas 99,1% 99,99% Sustituciones 99,4% 99,99% Indels 97,0% 99,99% Todas las CNAs 94,3% 99,90% Amplificaciones 94,0% 99,90% Deleciones 94,8% 99,80% Reordenamientos 100,00% 99,98% PPA: porcentaje de acuerdo positivo, NPA: porcentaje de acuerdo negativo, CNAs: alteraciones en el número de copias. También se encontró una elevada concordancia entre F1CDx y F1 LDT en la determinación del MSI, con un PPA del 100% (IC 95%: 47,80- 100%), NPA del 99,5% (IC 95%: 96,60-99,98%) y un porcentaje de acuerdo global del 99,4% (IC 95%: 96,70-99,98%). En cuanto a la concordancia en los resultados de TMB, en el análisis de regresión lineal utilizando la TMB de F1 LDT como predictora y TMB de F1CDx como resultado, el intercepto fue de -0,27782 (IC 95%: -0,662-0,106) y la pendiente de 0,94064 (IC 95%: 0,919-9,963). F1CDx ha sido validado clínica y analíticamente para tumores sólidos, utilizando DNA de una gran cantidad de muestras FFPE de diferentes teji- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 28 dos, con unas 2.100 muestras clínicas y 4.200 muestras analíticas. Es decir, que se han empleado casi 9 veces más muestras que en la validación de F1. Se analizó un amplio rango de GAs y en multitud de genes. También se con- firmó que el rendimiento diagnóstico de F1CDx era similar independiente- mente del tipo de tejido estudiado; su precisión en cuanto a repetibilidad y reproducibilidad fueron altas, siendo ésta superior al 99% para detección de todas las GAs y del 100% para determinación de MSI. Para estudiar la vali- dez y concordancia clínica, se comparó F1CDx con otros CDx aprobados por la FDA para estudiar las mismas GAs para las que está aprobado F1C- Dx, encontrando elevados grados de acuerdo PPA y NPA. De 157 genes es- tudiados mediante F1CDx y otros tests, el PPA alcanzó un porcentaje del 94,6% (IC 95%: 93,3%-95,8%) y un porcentaje de NPA del 99,9% (IC 95%: 99,9%-99,9%). Ver figura 2. Figura 2. Estudios clínicos de concordancia entre F1CDx y otros tests. Cobas® es una marca registrada de Roche Diagnostics Operations, Inc. Therascreen® es una marca registrada de Qiagen. PharmDx® es una marca registrada de Dako Denmark A/S. El análisis del DNA en F1CDx implica varias etapas: recogida y prepa- ración de las muestras de tejido tumoral, la extracción del DNA, la construc- ción de librerías, la captura híbrida, la secuenciación, el análisis de los datos secuenciados y, finalmente, la generación del informe. F1CDx utiliza mues- tras tisulares obtenidas mediante biopsia core, biopsia excisional o resección quirúrgica. El test se realiza en el DNA aislado de muestras de tejido FFPE, en laboratorios con certificado CLIA y acreditado por el CAP. Se consideran muestras adecuadas si cumplen estos criterios: • de tamaño de la muestra: se pueden almacenar bien como un bloque más un corte teñido con hematoxilina-eosina (H&E) para determi- nar el porcentaje tumoral y para confirmar el diagnóstico histológi- co, o bien como 10 cortes o láminas sin teñir de 4-5 µm de grosor, más 1 corte H&E. Es necesario disponer de ≥40-50 ng de DNA por muestra. • área de superficie: si se envían los cortes, estos deben tener un míni- mo de 25 mm2 de superficie (cortes de 5 x 5 mm) o que alcancen un volumen tisular de al menos 1 mm3. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 29 • contenido nuclear tumoral o porcentaje núcleos tumorales es el nú- mero de células tumorales dividido por el número total de todas las células con núcleo. Cuando se quieren determinar variaciones en el número de copias el porcentaje mínimo de núcleos tumorales debe- ría ser de un 20% (los núcleos tumorales deberían ser al menos un 20% del total de núcleos presentes en la muestra) aunque lo óptimo sería un 30%. También podría considerarse adecuado si el porcenta- je de células nucleadas es ≥80% o si hay ≥30.000 células tumorales. Cuando la muestra está contaminada por células no tumorales o si el nivel de necrosis es muy elevado, se puede afectar la sensibilidad del test. El proceso de secuenciación incluye los siguientes pasos. Se comienza realizando el procesamiento de las muestras para extracción del DNA. El DNA se extrae de muestras sin teñir. Se cuantifica, fragmenta y purifica este DNA. Es importante analizar la calidad de la muestra y valorar la fragmen- tación del tejido y la concentración de DNA para valorar si la muestra es adecuada. Después, se construyen las librerías; a continuación, se procede a la captura por hibridación de los exones relacionados con el cáncer y de los intrones implicados en los reordenamientos asociados al cáncer y después se realiza la secuenciación. F1CDx utiliza la plataforma Illumina® HiSeq 4000 para realizar la secuenciación a gran profundidad y uniforme (cobertura me- diana >500x con >99% de exones a una cobertura >100x)10. Esto permite una alta especificidad y sensibilidad del método NGS para detectar las alter- aciones incluso a frecuencias bajas. Es importante que se pueda llevar a cabo con una cantidad de células tumorales baja. F1 LDT utilizaba el secuen- ciador Illumina HiSeq2000 o Illumina HiSeq2500 (San Diego, CA). Una vez finalizada la secuenciación, se procede al análisis bioinformá- tico utilizando un software propietario de Foundation Medicine Inc. Los da- tos secuenciados son mapeados con el genoma humano y, mediante algorit- mos computacionales, se buscan las variantes presentes en las muestras. Para cada tipo de GA se utilizan unos algoritmos diferentes de análisis informáti- co. Las lecturas se comparan con bases de datos de variantes detectadas en la población sana (los polimorfismos) y de variantes patológicas conocidas, por ejemplo, la base de datos COSMIC15-17 o ClinVar (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/clinvar) o la del proyecto The Cancer Genome Atlas (TCGA). Otra base de datos es FoundationCoreTM, de Foundation Medicine, con multitud de resultados de perfiles genómicos de más de 150 subtipos de tumores y datos clínicos y de respuesta al tratamiento. Finalmente, los resultados de F1CDx se recogen y presentan en un in- forme donde se identifican los genes alterados, el número y tipo de GAs detectadas, las alteraciones clínicamente relevantes (CRGAs, clinically rele- vant genomic alterations) y las terapias disponibles recomendadas en fun- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 30 ción del perfil genómico, tanto terapias aprobadas por las autoridades com- petentes y comercializadas para un tumor dado o para otro tumor, como las de uso en ensayos clínicos11,18. También se incluyen otras GAs adicionales identificadas en genes co- nocidos por ser inductoras de crecimiento tumoral, además de la informa- ción e interpretación de los biomarcadores MSI y TMB. En este mismo in- forme, también se incluyen los hallazgos genómicos con evidencia de significación clínica y los de potencial significación clínica. Se presenta, en su caso, información sobre posible resistencia del paciente a determinados fár- macos en función del perfil genómico. Además, se incluye una interpretación útil para el manejo del paciente de acuerdo a las guías clínicas oncológicas. Este informe tarda en llegar al clínico unos 14 días desde que la mues- tra es enviada al laboratorio. Pero, además de estudiar el CGP, F1CDx está aprobado por la FDA como companion diagnostic device (sistema de diagnóstico complementa- rio). F1CDx ha sido el primer “broad” companion diagnostic (CDx) aproba- do por la FDA. Se trata de una única plataforma diagnóstica disponible para la práctica clínica, incluida entre los “companion diagnostic tests”19. Según define la FDA, CDx es una tecnología de diagnóstico que aporta informa- ción esencial sobre las opciones terapéuticas que pueden ofrecerse a un pa- ciente concreto para el uso seguro y efectivo del tratamiento correspondien- te. Los CDx se desarrollan a partir de aquellos biomarcadores que ayudan a predecir la probabilidad de respuesta y de toxicidad severa a un fármaco concreto20. Se podrán sugerir determinados tratamientos en función del per- fil genómico que discrimine entre respondedores y no respondedores. Cada test CDx está diseñado para detectar una alteración que sea diana para un fármaco determinado, lo que implica que exista una estrecha colaboración entre los fabricantes del dispositivo diagnóstico y los que desarrollan el fár- maco. El test CDx se hace imprescindible cuando una diana genética o bio- lógica concreta está presente sólo en algunos pacientes de una determinada enfermedad pero no en todos, de modo que su utilización permita discrimi- nar aquellos pacientes que se beneficiarán de la administración del fármaco de aquellos otros pacientes en los que dicho fármaco no vaya a ser efectivo o pueda, incluso, ser perjudicial. El primer CDx fue aprobado por la FDA en 1998 para estudio de pa- cientes con cáncer de mama con sobreexpresión de la proteína HER2 que responderían de forma satisfactoria al tratamiento con trastuzumab. El últi- mo listado actualizado de tests CDx aprobados por la FDA lleva fecha de 11 de marzo de 201919. F1CDx ha sido aprobado por la FDA con el fin de identificar a aquellos pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de mama, cáncer colorrectal (CCR), cáncer de ovario o melanoma que pudie- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 31 ran beneficiarse del tratamiento con alguna de las 17 terapias dirigidas fren- te a alteraciones en los 8 genes: EGFR, ALK, BRAF, ERBB2, KRAS, NRAS y BRCA1/2, según ficha técnica (on-label). Ver figura 3. Figura 3. Indicaciones de F1CDx como companion diagnostic. Tomado de la web de Foundation Medicine14. La aprobación de FoundationOne CDx® también representa el primer sistema de diagnóstico complementario basado en NGS para Alecensa® (alectinib), una monoterapia aprobada por la FDA para el tratamiento del NSCLC ALK+, tanto como fármaco de primera línea, como tras progresión después de tratamiento con crizotinib o en pacientes intolerantes al mismo. La inclusión de reordenamientos ALK en un análisis integral más amplio puede ayudar a que se identifiquen más pacientes y a que sean seleccionados para el tratamiento en función de su estado ALK positivo. Por tanto, como companion test, la información que aporte F1CDx re- sultará esencial en la efectividad y seguridad de los fármacos que se adminis- tren al paciente. Se trata de un test diagnóstico in vitro que se lleva a cabo específicamente para tomar una decisión terapéutica concreta. F1CDx ayu- dará al profesional sanitario en la selección del mejor tratamiento, determi- nando si los beneficios que pueda generar un fármaco concreto en un pa- ciente concreto superan los potenciales riesgos de eventos adversos (EA) severos. De esta manera, F1CDx pretende identificar subpoblaciones de pacientes que tienen mayor probabilidad de beneficiarse de un tratamiento determinado (mayor probabilidad de ser seguro y efectivo) e identificar a aquellos con mayor probabilidad de sufrir complicaciones o EA asociados a un fármaco concreto. Por esto, resulta imprescindible que el test realice un diagnóstico correcto para evitar los resultados falsos positivos y negativos, que llevarían a tomar decisiones terapéuticas erróneas, bien administrando un tratamiento innecesario o descartándolo en pacientes en los que hubiera resultado efectivo. Además, su utilización permitiría reducir costes, al evitar administrar el tratamiento en los pacientes con baja probabilidad de res- puesta al mismo y evitar los costes asociados a los EA que dicha terapia podría ocasionar. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 32 Foundation Medicine ha comercializado otras plataformas de secuen- ciación, que no utilizan muestras tisulares. Se trata de FoundationOne® Li- quid y de FoundationOne® Heme. Estas dos y otras plataformas NGS co- mercializadas se describen y resumen en la tabla 7 del anexo VII. Otras tecnologías diagnósticas y las NGS A lo largo del tiempo, en el estudio de las GAs se han ido utilizando diversas técnicas, algunas de las cuales siguen siendo de uso rutinario en la práctica clínica. El análisis inmunohistoquímico (IHC) permite buscar la expresión de determinadas proteínas, tanto la sobreexpresión como la pérdida. Por ejemplo, la sobreexpresión de la proteína HER2 en la superficie de algunas células tumorales. Con las diferentes formas de Hibridación in situ, floures- cente (FISH), cromogénica (CISH) y cromogénica con plata (SISH) se pue- den detectar amplificaciones, inserciones/deleciones, CNAs21-23. Por ejemplo, para estudiar amplificaciones del gen HER2 en pacientes con cáncer de mama. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes como RT-PCR (real-time PCR), qPCR (quantitative-PCR) o MS-PCR (Methyla- tion-specific PCR) son pruebas de gran sensibilidad que permiten detectar SNVs e indels pero no CNAs ni reordenamientos. La espectrometría de masa detecta mutaciones puntuales somáticas en la línea germinal, pero no CNAs ni reordenamientos; supone unos costes de inversión iniciales altos y requiere de personal con gran experiencia. En 1977 Sanger describió la secuenciación del DNA por terminación de cadena24, también denominada secuenciación capilar. Se basa en la reac- ción de replicación (polimerización) del DNA y en el uso de didesoxinucleó- tidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) que sirven como terminadores de la reac- ción. Cada didesoxinucleótido implica un color de fluoróforo diferente, lo que facilita su identificación. La secuenciación de Sanger es muy precisa, permite secuenciar con alta calidad fragmentos de DNA relativamente lar- gos (de hasta 900 pares de bases, pb). Históricamente, ha sido considerada como el gold standard para la identificación de cambios de nucleótidos en la secuenciación de DNA. Permite detectar SNVs (single nucleotide variants) e indels, pero no CNAs, reordenamientos, grandes deleciones ni translocacio- nes. Este método fue mejorado técnicamente y se consiguió automatizar el proceso, aun así se trata de un procedimiento laborioso, lento y que requiere una gran cantidad de DNA tumoral. Además, resulta excesivamente costoso para estudiar el gran número de genes que hoy día se sabe que están relacio- nados con el origen y progresión del cáncer. La pirosecuenciación es un método de secuenciación enzimático que mide la liberación de pirofosfato durante la incorporación de nucleótidos. Se trata de un método de síntesis porque la secuencia del molde se determina a VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 33 medida que se sintetiza su hebra complementaria. Permite detectar cambios epigenéticos en el DNA. Detecta SNVs e indels, pero no CNAs ni reordena- mientos, ni grandes deleciones ni translocaciones. Es un método rápido. Es más sensible y menos costoso que la secuenciación de Sanger. Se puede apli- car en fragmentos de DNA de muestras FFPE. En general, estas técnicas tradicionalmente utilizadas en clínica son muy sensibles para caracterizar las GAs tumorales pero son capaces de de- tectar sólo un número relativamente pequeño de mutaciones en los genes más frecuentes de modo que gran parte de las GAs quedarían sin ser detec- tadas en muchos tumores. Han resultado de utilidad cuando se quiere deter- minar la presencia o no de ciertas mutaciones, por ejemplo, si las mutaciones BCRA1/2 se dan en una paciente concreta, generalmente en el contexto de un posible tumor hereditario de mama u ovario. A medida que se ha ido in- crementado el número de fármacos con dianas moleculares confirmadas, la utilización de esos test genéticos se ha ido haciendo menos factible por la necesidad de una mayor cantidad de tejido para poder aplicar los tests ha- ciendo imprescindible, en muchos casos, la repetición de biopsias, y porque implican un tiempo prolongado de estudio y altos costes. La evolución tecnológica en los tests de secuenciación llevó a la apari- ción de la denominada NGS, secuenciación masiva paralela (Massive Para- llel Sequencing, MPS), secuenciación de segunda generación o ultrasecuen- ciación de alta capacidad o de alto rendimiento (High-throughput DNA sequencing). En el año 2005, 454 Life Science comercializó la primera plata- forma de NGS. La aparición de estas NGS supuso una revolución en el ám- bito de la investigación genómica tanto básica como aplicada en la práctica asistencial hospitalaria al permitir estudiar la secuencia del DNA de cada individuo. En los últimos años la tecnología de secuenciación ha experimentado avances importantes. A diferencia de la técnica de Sanger, las NGS extien- den este proceso a millones de fragmentos de forma masiva y paralela, al- canzando una gran profundidad y una cobertura de varias megabases (Mb), ofreciendo un resultado más fiable a un coste más asequible y en un tiempo (turnaround time, TAT) corto y razonable para su aplicación en la práctica clínica. Por tanto, las NGS ofrecen la posibilidad de estudiar de forma simul- tánea multitud de genes en un único test y sobre una única muestra de tejido o de sangre periférica, evitando la necesidad de realizar múltiples tests para identificar los genes responsables o asociados al tumor concreto en estudio. De esta manera ofrece mucha más información y más rápida que cualquier otra prueba tradicional, que resultaban mucho más costosas, detectaban un número limitado de alteraciones genómicas y requerían una elevada canti- dad de DNA tumoral que en muchas ocasiones resulta complicado de con- seguir. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 34 Para lograr esa secuenciación masiva y paralela se hace necesario redu- cir el tamaño de lectura por lo que los fragmentos de genoma cubierto son más pequeños, el número total de lecturas es mucho mayor aunque también resulta mayor la complejidad para el ensamblaje y análisis bioinformático final. La secuenciación realizada con NGS también permite el estudio de subpoblaciones de células tumorales, que resultaba imposible estudiar con la secuenciación de Sanger. La secuenciación masiva permite detectar todos los tipos de variacio- nes genómicas en un único experimento: sustituciones de bases, variaciones de nucleótido único o de un solo nucleótido (single nucleotide variants, SNV), CNAs, indels, inversiones, traslocaciones, deleciones y duplicaciones25. Además de detectar las posibles variantes, habrá que determinar su implicación clínica en la enfermedad, es decir, analizar si se trata de CRGAs. Es fundamental hacer un diagnóstico correcto de las variantes genéticas, para lo cual las NGS comparan las diferencias en la secuencia de DNA de un individuo con un DNA de referencia. Para que esta comparación sea correc- ta es necesario que haya una buena calidad en el alineamiento y ensamblaje de las secuencias respecto a la de referencia. Cuando las secuencias se ali- nean de forma incorrecta se pueden ocasionar falsos positivos y si las se- cuencias no se alinean ocasionarán falsos negativos. Otros factores que influ- yen en la calidad y fiabilidad de los resultados de la NGS son el tipo de muestra utilizada, la pureza tumoral en la muestra, la técnica de secuencia- ción empleada y la cobertura. Es imprescindible que para uso clínico diag- nóstico las NGS se realicen en laboratorios acreditados, que garanticen unos estrictos controles para reducir al máximo la posibilidad de errores. La alta sensibilidad de las NGS les permite detectar mutaciones presentes en alre- dedor de tan sólo un 5% del DNA aislado de una muestra tumoral6,26. El manejo y la interpretación del elevado número de datos obtenidos suponen un importante reto para las NGS. Por ello, el avance en esta tecno- lógica ha sido posible por el desarrollo de potentes programas informáticos capaces de almacenar y manejar el enorme volumen de datos, así como de métodos bioinformáticos con los que generar la información correcta que permita realizar predicciones fiables de las GAs, sus consecuencias y sus po- tenciales tratamientos. El estudio del perfil genómico de los procesos tumorales mediante NGS se basa en la utilización de ciertos genes preseleccionados (lo que se denominan paneles de genes) de los que se tiene conocimiento que están implicados en el inicio o desarrollo de determinados tumores. El CGP facili- ta la detección tanto de las GAs esperadas para un determinado tumor como la detección de otras GAs inesperadas o no sospechadas, que podrían ser determinantes para establecer el tratamiento más adecuado. Además, se po- drán identificar tanto las mutaciones drivers o conductoras (aquellas altera- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 35 ciones asociadas a la transformación y progresión neoplásica) como las mu- taciones passenger o pasajeras (aquellas alteraciones no fundamentales, que pueden aparecer tanto en células tumorales como normales, pero que no determinan el desarrollo del cáncer), mucho más abundantes que las drivers en el tumor27. La diferencia entre mutaciones drivers y pasajeras se basa, por tanto, en si se asocian a consecuencias funcionales. Principales sistemas de secuenciación Todas la NGS implican varias etapas: preparación de librerías, secuenciación y análisis de datos. Existen numerosas plataformas de secuenciación NGS aunque en todas ellas hay un elemento común que es la necesidad de reali- zar una amplificación previa del fragmento a secuenciar para poder obtener lecturas secuenciadas del mismo. Este proceso se puede realizar bien me- diante una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en emulsión (en las plataformas SOLID, 454 Life Science e Ion Torrent) o una PCR puente (en las plataformas Illumina). Illumina ha desarrollado las plataformas NGS que incluyen el sistema de secuenciación por síntesis: la DNA polimerasa cataliza la incorporación aleatoria de nucleótidos marcados de forma fluorescente en una muestra de DNA durante ciclos secuenciales de síntesis de DNA de tal manera que en cada ciclo de ligación sólo uno de los cuatro nucleótidos se une de forma complementaria al DNA molde, emitiendo una señal luminosa que será cap- tada por un sistema óptico altamente sensible. Este método ha permitido reducir los costes en comparación a la se- cuenciación de Sanger y, aunque se requiere de una gran inversión inicial y de mantenimiento, ofrece resultados a precios razonables. Puede secuenciar desde pequeños paneles de genes a exomas, transcriptomas y genomas de humanos, en un solo experimento. Es la tecnología de secuenciación más utilizada hoy en día. Illumina ofrece varios dispositivos clínicos como HiSeq 2500, Hi- Seq3000/4000/5000, NextSeq500 o MiSeq y más recientemente NovaSeq. NovaSeq y HiSeq pueden llegar a secuenciar un número muy elevado de bases en pocas horas o días. MiSeq tiene menor capacidad de secuenciación pero muy rápida (unos 500 millones de bases en 4 horas) y a un precio mu- cho más barato. Illumina ha permitido abaratar los costes y ofrecer lecturas más largas, sin embargo, se requiere de una gran inversión inicial y de man- tenimiento, para poder adquirir y mantener uno de los equipos que ofrece. La plataforma Ion Torrent™ Personal Genome Machine® (PGM), de Thermo Fisher Scientific (antes, Life Technologies). Salió al mercado en 2010. Utiliza una secuenciación basada en la tecnología de semiconductores: utiliza chips con sensores de voltaje en cada pocillo capaces de detectar los INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 36 iones hidrógeno (H+) que son liberados cada vez que un nucleótido se une a la nueva cadena en formación durante la polimerización (síntesis) del DNA. Resulta bastante competitiva en cuanto a precio, rapidez y calidad para pa- neles pequeños de genes y el análisis de exomas, pero no está destinada para la secuenciación de genomas completos. Las plataformas 454 y SOLID están prácticamente ya en desuso. 454 Life Sciencies, comercializada por Roche, fue la primera plataforma en salir al mercado. Se basa en la pirosecuenciación: detecta señales luminosas gene- radas a partir de grupos de pirofosfato liberados tras la polimerización de un nuevo nucleótido complementario a una hebra de DNA molde. SOLiD (Su- pport Oligonucleotide Ligation Direction), de Life Technologies, apareció en 2007; incluye una metodología de secuenciación basada en la ligación se- cuencial de oligonucleótidos marcados (secuenciación por ligación). Las plataformas MiniON y PacBio son las principales tecnologías de lecturas largas disponibles en el mercado29. Biopsia líquida Frente al análisis del DNA en el tejido tumoral, en los últimos años ha surgi- do la posibilidad de analizar el perfil genómico en DNA tumoral libre circu- lante (ctDNA) o en células tumorales circulantes. Es la denominada biopsia líquida. Este ctDNA son fragmentos de DNA que se liberan de forma conti- nua desde las células tumorales apoptóticas y necróticas, generalmente de tumores en estadio avanzados mientras que en estadios iniciales, los niveles de ctDNA son bajos. Generalmente el ctDNA se toma del plasma pero es posible tomarlo de otros fluidos biológicos como saliva, orina o derrame pleural. Entre las aplicaciones del estudio de secuenciación del ctDNA cabría destacar las siguientes: realizar el perfil genómico del tumor en el momento del diagnóstico; monitorizar la respuesta terapéutica de los pacientes, valo- rando los cambios moleculares más relevantes que pueden ocasionarse du- rante la progresión del tumor y que podrían relacionarse con el desarrollo de resistencias al tratamiento con la ventaja de ofrecer esta información an- tes de que la evolución clínica y/o radiológica indiquen progresión y falta de respuesta tumoral; también, detectar enfermedad residual mínima y enfer- medad metastásica, que contribuiría a mejorar el diagnóstico y tener una mayor certeza sobre el pronóstico28; determinar la TMB, como biomarcador predictivo de respuesta a la inmunoterapia. Además, la biopsia líquida será fundamental en aquel porcentaje de pacientes (estimado en un 20%) en los que la biopsia tisular no es adecuada para realizar el perfil molecular o cuan- do no es posible obtener estas muestras o su obtención es arriesgada (por ejemplo, cuando la muestra se debe tomar de tejido cerebral). VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 37 El cáncer y su relación con las GAs El cáncer es la segunda causa de muerte después de las enfermedades del sistema circulatorio. En España, los tumores responsables del mayor núme- ro de fallecimientos son el cáncer de pulmón y el CCR, seguidos a mucha distancia de cáncer de páncreas, el cáncer de mama y de próstata30. En hom- bres, el cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer, seguida de CCR, próstata y vejiga, mientras que en mujeres el cáncer de mama la primera causa de muerte por cáncer seguido de CCR, pulmón y páncreas31. En cuanto a su incidencia, a nivel mundial, el cáncer de pulmón es el tumor más frecuente seguido del cáncer de mama, CCR y próstata32. En España, las cifras ofrecidas por la SEOM (Sociedad Española de Oncología Médica)30 muestran que el tumor de mayor frecuencia en hombres es el cáncer de próstata, seguido de cáncer de pulmón, CCR y vejiga, mientras que en mu- jeres los tumores más frecuentes son el cáncer de mama, CCR, útero y pul- món. Los tumores de mayor prevalencia en España son el cáncer de mama, de próstata y de pulmón. Tradicionalmente, los tumores se clasificaban y trataban en función de su histología pero la llegada de las NGS ha permitido la caracterización mo- lecular de los tumores. Hoy en día se reconoce la gran complejidad genética asociada a los procesos malignos. Diversas alteraciones en genes esenciales en el ciclo celular, en la reparación del DNA y en los mecanismos de prolife- ración celular estarían implicadas en el origen, diseminación y mantenimien- to de los procesos tumorales malignos. Como las células normales tienen mecanismos de protección frente al efecto cancerígeno, parece que sólo cuando se produzca una acumulación de diversas alteraciones en varios ge- nes se podría desarrollar el cáncer. En general, estas GAs pueden agruparse en dos grandes grupos, unas de activación de las vías de señalización celular o de las vías del ciclo celular, y otras de inactivación de los reguladores nega- tivos. Incluso tumores originados en un mismo órgano pueden tener perfiles genómicos distintos entre sí, y esta diversidad en las GAs es la que condicio- na sus propiedades biológicas como su capacidad de proliferación, su agresi- vidad local, su capacidad de invasión tisular, la tendencia a generar metásta- sis a distancia o su respuesta al tratamiento. Las GAs identificadas serían marcadores diagnósticos, pronósticos y predictivos de respuesta del tumor a determinados fármacos, de ahí que el estudio del perfil genómico completo se ha convertido en un elemento fundamental en la aplicación de la medici- na de precisión. Entre los genes implicados en el cáncer es posible diferenciar tres gran- des tipos. Por un lado, los protooncogenes, que llevan a la producción de proteínas implicadas en los procesos de proliferación y diferenciación celu- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 38 lar. La mutación de esos protooncogenes resulta en variantes alteradas de- nominadas oncogenes, que llevan a la multiplicación descontrolada de las células. Un segundo grupo son los genes supresores de tumores cuya inacti- vación está relacionada con la proliferación celular y tienen un papel clave en la apoptosis y control del ciclo celular. El tercer grupo incluye los genes de estabilidad, los responsables de mantener la estabilidad genética. La ines- tabilidad genómica más estudiada y mejor caracterizada es la MSI. Estos genes de estabilidad se encargan de reparar aquellas alteraciones que ocu- rren en la replicación del DNA o las que se producen en los cromosomas durante la mitosis, de modo que su inactivación lleva a un aumento en el número de mutaciones. Dentro de este grupo se incluyen los genes repara- dores de apareamientos erróneos o mismatch repair (MMR). La inactiva- ción de estos genes conduce a una rápida acumulación de mutaciones, y por este motivo se les ha denominado también genes mutadores. Los tumores con deficiente MMR (dMMR) tienen entre 10 y 100 veces más mutaciones somáticas. En general, se acepta la existencia de tres tipos principales de GAs33 tumorales que ocurren sobre oncogenes y que se pueden detectar mediante NGS: mutaciones activadoras (ej: las que ocurren en EGFR y BRAF), las amplificaciones génicas (ej: en MET y HER2) y las fusiones génicas (ej: en ALK y ROS1). Las mutaciones activadoras son cambios en la secuencia de DNA de diferente naturaleza y que producen como resultado la activación constitutiva de las señales downstream de proliferación y supervivencia (MAPK, PI3K) que en las células normales están muy estrictamente contro- ladas. Otras GAs son las CNAs, bien amplificaciones o deleciones. Estas al- teraciones pueden tener un impacto significativo en la respuesta al trata- miento. Y el tercer tipo de GAs serían los reordenamientos genómicos o genes de fusión, que ocasionan rupturas del gen o la creación de nuevas moléculas oncogénicas (por ejemplo, en ALK y ROS1) y resultan en una expresión genética o una función genética errónea. Pueden tener, también, un impacto significativo en el tratamiento de algunos tumores. El análisis de las mutaciones somáticas se ha convertido en una herra- mienta habitual en la práctica clínica de los tumores sólidos con el fin de identificar las mutaciones sensibles y las resistentes a determinados fárma- cos. Aunque en las células tumorales pueden coexistir diferentes GAs, los tumores suelen presentar un driver oncogénico dominante o GA conducto- ra, que es fundamental en la activación y mantenimiento del crecimiento tumoral maligno. Una vez que la célula se convierte en cancerígena, sufre una serie de cambios moleculares, metabólicos y estructurales que le permi- ten sobrevivir, desarrollarse y metastatizar. Entre estos cambios destacan la insensibilidad a los factores inhibidores del crecimiento y autosuficiencia de VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 39 factores de crecimiento, con una capacidad de replicación ilimitada y de es- capar a los mecanismos de apoptosis, además de su capacidad para invadir tejidos cercanos o a distancia y el incremento en la angiogénesis. Por el con- trario, las GAs denominadas passengers son alteraciones que sólo acompa- ñan a las drivers pero no intervienen en el origen del tumor. El análisis de los genes drivers resulta fundamental para clasificar a los pacientes en subgru- pos diferentes genéticamente, con una evolución, pronóstico y opciones te- rapéuticas distintas. Tumores histológicamente similares se diferencian en varios subtipos genómicos. Muchas de las GA encontradas en el tejido tumoral también se presen- tan en el DNA de tejido sano y en el DNA de la línea germinal de un pacien- te, y esto debe ser tenido en cuenta para evitar falsos positivos. Por otro lado, sólo algunas GA son intervenibles, es decir, que son GA sobre las que se puede actuar porque han mostrado susceptibilidad a algún fármaco especí- fico. A medida que se van conociendo nuevas GA intervenibles y desarro- llando fármacos dirigidos frente a ellas, se hace necesario disponer de tecno- logías capaces de detectarlas de forma rápida y económica y se intentan incorporar a la rutina de diagnóstico. Sobre la medicina de precisión en oncología La medicina de precisión o personalizada es un campo todavía en desarrollo que tiene como objetivo diseñar el tratamiento más ajustado a cada paciente en función del perfil biológico del tumor. Pero la medicina de precisión no incluye únicamente el uso de la información genética sino también la pro- teómica y ambiental, de manera que la integración de toda esa información permita seleccionar el tratamiento óptimo en cada caso. La medicina de pre- cisión ha sido posible gracias al desarrollo de nuevas técnicas que han apor- tado un gran conocimiento sobre las GAs que subyacen en el cáncer y a la marcada evolución de la bioinformática. En el caso de los tumores malignos, el uso clínico de estas pruebas per- mite estudiar y caracterizar de forma individual el tumor de cada paciente y seleccionar la mejor terapia y más específica de acuerdo a las mutaciones encontradas. Se ha ido pasando de aplicar un tratamiento quimioterápico similar a todos los pacientes con un tipo determinado de tumor, a clasificar a los pacientes en función del subtipo tumoral, de las características de los pacientes y de la presencia o no de biomarcadores tumorales y dianas mole- culares específicas de cada tumor y cada paciente. Además, se ha comproba- do que para una misma mutación genómica, las diferencias en la biología del tumor suponen comportamientos tumorales diferentes ante una misma me- dicación. A este cambio de conocimiento sobre el cáncer han contribuido fundamentalmente la utilización y el desarrollo de tests específicos que INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 40 identifiquen las GAs presentes en el tumor y esto, a su vez, se ha acompaña- do de una intensa investigación en nuevas terapias dirigidas frente a las dia- nas terapéuticas clínicamente relevantes. Generalmente, los tumores se tratan al inicio con la terapia convencio- nal, aunque algunos fármacos dirigidos están ya aprobados para ser utiliza- dos como primera línea terapéutica. Los pacientes con cáncer en estadio avanzado o metastásico suelen haber recibido varias líneas de tratamiento a lo largo del tiempo, y progresivamente la probabilidad de estabilización de la enfermedad se va reduciendo a la vez que aumentan las resistencias al tratamiento recibido. En estos tumores recidivantes o con metástasis a dis- tancia se suelen presentar varias GAs de forma simultánea, por lo que se debería valorar la posibilidad de realizar estudio del perfil genómico con el fin de identificar dianas terapéuticas para las que se disponga de un fármaco dirigido concreto, que sería altamente específico. Además, la presencia de ciertas GA aportarían información pronóstica. El tratamiento combinado de varios fármacos, tanto de quimioterapia (QT) estándar como terapia dirigida, suele presentar mejores resultados en procesos tumorales avanzados que la monoterapia, además de contribuir a reducir el desarrollo de resistencias al tratamiento. Se espera que estos trata- mientos sean más eficaces, puesto que se evita la administración de fármacos no efectivos, y más seguros que la QT convencional, porque van dirigidos contra las células tumorales principalmente, de modo que el daño ocasionado sobre las células sanas resulta inferior al que se produce con la QT conven- cional aunque en ocasiones también se asocian a EA de toxicidad nada des- preciable como algunos EA relacionados con el sistema inmunitario (irAE). Terapia dirigida Las terapias dirigidas utilizadas en oncología son fármacos que interfieren en los denominados “dianas moleculares” que participan en el crecimiento, el avance y la diseminación tumoral. La mayoría de estos fármacos suelen ser citostáticos (bloquean la proliferación celular) a diferencia de muchos qui- mioterápicos citotóxicos (efecto destructor de las células). Las terapias dirigi- das se aplicarían, por tanto, en subgrupos de pacientes con una alteración molecular específica que sería la diana de la terapia, pero siempre que exista el tratamiento pertinente o que haya sido aprobado por las autoridades com- petentes. Las dianas de la terapia dirigida pueden ser GAs o proteínas sobre- expresadas en la superficie de las células tumorales o en células relacionadas con el crecimiento tumoral como las células de los vasos sanguíneos. La mayoría de las terapias dirigidas son de dos tipos: a) medicamentos micromoleculares o de moléculas pequeñas, capaces de entrar fácilmente en las células debido a su tamaño pequeño y por ello se usan para que actúen VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 41 sobre el objetivo o diana ubicados en el interior de las células, por ejemplo, los inhibidores de la angiogénesis, o b) anticuerpos monoclonales humaniza- dos, que no pueden entrar al interior de las células sino que se unen a dianas específicas situadas en la superficie externa. Otros son anticuerpos conjuga- dos porque van unidos a un quimioterápico, denominándose conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC), como el ado-trastuzumab-emtansina (TDM-1 o Kadcyla), que es absorbido por las células tumorales que expresan HER2 en su superficie y las destruye. Se han desarrollado diferentes terapias dirigidas con distintos mecanis- mos de acción33. Estas terapias incluyen inhibidores de transducción de seña- les, moduladores de la expresión de genes, inductores de apoptosis, inhibido- res de apoptosis, inhibidores de la angiogénesis y moléculas que depositan sustancias radiactivas o compuestos químicos tóxicos que destruyen la célula. La disfunción de proteína quinasas subyace en muchos tipos de cáncer de ahí que estas enzimas constituyan dianas moleculares para los inhibido- res de proteína quinasas de vías de transducción implicadas en el tumor. Se han desarrollado algunos anticuerpos monoclonales contra proteína quina- sas o contra su receptor, que interrumpen la transmisión de la señal a nivel de receptor. Estos fármacos reducen la proliferación celular tumoral, favore- cen la apoptosis y disminuyen la angiogénesis. Se han aprobado varios inhi- bidores de proteína quinasas para uso clínico. Los factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) son producidos por las células tumorales para estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos con los que apor- tar los nutrientes y el oxígeno necesario para su crecimiento. Estos VEGF se unen a sus receptores, que son otra familia de receptores de tirosina quinasa (RTKs). Entre ellos se incluye bevacizumab (Avastina®). Entre los inhibidores de serina/treonina quinasas se incluyen los inhi- bidores mTOR como everolimus y temsirolimus. mTOR forma parte de una ruta de señalización PI3K/AKT/mTOR que regula la respuesta de células tumorales a nutrientes y factores de crecimiento, y controla el aporte de sangre y angiogénesis a través de efectos sobre VEGF en células endotelia- les y tumorales. Esta ruta se encuentra activada en muchos tumores, espe- cialmente en aquellos con una elevada actividad de PI3K, o en los que se encuentra mutada el supresor tumoral PTEN. Una de las limitaciones de las terapias dirigidas es el desarrollo de re- sistencias frente a dichas terapias. Esta resistencia puede ocurrir porque la propia diana sufra una mutación de modo que la terapia dirigida no lo reco- nozca o bien porque el tumor desarrolle algún mecanismo diferente que le haga escapar del efecto de la terapia dirigida. Para evitar la resistencia, una posibilidad es combinar los fármacos. Otra limitación es que para algunas dianas no es posible, con la tecnología actual, desarrollar fármacos dirigidos contra ellos. Es el caso de la proteína Ras, proteína de señalización cuya INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 42 mutación se ha visto implicada en una cuarta parte de los tumores malignos y para la cual no se han podido formular hasta el momento, inhibidores de señalización de Ras. Se han generado grandes expectativas de poder ofrecer a los pacientes esta terapia personalizada con fármacos que se ajusten a las GAs del tumor concreto que presenta. Es importante saber qué pacientes tienen mayor pro- babilidad de beneficiarse a estos tratamientos, que suelen ser de elevados costes y no están exentos de eventos adversos. En general se reconoce que esta terapia sólo beneficia a un número escaso de pacientes cuyos tumores han progresado a pesar de recibir los distintos tratamientos convencionales disponibles, pero aún no está claro cómo identificar a este pequeño número de pacientes que se va a ver beneficiado34. En las indicaciones clínicas de los fármacos dirigidos se dice de forma expresa, que antes de iniciar el tratamien- to del paciente, deben haberse detectado las alteraciones genómicas median- te “un método validado de determinación” de las mismas. Puesto que es un requisito para el uso de esta terapia dirigida es que el tumor presente las dianas concretas para poder ejercer su efecto, antes de utilizarla resulta nece- sario realizar el perfil genómico tumoral, siendo las NGS las técnicas más avanzadas para detectar y describir dichas GAs34. Dada la heterogeneidad tumoral, es posible que resulte necesario utilizar más de un panel de genes. Sin embargo, la decisión de qué fármaco elegir para un tumor concreto puede no ser fácil puesto que en muchos casos se presentan varias posibles dianas terapéuticas. Otro factor que influye tanto en la respuesta al fármaco como en el desarrollo de resistencias al mismo, es la marcada heterogenei- dad existente en los tumores sólidos, incluso dentro del mismo tumor, entre unas zonas y otras. Además, se sabe que con la evolución del tumor se gene- ran subclones con diferentes perfiles genéticos y epigenéticos, de modo que si el tumor recidiva, sería aconsejable rebiopsiar porque es posible encontrar GAs diferentes de las identificadas en el tumor inicial. Por tanto, hay que considerar a los tumores como entidades dinámicas y adaptativas que con- tribuyen a la aparición de resistencias terapéuticas que eventualmente son responsables de las recidivas tumorales35. Inmunoterapia La inmunoterapia emplea fármacos que estimulan el sistema inmunitario del paciente para que destruya las células cancerígenas. Han supuesto un cambio sustancial en el manejo oncológico. Su principal ventaja es su capa- cidad para controlar el proceso tumoral durante periodos largos de tiempo, consiguiendo supervivencias prolongadas incluso en algunos tumores que se consideraban incurables. Para aumentar la efectividad antitumoral es posi- ble combinar dos o más tratamientos de inmunoterapia. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 43 Dentro de la inmunoterapia se incluyen algunos anticuerpos monoclo- nales, que actúan marcando a las células malignas de modo que facilitan que el sistema inmunitario las localice y destruya, y los inhibidores de puntos de control, que se unen a ciertas moléculas situadas en la superficie de los linfo- citos y otras células del sistema inmune, denominadas puntos de control, que necesitan ser activados o desactivados para iniciar la respuesta inmunitaria. Con ello se restaura la capacidad innata del sistema inmunitario para elimi- nar células tumorales haciendo que se reduzca el crecimiento tumoral, lo que favorece que la respuesta tumoral se prolongue en el tiempo. Entre los inhibidores de puntos de control se distinguen unos que se dirigen contra la proteína 1 de muerte celular programada y su ligando (pro- grammed cell death 1, PD-1 y PD-L1) y otros contra el CTLA4 (anti-cytotoxic T-Lymphocyte antigen 4) bloqueando las vías tumorales que inactivan a las células T citotóxicas. Los inhibidores del PD-1 son nivolumab (Opdivo®) y pembrolizumab (Keytruda®), y los inhibidores del PD-L1 como atezolizu- mab (Tecentriq®), avelumab (Bavencio®) y durvalumab (Imfinzi®). Entre los que se unen a la proteína CTLA-4 se incluye el ipilimumab (Yervoy®). Estos fármacos no están exentos de riesgos y se estima que entre un 5-15% (datos de SEOM, 2018) de pacientes desarrolla toxicidades impor- tantes que suelen deberse a la activación del sistema inmune contra el pro- pio organismo en forma de neumonitis o colitis, por ejemplo. Otros EA más frecuentes de estos fármacos (irEA) son la tos, rash cutáneo, fatiga, pérdida de apetito, y otros más serios con repercusión renal, hepática o pulmonar. Los anti-CTLA-4 parecen tener efectos secundarios de mayor gravedad que los anti-PD-1 y anti-PD-L1. Por esto y por su elevado coste, resulta de gran relevancia clínica valo- rar si el paciente va a responder o no a este tratamiento36,37. Entre los biomarcadores de respuesta a la inmunoterapia se incluyen la TMB y MSI. La TMB mide el número de mutaciones somáticas por megab- ase de DNA identificadas en el DNA codificante tumoral. Se asume que a mayor número de mutaciones, mayor es la probabilidad de que estén pre- sentes mutaciones carcinogénicas13. Mediante las NGS es posible determi- nar la TMB y cuanto mayor es la región secuenciada, más exacta es su cuan- tificación. En muchos tumores malignos se ha comprobado una alta TMB, especialmente en NSCLC, carcinoma urotelial o melanoma, asociada a ex- posiciones medioambientales que son factores de riesgo de mutaciones en el DNA y contribuyen a la tumorogénesis, como el consumo de tabaco o la exposición a la luz ultravioleta38. La TMB es un marcador clínico cuantitativo predictivo de buena res- puesta tumoral a la inmunoterapia39,40. A mayor TMB se ha observado un mayor beneficio clínico en el paciente tratado con estos fármacos, con mayo- res tasas de supervivencia global, de supervivencia libre de progresión (PFS) INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 44 y de respuesta tumoral41,42. Una actividad anormal en varias vías de señaliza- ción celular, incluyendo la reparación del daño del DNA y su replicación, pueden incrementar la tasa global de mutaciones somáticas en el tumor. Los defectos en la reparación del daño del DNA llevan a una acumulación de mutaciones debidas a errores en la replicación y al daño ambiental. El segundo biomarcador que pueden detectar las NGS es la presencia de MSI. La aparición de microsatélites de tamaño alternativo (anormalmen- te más largos o cortos) en el DNA tumoral de un individuo que no están presentes en el ADN de la línea germinal es lo que se denomina MSI. Las NGS pueden detectar con gran exactitud la MSI, a partir de muestras de tejido FFPE que deben acompañarse de una muestra de células normales del mismo paciente para documentar la presencia de la inestabilidad. Si no existe tal inestabilidad, se habla de microsatélite estable (MSS). Niveles al- tos de MSI (MSI-H) se correlacionan con incrementos en la carga antigénica que puede hacer más sensible al tumor a la inmunoterapia43. La presencia de esta MSI se asocia a errores en la reparación del DNA debidos a mutaciones en los genes MMR, lo que impide que los errores de replicación cometidos por la DNA polimerasa sean reparados. Esto lleva a una elevada tasa de mutación celular, a una acumulación acelerada de muta- ciones de nucleótidos y a la alteración en la longitud de la hebra de DNA, que da origen a la MSI. Por eso, la MSI podría ser un marcador subrogado de trastornos en la reparación del DNA. Una alta TMB puede ser debida a dMMR que están asociados a la inestabilidad de microsatélites: Las muta- ciones en los genes MMR pueden llevar a incrementos en la incidencia de mutaciones en los microsatélites. Por esto, MSI es un marcador subrogado de trastornos en la reparación del DNA, tales como una dMMR13. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 45 Objetivo El objetivo principal de este informe es valorar la validez diagnóstica y uti- lidad clínica de F1 o F1CDx como plataformas NGS para el diagnóstico de alteraciones genómicas asociadas a tumores sólidos y su recomendación te- rapéutica. Se ha estudiado su validez diagnóstica para detectar las dianas terapéu- ticas y otras GAs, en comparación con las pruebas de referencia, con otros test de secuenciación convencional o de nueva generación, en pacientes con alguno de los cinco tumores sólidos (NSCLC, cáncer de mama, ovario, CCR y melanoma) para los que F1CDx está aprobado por la FDA como tecnolo- gía de diagnóstico complementario. Asimismo se ha estudiado si su utilización supone un cambio en el diagnóstico y en el manejo terapéutico de los pacientes. Se han analizado la evolución clínica y estado de salud del paciente tras la administración del tratamiento personalizado indicado por F1 o F1CDx. También se han revisa- do otros aspectos relativos a la terapia como las posibles complicaciones o eventos adversos de la terapia dirigida utilizada, las consecuencias de utili- zar unos fármacos y no otros, o el posible retraso en el inicio del tratamiento. Como objetivos secundarios de este informe, se han realizado revisio- nes breves narrativas sobre las tecnologías diagnósticas de secuenciación y alternativas a F1 o F1CDx para el análisis genómico de los procesos oncoló- gicos, y sobre las principales alteraciones genómicas que caracterizan a los cinco tumores sólidos ya mencionados y sus correspondientes tratamientos. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 46 Metodología Se ha realizado una revisión sistemática de la literatura científica sobre efec- tividad diagnóstica, utilidad clínica y seguridad de las plataformas F1 LDT y F1CDx en pacientes con tumores sólidos, en concreto, en los cinco tumores para los que está aprobado F1CDx como companion diagnostic: cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, carcinoma colorrectal, cáncer de ovario y melanoma. Para ello se realizó una búsqueda sistemática de las pu- blicaciones recogidas en distintas fuentes de información aplicando estrate- gias de búsqueda específicas a cada una de esas fuentes con el fin de localizar toda la evidencia publicada que permita responder a la pregunta de investi- gación, estructurada siguiendo el concepto PICO (Pacientes, Intervención, Comparador, Outcomes-Resultados). También se ha realizado una revisión breve sobre las alteraciones ge- nómicas asociadas a cada uno de los tumores anteriormente mencionados, sobre las tecnologías NGS y alternativas a F1/F1CDx y sobre las distintas terapias dirigidas e inmunoterapia empladas en el tratamiento de estos tu- mores. Fuentes de información y estrategias de búsqueda La identificación de estudios se realizó mediante una búsqueda de la litera- tura científica realizada entre el 17/9/2018 y el 21/9/2018. Además, el 19/03/2019 y 5/06/2019 se repitieron las búsquedas para evitar dejar fuera publicaciones nuevas o indexadas con posterioridad a la búsqueda inicial. Se tomó como fecha de inclusión de estudios los publicados a partir de enero de 2012 y se escrutaron las siguientes bases de datos electrónicas: • Medline (PubMed). • Cochrane Database of Systematic Reviews, de Cochrane Library. • Cochrane Central Database of Controlled Trials-Central, de Cochra- ne Library. • DARE (Database of Abstracts of Reviews of Effects), Health Techno- logy Assessment (HTA) Database y NHS-EED (National Health System Economic Evaluation Database), del Centre for Reviews and Dissemination (CRD). • Biblioteca Virtual en Salud (BVS). • Trip (Turning Research Into Practice) Database. • Prospero. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 47 Asimismo, se llevaron a cabo búsquedas en los siguientes registros de estudios clínicos: • ClinicalTrials (https://clinicaltrials.gov), de Estados Unidos. • International Clinical Trials Register Platform (ICTRP) de la Orga- nización Mundial de la salud (http://apps.who.int/trialsearch/). • EU Clinical Trials Register (www.clinicaltrialsregister.eu). Por último, se realizó una búsqueda de literatura gris en las páginas web de las principales agencias de evaluación de tecnologías sanitarias (ETS) nacionales e internacionales y organismos regulatorios de productos sanitarios, como los siguientes: • INAHTA (International Network of Agencies for Health Technology Assessment, http://www.inahta.org/about-inahta/). • RedETS (Española de Agencias de Evaluación de Tecnologías Sani- tarias y Prestaciones del Sistema Nacional de Salud, https://redets. mscbs.gob.es/). • CADTH (Canadian Agency for Drugs and Technologies in Health, www.cadth.ca/). • AHRQ (Agency for Healthcare Research and Quality, www.ahrq. gov/research/index.html). • NICE (National Institute for Health and Care Excellence, www.nice. org.uk). • FDA (Food and Drug Administration, www.fda.gov). Para la identificación de estudios se diseñaron diferentes estrategias de búsqueda, adaptadas a cada fuente de información, combinando términos MESH (para Medline) y texto libre, junto a diferentes operadores boolea- nos y de truncamiento. Se seleccionaron publicaciones en inglés, francés y español. Las estrategias empleadas en las principales bases de datos se muestran en el anexo III. Para la tecnología, se emplearon los siguientes términos de búsqueda en inglés y español, en función de la fuente de información: “FoundationO- ne”, “Foundation Medicine”, “FoundationCDx”, “next-generation sequencing”, “high-throughput sequencing”, “comprehensive genomic profiling”, “hy- brid-capture-based sequencing”, CGP, NGS, “secuenciación de nueva genera- ción”, “secuenciación de segunda generación”, “perfil genómico completo”. Para los tumores se utilizaron los siguientes términos: “colon”, “colorectal”, “lung”, “breast”, “ovarian”, “ovaric”, “melanoma”, “cancer”, “neoplasm”, “tumor”, “tumour”, “carcinoma”, “adenocarcinoma”, “squamous”, “non-small cell lung cancer”, “NSCLC”. También se revisaron los listados de referencias bibliográficas de los estudios incluidos y de los artículos más relevantes con el fin de recuperar estudios que no hubieran sido localizados a través de las estrategias de bús- quedas mencionadas. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 48 Las referencias bibliográficas se gestionaron a través del gestor biblio- gráfico EndNote X9. Selección de estudios Durante este proceso de incorporación de las referencias localizadas en la búsqueda al gestor bibliográfico, se realizó un primer cribado de las referen- cias duplicadas de manera automática y después de forma manual. A conti- nuación, dos revisoras (EGC, MCR), de forma independiente y aplicando los criterios de inclusión y exclusión, realizaron una selección inicial de artí- culos a partir de la lectura de los títulos y resúmenes. Los desacuerdos se resolvieron por consenso o por discusión con la tercera revisora (CAB). Aquellos artículos inicialmente seleccionados como relevantes fueron recu- perados a texto completo para su lectura y así decidir si se ajustaban a los criterios de inclusión y exclusión. Esta etapa del proceso de selección fue realizada, de forma independiente, por las tres revisoras. Ni durante el proceso de selección ni el posterior de extracción de da- tos se enmascararon los nombres de los autores, de las instituciones ni de las revistas de publicación. No se contactó con los autores o investigadores de publicaciones en marcha o no publicadas. Criterios de inclusión de los estudios Tipo y diseño de los estudios Artículos originales de estudios de cualquier diseño que incluyeran un nú- mero mínimo de 10 pacientes. También se consideraron las editoriales, cartas al editor, revisiones narrativas, revisiones sistemáticas, meta-análisis e infor- mes de evaluación de tecnologías sanitarias. Población Pacientes de ambos sexos, sin límite de edad, con diagnóstico de cáncer de pul- món, mama, CCR, ovario o melanoma en estadios avanzados o metastásicos. Intervención FoundationOne® o FoundationOne CDxTM. Comparadores Se consideraron como comparadores otras pruebas diagnósticas de uso en la práctica clínica con las que se realice habitualmente el diagnóstico como VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 49 – plataformas de secuenciación genómica de nueva generación como Caris Molecular Intelligence® (CMI), Guardant 360® (G360), MSK-IMPACT, OncoDeep®, Oncomine Dx®, Paradigm Cancer Diagnostic® (PCDx). – otros paneles de genes como LungSeg, Oncopanel, SNaPshot, PanCan, Smart Genomics, TruSeq. – otras pruebas diagnósticas como FISH, IHC, secuenciación Sanger. Medidas de resultados – Número y tipo de mutaciones detectadas. – Intervalo de tiempo entre la obtención de las muestras y la reali- zación del index test y el test de referencia. Tiempo requerido por cada prueba para ofrecer los resultados. – Modificaciones del diagnóstico inicial. – De efectividad diagnóstica: sensibilidad y especificidad, o los da- tos para poder calcular la tabla 2x2. Reproducibilidad. – Detección de diana terapéutica y elección de tratamiento perso- nalizado. – Cambio en las decisiones terapéuticas o en el manejo de los pa- cientes después del resultado obtenido con FoundationOne® o FoundationOne CDxTM. – Mortalidad, supervivencia global, PFS, supervivencia libre de pro- gresión tumoral. – De seguridad: complicaciones asociadas a la técnica de obtención de la muestra. Toxicidad del tratamiento seleccionado. Toxicidad evitada por descartar un tratamiento no efectivo. Toxicidad o complicaciones debidas al posible retraso en el inicio del trata- miento en espera de los resultados de F1 o F1CDx. – Otros resultados: disponibilidad de tratamiento dirigido. Criterios de exclusión • Estudios que no ofrecían datos relacionados con ninguna de las me- didas de resultado consideradas en los criterios de inclusión. • Estudios que sólo presentaban resultados de investigación experi- mental o en animales, o que se referían únicamente a aspectos téc- nicos. • Estudios duplicados, con los mismos pacientes y/o datos, o estudios desfasados por publicaciones posteriores de la misma institución. • Estudios no publicados aunque ya hubieran sido aceptados para su publicación. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 50 Extracción de datos La extracción de datos de los estudios finalmente seleccionados se realizó de forma independiente por las tres investigadoras, resolviendo los desacuer- dos por consenso. Los datos y resultados de los estudios incluidos se extraje- ron utilizando un formulario elaborado específicamente para este informe, a partir del cual se elaboraron las correspondientes tablas de evidencia. En este formulario se recogieron los datos y las variables más importantes rela- cionadas con los objetivos generales y específicos de este informe: • Características generales del estudio, datos bibliométricos: autor principal, año de publicación, país donde se realizó el estudio, perio- do de estudio, diseño del estudio, uni o multicéntrico, tiempo de se- guimiento y criterios de inclusión y exclusión de cada estudio. • Características de la población: número de pacientes, edad, sexo, tipo de tumor, estadio, histología y localización tumoral, tratamien- tos previos recibidos. • Variables relacionadas con las NGS, F1o F1CDx y con otras plata- formas o pruebas diagnósticas utilizadas y las de referencia: tipo de muestra, lugar de obtención (sitio primario del tumor, metástasis, DNA libre circulante o de células tumorales circulantes), forma de obtención de la muestra (punción aspiración con aguja fina, biopsia excisional, biopsia core, cirugía), tiempo desde la extracción de la muestra empleada por los diferentes tests diagnósticos, tiempo des- de el análisis de la muestra hasta el resultado del test. • Variables de resultado: número de pacientes con alteraciones interve- nibles, número y tipo (amplificaciones, deleciones, inserciones, fusiones, reordenamientos, truncamientos o sustituciones) de alteraciones genó- micas detectadas, carga mutacional tumoral, tratamientos propuestos (número de fármacos y fármacos dirigidos) por F1 o F1CDx y por las otras plataformas o pruebas diagnósticas utilizadas, concordancia en- tre las GAs detectadas y los fármacos sugeridos por F1 o F1CDx y otras plataformas NGS o técnicas de diagnóstico convencionales, nú- mero de pacientes candidatos a la terapia dirigida propuesta por las NGS, número de pacientes que finalmente recibió la terapia dirigida, motivos por los que los potenciales candidatos no fueron tratados. • Variables de resultado en salud para el paciente: – La supervivencia global se define como el tiempo desde el diag- nóstico de la enfermedad (generalmente, de la enfermedad me- tastásica) hasta la fecha del último seguimiento o del fallecimien- to del paciente. – La PFS se define como el tiempo transcurrido desde el inicio del tratamiento hasta la progresión de la enfermedad (sea ésta detec- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 51 tada mediante estudio radiológico o por sintomatología clínica) o muerte. – Duración del tratamiento. – Respuesta tumoral: completa, parcial, enfermedad estable, pro- gresión y respuesta objetiva (suma de respuestas completa y par- cial), y la duración de la respuesta. También se registra la forma de valoración de la respuesta tumoral (en la mayoría de los casos utilizando los criterios RECIST, Response Evaluation Criteria in Solid Tumours). – Influencia en el manejo clínico del paciente: cambio (%) de pa- cientes en los que las NGS modificaron el diagnóstico. Influencia en la toma de decisiones terapéuticas: cambio (%) del tratamien- to previsto por otro indicado por la NGS. Eficacia o efectividad de este tratamiento dirigido vs tratamiento ineficaz pautado por los resultados de la NGS vs tratamiento con efectos adversos. – EA ocasionados por los fármacos dirigidos: número de EA, tipo, grado de severidad de acuerdo a la clasificación CTCAE (NCI Common Terminology Criteria for Adverse Events). Síntesis de los datos La información recopilada fue resumida y analizada a través de una síntesis narrativa con tabulación de datos y resultados de los estudios incluidos. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 52 Resultados Revisión de las GAs y terapias en los cinco tumores sólidos A continuación se presenta la revisión realizada sobre el estado actual de las principales GAs asociadas a cada uno de los cinco tumores sólidos conside- rados en este informe y las terapias correspondientes, lo que daría cumpli- miento al objetivo secundario de este informe pero que presentamos en pri- mer lugar de cara a facilitar la interpretación de la revisión sistemática sobre efectividad y seguridad de F1/F1CDx. GAs en cáncer de pulmón y sus tratamientos Un 85-90% de los tumores pulmonares son no microcíticos o NSCLC, y den- tro de este grupo se pueden diferenciar 3 tipos histológicos: epidermoide o de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes44. Se estima que el 60% de los pacientes con NSCLC son diagnosticados en fases avanzadas, bien como tumores localmente avanzados (estadío IIIB) o metastásicos (estadío IV) para los cuales no se dispone de tratamiento cura- tivo, por lo que el pronóstico es muy negativo con tasas de supervivencia a los 5 años inferiores al 10%45,46. El abordaje del cáncer de pulmón empezó a cambiar cuando se descu- brió, en 2003, la primera mutación tratable en el gen EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), que respondía muy satisfactoriamente a los inhibidores del dominio tirosina-quinasa (TKIs) de EGFR. A partir de este descubrimiento la utilización de la información molecular y la medicina personalizada han conseguido un marcado impacto positivo en la evolución de estos pacientes, utilizando dos posibles estrategias terapéuticas: las tera- pias dirigidas contra tumores con mutaciones activadoras y la inmunoterapia. En los últimos años, se ha producido el descubrimiento de un número elevado GAs que llevan al inicio y progresión de este tipo de tumor, y este conocimiento ha facilitado el rápido desarrollo y uso de otras opciones tera- péuticas33,47. Por esto, antes de iniciar el tratamiento del cáncer de pulmón, resulta interesante realizar el estudio molecular que hoy día contempla dos tipos de test diferentes: unos dirigidos a identificar posibles GAs dianas te- rapéuticas y otros que analizan posibles biomarcadores de respuesta a la inmunoterapia. Tanto la FDA como la EMA (European Medicines Agency) han ido aprobando diferentes fármacos, tanto de terapia dirigida como de inmunoterapia, que han supuesto una mejora sustancial en la respuesta tu- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 53 moral y en la supervivencia del paciente asociado a una menor toxicidad en comparación al tratamiento convencional. El estudio del perfil genómico en pacientes con tumores avanzados ofrecería la ventaja de instaurar un tratamiento dirigido de forma rápida evitando el retraso en el inicio de tratamientos que requirieran otras prue- bas diagnósticas, algunas de las cuales podrían ser invasivas, e incluso ayuda- ría a valorar la posibilidad del paciente de desarrollar resistencias a ciertos fármacos48. El cáncer de pulmón es el tumor genéticamente más complejo, tal como ha confirmado el TCGA49,50, y esta heterogeneidad, con células que responden de manera desigual, dificulta el tratamiento. También es preciso tener en cuenta que muy raras veces la terapia dirigida conduce a la curación de los pacientes sino que con el transcurso del tiempo prácticamente la tota- lidad de los tumores desarrolla resistencia a esta terapia, lo que termina oca- sionando recurrencias y la progresión del tumor. El principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer de pulmón, tanto adenocarcinomas como carcinomas escamosos, es el consumo de taba- co aunque un 10-15% de adenocarcinomas pulmonares se da en pacientes no-fumadores51. La gran mayoría de los tumores de pulmón relacionados con oncogenes son adenocarcinomas, un 60% de los cuales presenta drivers oncogénicos. Según recoge TCGA Research Network, los NSCLC son tumo- res con una alta tasa de mutaciones somáticas, con una mediana de 8,7 mut/ Mb en los adenocarcinomas y de 9,7 mut/Mb en los escamosos49,51. En gene- ral, la presencia de alguna GA en los NSCLC suele ser excluyente de la presencia de otras. Existen determinadas características de la población o del tumor que se asocian a CRGAs porque son diana de terapias dirigidas. Los genes más frecuentemente afectados Los genes más frecuentemente afectados en el NSCLC son KRAS (25-30%), EGFR (10-35%), ALK (5-10%), BRAF (2-4%), ROS1 (1-2%) y RET (1-2%)33. Las mutaciones en EGFR se han detectado con más frecuencia en un subgrupo de pacientes con adenocarcinoma bronquiolo-alveolar, mujeres jóvenes no fumadoras y de raza asiática52. En torno al 90% son deleciones en el exón 19 (19 Del) o mutación por sustitución L858R en el exón 21. El re- ceptor EGFR es una glicoproteína transmembrana con actividad TK, codifi- cada por un gen localizado en el cromosoma 7p12. Es uno de los 4 compo- nentes de la familia de receptores TK HER (human epidermal receptor). La activación del EGFR está relacionada con la progresión tumoral maligna, con la inducción de la angiogénesis y con la inhibición de la apoptosis. Entre los reordenamientos en ALK (anaplastic lymphoma quinasa, quinasa del linfoma anaplásico), un 95% de los casos se produce por la rotu- ra de los genes ALK y EML4 (echinoderm microtubule-associated protein-li- ke 4) y su posterior fusión en dirección opuesta: inversión cromosómica en INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 54 2p21 y 2p23. El resultado final es el oncogén de fusión EML4-ALK que in- hibe la apoptosis y favorece la proliferación celular tumoral. La transloca- ción ALK determina la expresión de la proteína de fusión resultante y la señalización aberrante de ALK. Los pacientes con tumores ALK positivos presentan con mayor frecuencia ciertas características: suelen ser pacientes más jóvenes, no fumadores o de bajo consumo tabáquico, mujeres y con pre- dominio del tipo histológico de adenocarcinoma. Muchos progresan desa- rrollando metástasis cerebrales, lo que supone un deterioro en la calidad de vida y un pésimo pronóstico. De hecho, se estima que en el momento del diagnóstico, un 30% de pacientes ya presenta metástasis en el sistema ner- vioso central (SNC). Generalmente, la presencia del reordenamiento ALK es excluyente de la mutación en EGFR. Las mutaciones BRAF (v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B) son mucho más frecuentes en los adenocarcinomas en pacientes jóvenes y fumadores. Aproximadamente la mitad corresponden a la mutación V600E y la otra mitad son mutaciones no-V600E, a diferencia del melanoma donde las mutaciones BRAF son mucho más frecuentes (afectarían a un 40-60% de ca- sos) y de ellas, el 90% son V600E. En los NSCLC con esta mutación es raro encontrar mutaciones EGFR o KRAS, ni reordenamientos ALK y ROS1. Los reordenamientos RET se dan sobre todo en los adenocarcinomas, en pacientes no fumadores o con una historia de mínima exposición al taba- co, y suelen no presentar otras GAs. La fusión más frecuente con KIF5B (en el 72% de los casos). Los tratamientos dirigidos Los primeros TKIs anti EGFR aprobados para NSCLC con mutaciones ac- tivadoras de EGFR fueron erlotinib (Tarceva®) y gefitinib (Iressa®). Ambos son inhibidores reversibles del dominio TK. El TKI de segunda generación afatinib (Gilotrif®) y el de tercera generación osimertinib (Tagrisso®) son inhibidores irreversibles. Afatinib es un potente TKI selectivo e irreversible de la familia ErbB: EGFR (ErbB1), HER2 (ErbB2), ErbB3 y ErbB4, apro- bado por la FDA para ncslc avanzado o metastásico con mutaciones activa- doras del EGFR que no hayan recibido tratamiento previo y para NSCLC escamosos que dejen de responder al tratamiento con QT basada en platino. El dacomitinib (Vizimpro®) está aprobado por la EMA para NSCLC con mutación EGFR. En general, los TKIs anti-EGFR actúan interrumpiendo la transduc- ción de la señal de crecimiento, logrando así su efecto antitumoral y han demostrado incrementos en la supervivencia de pacientes con cáncer de pul- món avanzado o recurrente en comparación a la QT convencional. Están indicados como tratamiento de primera línea en NSCLC metastásico positi- vos a EGFR Del 19 o que presentan la mutación L858R. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 55 Alrededor del 75% de pacientes con esta mutación responde a estos inhibidores, mientras que sólo un 10% de pacientes sin esta alteración en EGFR respondería a estos fármacos. En cualquier caso, con el tiempo los pacientes dejan de responder y la enfermedad tumoral progresa53. Se desco- noce el proceso que ocasiona esta resistencia a los inhibidores de EGFR aunque parece que estarían implicados varios factores, como las mutaciones secundarias del EGFR especialmente la mutación T790M (sustitución de un residuo de metionina por uno de treonina en la posición 790) del dominio quinasa en el exón 20 del EGFR52. Esta mutación es muy rara en pacientes que no han recibido tratamiento con TKIs anti EGFR y, sin embargo, es la causa más frecuente (en un 50%-60% de los casos) de resistencia a dicho tratamiento, de modo que su determinación es obligatoria en los pacientes con recidiva tumoral. Para ello es posible realizar un test de ctDNA, aunque la sensibilidad parece baja, por lo que ante resultados negativos se reco- mienda realizar el estudio sobre biopsia tisular que, además, permite estu- diar otras posibles causas de resistencia como la amplificación MET, obser- vada en un 5% de casos, o amplificaciones HER2, detectadas en casi un 10%44. El osimertinib fue aprobado por la FDA a finales de 2015 para pa- cientes con NSCLC con la mutación T790M resistente a los fármacos an- ti-EGFR. Además, el osimertinib demostró una buena capacidad de pene- tración en SNC y un mejor perfil de toxicidad en comparación a los otros TKIs anti EGFR. Por esto y ante los buenos resultados de respuesta tumoral y alargamiento en la PFS frente a los otros TKIs anti EGFR, en 2018 el osi- mertinib fue aprobado como terapia de primera línea en NSCLC con muta- ciones EGFR, aunque previamente es necesario constatar la presencia de dicha mutación mediante alguna prueba validada a partir del DNA tumoral, bien de tejido o de DNA circulante, entre las cuales estaría F1CDx. Si el tumor progresa pero no se detecta la presencia de la mutación T790M o si el tumor progresa tras recibir osimertinib, el tratamiento están- dar sería la QT basada en platino; también parece efectiva la combinación de atezolizumab+bevacizumab+QT. Otra mutación EGFR es la inserción en el exón 20. Se da en un 4-9% de pacientes con NSCLC. Su presencia parece que confiere resistencia in- trínseca al erlotinib y gefitinib, y el fármaco que ha demostrado mayor efec- tividad en los pacientes que presentan esta mutación es el poziotinib33. Los tumores pulmonares en los que se identifican reordenamientos ALK suelen ser muy sensibles al tratamiento con TKIs anti ALK54 como crizotinib (Xalkori®), ceritinib (Zykadia®), alectinib (Alecensa®) o brigatinib (Alunbrig®), todos ya aprobados para uso en humanos por la EMA, tanto en pacientes no tratados previamente como en los que ya han recibido algún tratamiento previo. Sin embargo, antes de emplear estos fármacos debe con- firmarse la presencia de esta GA por algún método validado. Parece que alec- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 56 tinib y brigatinib tendrían mejores resultados clínicos y, por esto, se prefieren como primera línea, y si el paciente ya ha recibido QT, entonces es el crizoti- nib el fármaco de elección. Si progresan tras TKIs anti ALK, se podrá utilizar otro de los TKIs que no se hubieran utilizado con anterioridad o QT basada en platino o la combinación de atezolizumab, bevacizumab y QT. El crizotinib es un TKIs frente a ALK y MET. Fue el primer fármaco aprobado cuya diana terapéutica era el ALK. Fue aprobado en 2012 por la FDA para el tratamiento del NSCLC avanzado positivo para ALK previa- mente tratado, por las altas tasas de respuesta tumoral e incrementos en la PFS mediana en comparación al tratamiento con pemetrexed y cisplatino o carboplatino55, además de asociar una buena calidad de vida y menos efectos adversos53. Posteriormente, en 2015 se aprobó su uso como terapia de prime- ra línea en pacientes con NSCLC y ALK positivo. Sin embargo, y a pesar de una buena respuesta inicial, es frecuente que en torno al año los tumores desarrollen resistencia al crizotinib. Esta resis- tencia se ha visto asociada a mutaciones ALK en un 20% de los casos y a amplificaciones ALK en un 8%. Para estos casos resistentes al crizotinib se pueden utilizar los TKIs anti ALK de segunda generación (ceritinib, alecti- nib y brigatinib), aunque también un 50% de pacientes termina desarrollan- do resistencias a los mismos, estando indicado para estos casos el uso del lorlatinib, un TKIs anti ALK potente y selectivo de tercera generación. El ceritinib es un inhibidor oral altamente selectivo y potente de ALK, que fue aprobado para su uso en monoterapia en adultos con NSCLC avan- zado ALK positivo, que no hubieran recibido tratamiento previo, por haber demostrado mayor efectividad que la QT convencional. También está indi- cado si ya han recibido crizotinib. Además, frente al estándar de tratamiento del NSCLC avanzado que hoy día es el crizotinib, el ceritinib resulta más efectivo porque permite prolongar el tiempo hasta la progresión, especial- mente cuando existe diseminación cerebral por su capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica56,57. El alectinib obtuvo su aprobación por la EMA en diciembre de 2017, para su uso en pacientes con NSCLC ALK positivo previamente tratados con crizotinib, pero también está aprobado como primera línea en adultos con NSCLC avanzado positivo para ALK. Se trata de un TKI, altamente selectivo de ALK y RET, que inhibe la actividad de la ALK bloqueando las vías de señalización consecutivas, incluidas STAT3 y PI3K/AKT y la induc- ción de la apoptosis. Tiene actividad frente a las formas mutadas de la enzi- ma ALK, incluyendo las mutaciones que ocasionan resistencia al crizotinib. Parece tener una efectividad superior a crizotinib en pacientes con y sin di- seminación al SNC previamente no tratados. No existen comparaciones di- rectas entre alectinib y ceritinib, pero la comparación indirecta ajustada tam- bién sugiere que alectinib tiene una efectividad superior por lo que se VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 57 considera el tratamiento de elección en pacientes con NSCLC positivos para ALK que no hayan recibido tratamiento previo58. Los tumores positivos a reordenamientos ROS1 son altamente sensi- bles al tratamiento con inhibidores ROS159. El crizotinib ha sido aprobado por la FDA y la EMA para tratamiento de adenocarcinomas metastásicos con reordenamientos ROS1 tanto de primera como de segunda línea que no hubieran sido tratados con este fármaco previamente. A pesar de una buena respuesta inicial al crizotinib, en muchos casos se ha descrito que en unos dos años la mayoría de pacientes desarrollará resistencia a este fármaco y ésta se asocia en un 50% a mutaciones ROS1, como G2032R y D2033N. Para estos casos resistentes se propone el cabozantinib (Cometriq®) que es un inhibidor multiquinasa (MKI) aunque su uso puede verse limitado por una baja tolerancia clínica al fármaco. Otra opción en pacientes resistentes es iniciar tratamiento con ceritinib. Cuando se identifica la mutación BRAF V600E se recomienda la ad- ministración de un tratamiento combinado con los inhibidores BRAF/MEK dabrafenib (Tafinlar®) y trametinib (Mekinist®)44. Estos fármacos se dirigen contra dos TK diferentes de la vía RAS/RAF/MEK/ERK. Trametinib es un inhibidor reversible de la activación de MEK1 y MEK2. Dabrafenib es un inhibidor de algunas formas mutadas de las quinasas BRAF y algunas muta- ciones en el gen BRAF, incluyendo BRAF V600E. Los MKIs RET como el cabozantinib, lenvatinib (Lenvima®) y vande- tanib (Caprelsa®) han demostrado su utilidad en tumores pulmonares con reordenamientos RET. Otras GAs poco frecuentes se dan en los genes MET en un 2-3% de los NSCLC y se tratarían con crizotinib o cabozantinib, aunque se están investi- gando otros fármacos como glesatinib o capamatinib; las mutaciones ERBB2, para las que se indicaría tratamiento con trastuzumab o afatinib; alteraciones en el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGFR), amplifi- caciones FGFR1 en cáncer escamoso; mutaciones somáticas en FGFR2 y FGFR3, tanto en adenocarcinoma como en carcinoma escamoso; genes de fusión FGFR3-TACC3 en ambos tipos, especialmente en no fumadores); los reordenamientos NTRK se dan en tan sólo un 0,1% de NSCLC y en ellos estarían indicados larotrectinib o entrectinib. Por último, hay que señalar que las mutaciones KRAS se dan en un porcentaje elevado de NSCLC (25-30%), de las cuales la mayoría se presen- tan en el exón 2. Se trata del subtipo con peor pronóstico y hasta el momen- to actual, estas alteraciones en KRAS no tienen un tratamiento específico por lo que las estrategias terapéuticas en estos pacientes deben centrarse en las demás dianas terapéuticas. Por todo ello, para todos los NSCLC no-escamosos en estadio avanza- do está indicado realizar de forma sistemática un estudio del perfil genómico INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 58 antes de iniciar el tratamiento. Dicho análisis genómico debería incluir las mutaciones EGFR, los reordenamientos ALK y ROS1 y las mutaciones BRAF puesto que su identificación permitiría aplicar una terapia dirigida específica, que ha demostrado un claro beneficio clínico y un cambio sustan- cial en el pronóstico de estos pacientes60,61. En aquellos casos en los que se producen recidivas o progresión tumoral a pesar del tratamiento, el estudio genómico se realizará con la intención de identificar aquellas GAs relaciona- das con la resistencia a los fármacos empleados con la intención de sustituir- los por otros más efectivos. Por el contrario, para los tumores escamosos no estaría indicado reali- zar, de forma rutinaria, el estudio del perfil genómico, salvo en los pocos casos en que este tipo histológico se diera en no fumadores. El carcinoma escamoso también suele presentar una alta carga mutacional50 y gran com- plejidad genómica, pero las GAs que presenta son diferentes a las del ade- nocarcinoma; la mayoría muestra mutaciones TP53, en la familia quinasa FGFR y en varias vías de señalización celular. Parece que sólo seis genes coincidirían entre ambos tipos histológicos: TP53, CDKN2A, PIK3CA, RB1, ARID1A y NF1, aunque los tres primeros se presentan con una frecuencia significativamente mayor en los escamosos51. En algunos tumores de pulmón en estadios avanzados y especialmente en el adenocarcinoma, se han descrito incrementos de la expresión del VEGF. El gen del VEGF está localizado en el cromososma 6p21.3 y resulta fundamental en el proceso de la angiogénesis. El VEGF actúa uniéndose a su receptor (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3) localizado en las células en- doteliales, con actividad TK. Para estos casos se indicaría el tratamiento con inhibidores de la angiogénesis como bevacizumab (Avastin®) o vandetanib (Caprelsa®). El bevacizumab se administra combinado con QT, y no está recomendado para tumores de células escamosas por el alto riesgo de san- grado. En los pacientes con NSCLC metastásicos que no presentan mutacio- nes drivers estaría indicada la inmunoterapia. En estos casos resulta inte- resante disponer de un biomarcador predictivo de la respuesta tumoral a la inmunoterapia. La FDA aprobó en 2015 el uso de los inhibidores de puntos de control. Algunas características moleculares en los tumores se han asociado a una mejor respuesta clínica a los inhibidores del PD-1. La presencia de un TPS (tumor proportion score) ≥50%, es decir, una tinción de la membrana de las células tumorales altamente positiva para PD-L1 (elevada expresión de la proteína PD-L1), detectada por IHQ, se conside- ra un buen biomarcador predictivo para inmunoterapia. De hecho, existe una relación entre la expresión de PD-L1 y la probabilidad de beneficio clínico con los agentes anti-PD-1 y anti-PD-L1, en primera y segunda línea terapéutica. Sin embargo, no siempre la expresión del PD-L1 por sí sola es VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 59 un buen predictor ya que menos de la mitad de los pacientes seleccionados experimentará beneficio clínico y, por el contrario, algunos pacientes con resultados negativos para PD-L1 son potenciales respondedores a esos fár- macos anti PD-1/PD-L1. Para todos los pacientes con NSCLC avanzado está indicado determinar el nivel de expresión del PD-L1 en las células tumorales de cara a establecer un tratamiento con pembrolizumab62. En cambio, para administrar nivolumab o atezolizumab en segunda línea, no es un requisito realizar tests para PD-L1. La presencia de una TMB muy elevada es también un factor predictor independiente de buena respuesta a la inmunoterapia13,63. Se han establecido algunos puntos de corte de TMB, como 16 mut/Mb o 10 mut/Mb64,65. El pembrolizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado de tipo inmunoglobulina G4 que se une al receptor PD-1 con lo que evita la unión y activación de los ligandos PD-L1 y PD-L2. Esto lleva a la activación de respuestas inmunitarias mediadas por las células T contra las células tumo- rales, lo que contribuye a reducir el crecimiento tumoral, es decir, que el pembrolizumab potencia las respuestas de los linfocitos T, incluyendo las respuestas antitumorales, mediante el bloqueo de PD-1. Fue el primer fár- maco aprobado como terapia tumoral agnóstica, es decir, válido para cual- quier tumor con esta GA, porque la presencia de dicha alteración predice la buena respuesta del tumor al fármaco, independientemente de su lugar de origen o del tipo histológico. Está indicado en pacientes de cualquier edad con tumores sólidos metastásicos no candidatos a cirugía que presen- ten MSI-H o dMMR. Los tumores que tienen MSI-H o dMMR presentan dificultad para reparar el daño del DNA por lo que muestran mutaciones con mucha frecuencia. Estos cambios hacen que sea más fácil para las cé- lulas inmunitarias encontrar y atacar el tumor. El pembrolizumab está aprobado como tratamiento de primera línea para pacientes con NSCLC metastásico, tanto para los escamosos como no escamosos, en ausencia de mutaciones intervenibles y con positividad para PD-L1 en el estudio IHQ siempre que el porcentaje de expresión en las células tumorales sea ≥50%, en pacientes con una esperanza de vida de al menos 3 meses y un estado funcional ≤1 según la escala ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group)33,44. Este tratamiento se asocia a mayor respuesta tumoral, mayor supervivencia global y PFS. No obstante, no todos los pacientes se benefi- cian de este fármaco y, además, sólo un tercio de pacientes con NSCLC avanzado presenta niveles de PD-L1 ≥50%66. Para aquellos tumores que presentan mutaciones de EGFR o translo- caciones ALK, el pembrolizumab podría estar indicado siempre que hayan recibido previamente tratamiento con un TKIs específico. En los tumores con un TPS de PD-L1<50% el tratamiento depende de si son escamosos o no escamosos. Ver figura 4. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 60 Figura 4. Tratamiento del NSCLC en estadio IV sin GAs intervenibles. Tomada de la guía clínica publicada por la SEOM en 201966. El nivolumab es un anticuerpo anti-PD-1 aprobado por la FDA como segunda línea de tratamiento para NSCLC no escamoso en diciembre de 2014 y para el escamoso en marzo de 2015. En octubre de 2016 la FDA apro- bó el uso del inhibidor de PD-L1 atezolizumab para el tratamiento de NS- CLC metastásico refractario a QT basada en platino. En pacientes con NSCLC avanzado, tanto escamosos como no-escamo- sos, y alta TMB (>10 mut/Mb) una opción terapéutica de primera línea es nivo- lumab, combinado con ipilimumab independientemente de los niveles de PD- L1, porque se asocia a mayor PFS y menor toxicidad que la QT64. Ambos son inhibidores de puntos de control con mecanismos de acción complementarios. A pesar de que se ha ido descubriendo un mayor número de mutacio- nes intervenibles en los tumores pulmonares acompañado de un desarrollo de fármacos dirigidos e inmunoterapia frente a dichas GAs, en la literatura se reconoce que no existe tratamiento para casi la mitad de los NSCLC, in- cluyendo aquellos con mutaciones KRAS. En el seguimiento de los NSCLC hay que valorar la respuesta tumoral al tratamiento, estudiar si aparecen nuevas GAs diferentes a las encontradas en el tumor primario y analizar si posibles progresiones tumorales son debi- das a resistencia adquirida frente a los fármacos administrados. Para este seguimiento se puede analizar el perfil genómico de muestras de DNA libre circulante, que se considera más adecuado que el uso de células tumorales circulantes. Por ejemplo, como se mencionó anteriormente, para estudiar la presencia de la mutación T790M, aunque si el resultado fuera negativo esta- ría indicado realizar el estudio sobre tejido tumoral de biopsia por el riesgo de falsos negativos en los resultados del estudio en plasma. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 61 GAs en cáncer de mama y sus tratamientos Tipos de cáncer de mama El cáncer de mama se considera una enfermedad heterogénea en la que pueden diferenciarse varios tipos de tumores según los receptores presentes en las células tumorales y esto tendrá repercusión terapéutica. Según la cla- sificación molecular establecida por el consenso internacional de expertos reunidos en St. Gallen en 201367, el cáncer de mama se clasificaba en los siguientes subtipos: 1) Tumores con receptores hormonales positivos (HR+): el subtipo lu- minal A es positivo a receptores de estrógenos (ER) y receptores de proges- terona (PR), negativo a HER2 y presenta niveles bajos de Ki67; responde bien a terapia hormonal y es el de mejor pronóstico. El subtipo luminal B incluye el tipo HER2 negativo (ER+, HER2 negativo y al menos uno de los siguientes Ki67 alto o PR negativo) y otro tipo, HER2+ (ER+, HER2+ para cualquier Ki67 o PR); requieren tratamiento hormonal y QT; tiene peor pro- nóstico que el luminal A, pero mejor que los otros dos tipos. Ki67 determina la actividad proliferativa del cáncer de mama. No exis- te acuerdo general sobre el punto de corte de Ki67 que discrimine entre va- lores altos y bajos, aunque se suele considerar que el punto de corte estaría entre 10-20%68. 2) Tumores HER2 positivos: constituyen el 15-20% de los cánceres de mama. Sobreexpresan la proteína HER2/neu en la superficie de las células tumorales por amplificación del gen HER2. El proto-oncogén HER2 (ERBB2 o erbB-2/neu) está ubicado en el brazo largo del cromosoma 17 y codifica una glicoproteína transmembrana de 185 kDa que tiene estructura de EGFR, con un dominio extracelular y un dominio intracelular con acti- vidad TK. Cuando los factores de crecimiento se unen a los receptores se activan genes específicos involucrados en regulación de la proliferación ce- lular, la motilidad y la apoptosis69. Por tanto, dicha sobreexpresión ocasiona un crecimiento descontrolado de las células tumorales. Se trata de un cán- cer de crecimiento más rápido, más invasivo y con mayor probabilidad de recidiva y de diseminación. La detección de HER2 también tiene implica- ciones pronósticas y predictivas. Su valor pronóstico adverso radica en que la presencia de la amplificación del gen se asocia a menor supervivencia y tiempos más cortos hasta la recurrencia. Además, su presencia predice una menor respuesta tumoral o resistencia al tratamiento convencional. Por otro lado, se relaciona con una angiogénesis acelerada y una reducción de la apoptosis celular. Estos tumores son ER y PR negativos. Se dan con más frecuencia en mujeres jóvenes y suelen ser muy agresivos, aunque el uso de la terapia con anti-HER2 ha cambiado sustancialmente el pronóstico de estas pacientes. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 62 3) Subtipo basal o triple negativo: constituye el 10-20% del total. No presentan ni receptores hormonales ni amplificación del HER2, por lo que no son sensibles a terapia hormonal ni a anti-HER2. En ellos, el tratamiento utilizado es la QT neoadyuvante, pero un 70% de ellos no responde bien de modo que presentan recurrencias y baja supervivencia a largo plazo. El Ki67 determinado por IHC es un buen marcador de proliferación celular con va- lor pronóstico en estas pacientes. En general, presentan un crecimiento muy rápido y suelen ser agresivos, con mayor frecuencia presentan metástasis a nivel visceral y del sistema nervioso central70. Estos tumores son más fre- cuentes en mujeres con mutaciones del gen BCRA1/2 (breast cancer 1/2). Genes y GAs más frecuentes en cáncer de mama A partir de la aparición de la NGS la clasificación del cáncer de mama se ha modificado en función del driver molecular identificado. Estos drivers pue- den ser receptores de factores de crecimiento (ERBB2, EGFR, FGFR1), vías señalización como PI3K/AKT/mTOR, reguladores del ciclo celular (CCND1, CDK4, RB1) y reparadores del DNA (BRCA1/2)71. Las técnica de NGS han permitido identificar los siguientes genes afec- tados con más frecuencia en el cáncer de mama: PIK3CA (31-41%), TP53 (30-36%), KTMC2 (7-11%), GATA3 (10-11%), MAP3KI (7-10%) y CDH1 (10-11%)68. La presencia de múltiples GAs en el mismo tumor se ha asocia- do a inestabilidad genética y peor pronóstico. La inestabilidad cromosómica y la heterogeneidad tumoral se han asociado a peores resultados clínicos y menor respuesta tumoral al tratamiento en gran parte de tumores sólidos, incluyendo el cáncer de mama, y en hematológicos72. La vía de señalización que con más frecuencia presenta GAs en el cán- cer de mama es la PI3K/AKT/mTOR, vía implicada en la supervivencia ce- lular y la proliferación. En torno a un 30% de pacientes con cáncer de mama tiene mutaciones en PIK3CA73. Entre un 10-17% de cánceres de mama presentan amplificación del FGFR1, que se asocia a cáncer de mama más invasivo, a un peor pronóstico, a menor supervivencia libre de enfermedad y a mayor resistencia a la hor- monoterapia en aquellos ER positivos74. En torno al 5% de los cánceres de mama se asocian a la presencia de mutaciones germinales en los genes BRCA1 y BRCA2, que se transmiten de forma hereditaria y predisponen a desarrollar cáncer de mama (riesgo cer- cano al 60% frente al 12-13% de la población general) junto a un mayor riesgo de desarrollar cáncer de ovario. Las pacientes con mutaciones en BRCA1 desarrollan con más frecuencia tumores triples negativos. El 5-10% de las mujeres con cáncer de mama menores de 35 años son portadoras de alguna mutación genética. Se asocia a un incremento en las mutaciones BRCA1 y BRCA2 (en un 15%), en la GAs en ERBB2 y los tri- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 63 ples negativos75. Por ello en este grupo etario está indicado realizar estudio genético. Las portadoras de BRCA desarrollan tumores muy agresivos y pre- coces. Las mutaciones ERBB2 se han descrito en numerosos tumores sóli- dos, incluyendo el cáncer de mama avanzado y/o metastásico. Según las ba- ses de datos cBioPortal https://www.cbioportal.org/ (TCGA)73,76 https://www. cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga y COSMIC (Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer)77, las mutaciones ERBB2 en cáncer de mama se dan con una frecuencia de entre 1,7%-2,0%. Esta mutación no suele detectarse mediante IHC ni FISH pero sí mediante secuenciación del DNA. Por tipos, las GAs más frecuentes en el subtipo luminal A se dan en PI- K3CA (45%) seguidas de GAs en MAP3KI, GATA3, TP53, CDH1 y MA- P2K4. En el subtipo luminal B, las más frecuentes se dan en TP53 (29%) y PIK3CA (29%); en el HER2 positivo, la amplificación HER2 (80%), TP53 (72%) y PIK3CA (39%); y en el triple negativo, mutaciones TP53 (80-90%)73. Algunos tipos histológicos asocian algunas GAs concretas o en mayor frecuencia. En el carcinoma lobular es frecuente la mutación en el gen CDH1 que codifica la proteína E-cadherin a diferencia del carcinoma ductal invasivo que no presenta alteraciones en este gen. En el cáncer de mama metaplásico los estudios con IHC y FISH han confirmado que la mayoría son triples negativos. Este tipo de tumor muestra peor pronóstico que los adenocarcinoma ductales o lobulares, con mayor quimiorresistencia y más agresividad. De ahí la importancia de realizar estudio CGP con el fin de en- contrar posibles dianas terapéuticas. El carcinoma mucinoso de mama es una variante de buen pronóstico en general, de bajo grado tumoral, ER+ y HER2 negativo, pero en algunos casos puede presentar un curso clínico agresivo, con mala respuesta al tratamiento. Para estos casos, se plantearía la realización de un CGP con el fin de descubrir GAs candidatas a tratamien- tos dirigidos que ofrezcan un beneficio a la paciente. El cáncer de mama in- flamatorio se suele asociar a HR negativos; entre un 40-60% tiene sobreex- presión HER2 por amplificación del ERBB2 y en un 15-22% de pacientes se ha descrito amplificación del gen MYC, que se ha asociado a un desarrollo más temprano, mayor agresividad tumoral y peor pronóstico. Tratamientos para el cáncer de mama La terapia hormonal o terapia endocrina se considera el tratamiento de elec- ción para los tumores positivos a HR por su efecto antitumoral y por presen- tar un buen perfil de seguridad. El tratamiento de primera línea terapéutica en mujeres postmenopáusicas se basaría en los inhibidores de aromatasa (AIs) no-esteroideos como anastrozol, letrozol, que reducen la síntesis de estrógenos y resultan más efectivos que el tamoxifeno. También como pri- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 64 mera línea puede utilizarse fulvestrant (Faslodex®), que es un antagonista competitivo del ER cuyo mecanismo de acción está asociado con la regula- ción a la baja de los niveles de la proteína del receptor de estrógenos. Pero si es posible se recomienda combinar AIs no esteroideos con inhibidores CDK4/6 (palbociclib, ribociclib o abemaciclib). Sin embargo, en torno al 30-40% de pacientes no responde al trata- miento hormonal debido a resistencias intrínsecas o adquiridas, que supo- nen un importante reto en el manejo de las pacientes. Si tras los AIs no-este- roideos el tumor progresa, la segunda línea terapéutica hormonal a utilizar serían los AIs esteroideos como exemestane (Aromasin®) o el fulvestrant. Se han descrito algunas GAs implicadas o relacionadas con el desarrollo de la resistencia al tratamiento endocrino. Entre ellas estaría la activación de la vía PIK3/AKT/mTOR. Para estos casos, se podría administrar anastrozol/ exemestane junto con everolimus pues su combinación ha demostrado in- crementos de la PFS junto a respuestas tumorales parciales o incluso com- pletas78,79. El everolimus ha sido aprobado para el tratamiento de cáncer de mama avanzado recurrente o que haya progresado tras tratamiento con AIs no esteroideos en mujeres postmenopáusicas con HR positivos y HER2 negativo, en combinación con exemestane74,80. Sin embargo, no existen, por el momento, biomarcadores que identifiquen aquellas mujeres que se van a beneficiar de tratamiento con inhibidores mTOR, ni con inhibidores CDK4/6. Estos últimos presentan un mayor rango de seguridad que los inhi- bidores mTOR por lo que se recomienda su uso como primera línea y si no siempre en la segunda y tercera líneas terapéuticas. Además, la presencia de mutaciones en PIK3CA en cáncer de mama HER2+ se ha relacionado con mayor resistencia a las terapias anti-HER2, por ello, en tumores con ampli- ficación ERBB2 y mutación PIK3CA se propone el tratamiento combinado de inhibidores HER2 e inhibidores de la vía PI3K. Y en ocasiones, cuando el tumor es HER2+ también se añadiría también fulvestrant. También se puede utilizar fulvestrant en combinación con inhibidores CDK4/6 aprobados en 2016 en mujeres que ya hayan recibido tratamiento hormonal previo para tumores HR+ y HER2 negativos81. La presencia de mutaciones ERBB2 asociadas a mutaciones CDH1 (E-cadherina) también se han relacionado con resistencia al tratamiento hormonal en los tumores ER+. Para estos casos parece que asociar fulves- trant y neratinib (inhibidor irreversible de quinasa) ayudaría a alcanzar una buena respuesta tumoral. La amplificación TOP2 suele coexistir con una amplificación ERBB2 y esta combinación parece predecir buena respuesta a las antraciclinas. Otra mutación asociada a resistencia a terapia hormonal (exceptuando al fulvestrant) es la mutación ESR1. Esta mutación ESR1 no se da en los tumores primarios de mama sino en los que ya han recibido tratamiento con VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 65 AIs, encontrándose con una presencia variable en el 12-55% de casos, y en los metastásicos ER+. Para estos casos, una dosis alta de fulvestrant y ta- moxifeno tendrían un efecto beneficioso con un incremento de la PFS82. Los casos en que la mutación ESR1 se ha detectado en tumores primarios antes de iniciar el tratamiento hormonal, se han asociado a recidivas tempranas. En cambio, los reordenamientos que ocasionan genes de fusión ESR1 y am- plificación de ESR1 se han visto implicados en la resistencia a inhibidores de aromatasa. Si el tumor HR+ termina haciéndose resistente a la terapia endocrina, la QT sería una opción. Entre los posibles fármacos a utilizar se incluirían antraciclinas, taxanos, capecitabina o gemcitabina. Para los tumores triples negativos, el tratamiento estándar es la QT, con antraciclinas y taxanos u otros quimioterápicos como capecitabina o vinorel- bina, dependiendo del fármaco previo utilizado. Otros fármacos van dirigi- dos contra el VEGFR implicado en la angiogénesis como bevacizumab o sutinib (Sutent®). Otros fármacos en estudio para estos tumores triples ne- gativos son los dirigidos al EGFR como el cetuximab (Erbitux®), porque se ha observado que un porcentaje elevado de estos tumores sobreexpresan dicho receptor. Otro grupo de fármacos utilizados en tumores triples negativos con mutaciones BRCA1/2 y en los HER2 negativos son los inhibidores de la poli-ADP-ribosa-polimerasa (PARP). Esta enzima PARP repara el daño del DNA celular, incluido el daño ocasionado por la QT. Los inhibidores PARP, como olaparib, niraparib y talazoparib, tienen como objetivo interferir con esta enzima para impedir que las células cancerígenas reparen el DNA y con ello aumenta la susceptibilidad del tumor maligno a la QT además de impe- dir que se haga resistente a la QT. Estos inhibidores se administran junto a la QT. Para los tumores HER2 positivos, el tratamiento inicial son los an- ti-HER2 junto a QT. La amplificación ERBB2 y la correspondiente sobreex- presión de la proteína HER2 se asocian una mayor sensibilidad a la terapia dirigida con anti-HER2, incluyendo los anticuerpos trastuzumab (Hercep- tin®) y pertuzumab (Perjeta®) e inhibidores de quinasa tanto reversibles (la- patinib, Tykerb®) como irreversibles (afatinib y neratinib, Nerlynx®) y a inhi- bidores duales EGFR/HER2 lo que resulta interesante dada la ausencia de respuesta al tratamiento quimioterápico y hormonal convencional. Se reco- mienda un bloqueo doble con trastuzumab y pertuzumab y taxanos como tratamiento de elección de primera línea. Y generalmente se deja el T-DM1 (ado-trastuzumab emtansina, Kadcyla®) para utilizarlo como segunda línea. También para tumores en los que se hayan identificado mutaciones ERBB2 estarían indicados los anti-HER2. Los tumores con mutaciones HER2 fueron clasificados inicialmente como HER2 negativos, por la falta INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 66 del aumento en el número de copias (detectadas por FISH) o por la falta de sobreexpresión de la proteína HER2 (detectada por IHC). Entre los tumo- res ERBB2 que se han hecho resistentes a la terapia anti-HER2, la mutación en la vía PIK3CA suele ser la GA más frecuente y para estos casos se indi- caría el tratamiento con inhibidores mTOR, como el everolimus83. Para pa- cientes con mal pronóstico y refractarios a tratamiento convencional, la de- tección de mutaciones HER2 permitiría tomar decisiones terapéuticas relevantes para el manejo del paciente. Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado de tipo IgG1 que se une de manera selectiva y eficiente al dominio extracelular del recep- tor HER2. Fue aprobado por la FDA en 1998 para el tratamiento de pacien- tes con cáncer de mama HER2+ avanzado por su eficacia en combinación con citotóxicos. Se comprobó una asociación entre el número de copias del ERBB2 y la sensibilidad al tratamiento con trastuzumab y mayor supervi- vencia global84. Posteriormente, recibió la aprobación para tratamiento en estadio precoz, también como terapia adyuvante y en 2013, como neoadyu- vante en combinación a pertuzumab. Pertuzumab es un anticuerpo monoclonal específico frente a HER2 y otras proteínas de la familia EGFR. Fue aprobado por la FDA en 2012 para el tratamiento de cáncer de mama HER2+ metastásico en combinación a trastuzumab y docetaxel. En 2013, la FDA aprobó esta combinación de fár- macos como terapia neoadyuvante, y en 2017 se aprobó el pertuzumab como adyuvante junto a trastuzumab y QT. En 2013, la FDA aprobó el T-DM1 que combina trastuzumab con el citotóxico DM1, para tumores metastásicos de mama que hubieran progre- sado tras trastuzumab y taxanos, y tras haber demostrado un ligero incre- mento en la supervivencia frente a lapatinib con capecitabina. El lapatinib aprobado en 2008, es un inhibidor reversible de quinasa en combinación con capecitabina (Xeloda®) para el tratamiento de cáncer de mama metastásico que hubiera progresado tras terapia con trastuzumab y taxanos. También se puede usar el lapatinib junto a letrozole. El neratinib fue aprobado por la FDA en 2017 como inhibidor irreversible de quinasa frente a HER2 y EGFR, para tratamiento de cáncer de mama HER2+ en estadios precoces tras tratamiento con trastuzumab post-operatorio. Para los tumores de mama con amplificación FGFR1, el tratamiento dirigido indicado son los inhibidores de la familia FGFR como pazopanib, regorafenib o ponatinib. Y para los tumores con mutación en el gen TP53, que se asocian a peor pronóstico, hasta la fecha no existen terapias aproba- das dirigidas contra esta mutación. La expresión de PD-L1 en las células tumorales suele presentarse en los tipos basal y HER2+. Aunque se ha asociado a mal pronóstico clínico, parece que responden bien a la inmunoterapia con agentes anti-PD-1 y an- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 67 ti-PD-L1. En 2019, la FDA ha aprobado la combinación de atezolizumab con paclitaxel para el cáncer de mama triple negativo localmente avanzado y metastásico. Además, es el único fármaco aprobado para cáncer de mama positivo a PD-L1. Pembrolizumab está aprobado por la FDA para trata- miento de cáncer de mama metastásico o no candidato a cirugía que tengan MSI-H o dMMR. GAs en cáncer colorrectal y sus tratamientos En el momento del diagnóstico inicial de los pacientes con CCR, se estima que entre un 20-25% ya presenta metástasis85. Cuando la enfermedad está diseminada, las opciones terapéuticas con el tratamiento convencional son escasas, de ahí el interés surgido a raíz del mayor conocimiento de las GAs relacionadas con el origen y progresión tumoral y la posibilidad de ofrecer terapia dirigida a estos pacientes con enfermedad avanzada y refractarios a otros fármacos. TCGA Network86 encontró que un 19% de los CCR presentaba muta- ciones, deleciones o amplificaciones del gen ERBB2. Los tumores metastási- cos de colon (mCCR) con amplificación ERBB2 suelen originarse en colon rectosigmoideo. Esta GA y la sobreexpresión del HER2 en pacientes con CCR no se han asociado a peor supervivencia, a diferencia de lo que ocurre en pacientes con cáncer de mama, donde un 15-20% de casos son HER2+ y sí se asocian a un mal pronóstico y a una mayor probabilidad de recurrencia tumoral. En general, los mCCR con amplificación del ERBB2 no se acompa- ñan de mutaciones RAS/BRAF y se podrían beneficiar del tratamiento diri- gido con anti-EGFR (cetuximab y panitumumab) en combinación con tera- pia citotóxica. El tratamiento de primera línea indicado para pacientes con mCCR en colon izquierdo y sin mutaciones en el gen RAS incluye la combinación de QT citotóxica convencional con fármacos dirigidos frente al dominio extra- celular de EGFR por sus buenos resultados en cuanto a supervivencia glo- bal y PFS. La QT utilizada para CCR incluye diversas combinaciones posi- bles de fármacos: FOLFIRI (5-fluorouracilo, leucovorín e irinotecan), FOLFIRINOX (5-fluorouracilo, leucovorín, irinotecan y oxaliplatino), FOLFOX (5-fluorouracilo, leucovorín y oxaliplatino). Para los mCCR en colon derecho y sin mutaciones en el gen RAS ni BRAF el tratamiento reco- mendado es QT combinada con bevacizumab31. Este fármaco antiangiogéni- co fue aprobado por la FDA en 2004 para ser utilizado junto con QT como primer tratamiento en CCR avanzado. Por el contrario, si el tumor tiene mutaciones RAS, en KRAS o NRAS (que se dan en un 50% de los mCCR) el hecho de añadir los anti-EGFR no aportaría beneficios al paciente. En un 8-15% de los mCCR se han descrito INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 68 mutaciones BRAF, especialmente V600E. En dos tercios de estos pacientes, el tumor suele originarse en colon derecho y menos de un tercio presenta MSI. Estas mutaciones BRAF suelen asociarse a mal pronóstico, además de ser un biomarcador predictivo a falta de respuesta a los inhibidores EGFR87. A diferencia de los melanomas con mutación BRAF, el CCR que presenta estas mutaciones no suele responder al vemurafenib85. Esto parece relacio- nado con la presencia de una upregulation de la vía EGFR, que conllevaría resistencia al inhibidor BRAF por altos niveles de expresión del factor de crecimiento hepático (HGF) por parte de las células normales del colon que provocarían una activación del cMET. Sin embargo, en el ensayo clínico88 con pacientes con mCCR metastásico con la mutación BRAF V600E se des- cribió cierta respuesta tumoral al tratamiento combinado de dabrafenib con trametinib, encontrando que el 21% de paciente presentaron respuesta par- cial o incluso mejor, incluyendo un 2% de respuesta completa, durante más de 36 meses; y en un 56% de pacientes se consiguió la estabilización tumoral. También se ha observado que la presencia de mutaciones en otros ge- nes implicados en la vía de señalización EGFR, como PIK3CA y PTEN, podrían asociarse a escasa respuesta a los anti-EGFR. En el CCR, las muta- ciones PIK3CA se dan en un 10-20% del total y se asocian a determinadas características como la ubicación proximal del tumor, la MSI y la mutación KRAS, además de relacionarse con un mal pronóstico. Además, algunos da- tos sugieren que la activación MET estaría implicada en la resistencia al tratamiento anti-EGFR89. Para estos casos, e independientemente de la loca- lización del tumor, se indicaría QT con bevacizumab31. Las mutaciones KRAS en los exones 9 y 20 se asocian a resistencia a cetuximab. Por otro lado, según TCGA86, el 16% de los CCR son hipermutantes, es decir, que presentan una elevada tasa de mutaciones en el DNA que inducen a la producción de neoantígenos en la superficie de las células y estos neoan- tígenos serían dianas para la inmunoterapia. En el CCR se ha observado una fuerte asociación entre una MSI-L o MSS y una buena respuesta a la QT adyuvante, con un incremento significativo en la duración de la superviven- cia global y en las tasas de PFS a los 5 años, mientras que aquellos tumores con MSI-H no serían susceptibles a la QT y tienen alto riesgo de recurren- cia86,90. Estos tumores MSI constituyen un 4-8% de todos los mCCR y un 30% de ellos asocian la mutación BRAF V600E. Para estos mCCR con MSI-H la opción sería la inmunoterapia. Por este motivo es importante com- probar el estatus de microsatélites o dMMR antes de comenzar el trata- miento con anti-PD-1 o anti-PD-L191,92. Entre estos inmunoterápicos se pue- den utilizar pembrolizumab o nivolumab (anti-PD-1) o ipilimumab (anti-CTLA-4). En julio de 2018, la FDA aprobó la combinación de ipilimu- mab y nivolumab para el tratamiento de estos tumores si previamente ha- bían sido tratados con QT. Ya en 2017 la FDA había aprobado el uso de VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 69 pembrolizumab para cualquier tumor dMMR o MSI-H, independientemen- te de su localización; este fue el primer caso de aprobación de un fármaco por la FDA basándose únicamente en la presencia de una característica ge- nética. El análisis sobre muestras tisulares tumorales FFPE se considera el gold standard diagnóstico, pero el análisis de ctDNA presenta una alta con- cordancia de resultados, de modo que se aceptaría su uso cuando no se dis- pone de muestras suficientes de tejido o si ello implica someter al paciente a pruebas invasivas o de riesgo. GAs en cáncer de ovario y sus tratamientos Sólo un 15-20% de los pacientes con cáncer de ovario son diagnosticados de forma temprana mientras que la mayoría presenta enfermedad en estadios FIGO III o IV en el momento inicial del diagnóstico y en estos casos la su- pervivencia a 5 años no alcanza el 30%32,93,94. El cáncer de ovario es el tumor ginecológico que ocasiona mayor mortalidad y la quinta causa de muerte por cáncer en mujeres. El mayor conocimiento molecular ha supuesto una importante modifi- cación en el manejo terapéutico y pronóstico95. Casi en el 100% de los carci- nomas serosos de alto grado se dan mutaciones en el gen TP53 y en un 20% se dan mutaciones en los genes BRCA1/2. Aquellos con mutaciones en BRCA1/2 suelen tener un mejor pronóstico96. En los carcinomas serosos de bajo grado, no se dan alteraciones en TP53 y la frecuencia de mutaciones en BRCA1/2 es inferior al 10%. En cambio, presentan otras GAs no identifica- das en los de alto grado como alteraciones en KRAS (en el 41% de los tumo- res), HER2 (en 8%) y BRAF (en 6%). En los carcinomas endometrioides, de células claras y mucinosos tampoco se presentan mutaciones TP53 pero sí se han identificado diversas mutaciones en KRAS, BRAF, PIK3CA, ARIDIA y HER2, en porcentajes variables97. Algunas GAs en los tumores de ovario se han asociado a resistencia primaria a la QT basada en platino y a mayor probabilidad de recurrencia tumoral; entre ellas destacarían las mutaciones BRCA1/2, la inactivación de genes supresores de tumores como RB1, NF1 o PTEN, y la amplificación CCNE1. La mayoría (60-80%) de los carcinomas serosos de alto grado responde bien a la QT convencional basada en platino95. En los estadios avanzados, la QT consiste en la combinación de carboplatino y paclitaxel o, si este último no puede administrarse, se podrían combinar el carboplatino con PLD (pe- gylated liposomal doxorubicin). En los serosos de bajo grado, la terapia an- tiangiogénica con bevacizumab junto con QT (carboplatino y paclitaxel) se ha mostrado efectiva como tratamiento de primera línea y para las recurren- cias en el cáncer de ovario avanzado97. No existen biomarcadores molecula- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 70 res predictivos de buena respuesta al bevacizumab pero parece que otros tipos histológicos presentarían una menor respuesta a este fármaco. Se estima que entre el 50-90 % de las pacientes con carcinomas avan- zados sufre recurrencias de la enfermedad en los primeros 5 años después del diagnóstico97. Para el tratamiento de estos casos recurrentes hay tener en cuenta la situación clínica de la paciente, el tipo histológico del tumor, el tratamiento previo administrado y el tiempo de duración de la respuesta al mismo, y la presencia o no de mutaciones BRCA1/2, que son diana para el tratamiento con inhibidores PARP como olaparib, niraparib o rucaparib98. Estos fármacos actúan inhibiendo una enzima implicada en la reparación del daño del DNA por lo que el DNA de las células tumorales no se repara- rá favoreciendo una reducción en el crecimiento tumoral. Además de utili- zarse para el tratamiento de las recurrencias, los inhibidores PARP también están aprobados como terapia de mantenimiento cuando el tumor de ovario ha alcanzado la remisión tras QT basada en platino99. Por ello, se recomienda estudiar la presencia de estas mutaciones en BRCA en todas las pacientes con cáncer de ovario no-mucinoso95. En las pacientes con recurrencia tumo- ral que no habían respondido a la QT de primera línea, se utilizarán otros agentes como paclitaxel, PLD, topotecan o gemcitabina, con o sin bevacizu- mab. En los carcinomas de células claras es frecuente encontrar deficiencia dMMR, lo que explicaría su buena respuesta a los inhibidores PD-1 como el nivolumab o pembrolizumab. GAs en melanoma y sus tratamientos El melanoma constituye un tumor maligno genéticamente muy heterogé- neo, con multitud de subtipos caracterizados por la activación de una o más vías de señalización lo que favorece a la proliferación celular, el incremento en la angiogénesis y la diseminación metastásica. En torno a un 20-25% de pacientes presenta un melanoma en estadio avanzado (IIC o metastásico). Las opciones terapéuticas en estos pacientes son muy reducidas y el pronós- tico pésimo, con una supervivencia de escasos meses. El tratamiento sistémi- co convencional incluía dacarbazina combinada con interleucina-2 o con fotemustina, pero las tasas de respuesta resultaban bajas y muy limitadas en el tiempo. La utilización de las NGS ha permitido estudiar el perfil genómico completo de los melanomas e identificar GAs drivers susceptibles de terapia dirigida así como otras GAs implicadas en las resistencias a determinados fármacos de modo que sus resultados contribuyen a establecer un trata- miento más adecuado. Las vías de señalización celular más frecuentemente afectadas en el melanoma son la vía de la proteina-quinasa activada por mitógenos (MAPK; NRAS-BRAF-MEK-ERK) que se encuentra activada en la mayoría de los VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 71 melanomas, la vía PTEN-PI3K-AKT y p16INH4a-CCND1-CDK4-RB1. En un 20-40% de melanomas se ha encontrado una pérdida o reducción signifi- cativa de la expresión de PTEN, y tanto la deleción como la mutación de PTEN conducen a la activación de la vía PI3K-AKT-mTOR. En torno al 50% de los melanomas presenta deleción de p16INK4 y en un 10%, una mutación. Las GAs más frecuentes en el melanoma afectan a los siguientes genes: BRAF (50%), TP53 (23%), NRAS (20%), CDKN1A (20%), CDK4 (6%) y CCND1 (6%)100. Las mutaciones de BRAF y NRAS son más frecuentes en melanomas relacionados con una exposición intermitente al sol. En el mela- noma uveal, la vía MAPK está sobreactivada en el 80% de los casos, mien- tras que son muy infrecuentes las mutaciones de BRAF, NRAS y Kit. En los melanomas acrales, los que se originan en mucosas y en piel expuesta de forma crónica al sol, la mutación más frecuente es la del gen Kit (15-40%), y en menos del 10% se presentan mutaciones de BRAF y NRAS. Kit es un receptor transmembrana con actividad TK. La unión con su ligando induce la dimerización y la autofosforilación del receptor, lo que provoca la acti- vación de las vías de señalización de MAPK y PI3K-AKT que median la supervivencia y la proliferación celular. TCGA estableció cuatro subtipos genómicos principales de melano- mas cutáneos denominados BRAF, RAS (N/H/K), NF1 y triples negativos101. Las mutaciones oncogénicas en BRAF provocan la activación de la vía RAF-MEK-ERK, que estimula el crecimiento descontrolado de las células. La desregulación de la señalización BRAF ha demostrado ser clave en el desarrollo de los melanomas. Las mutaciones BRAF se han encontrado en un 50% de los melanomas, siendo la mutación BRAF V600E la más fre- cuente (en casi un 90% de todas). Esta mutación consiste en la sustitución de valina por ácido glutámico en la posición 600 BRAF y sería responsable de la proliferación celular y la resistencia a la apoptosis. Otras mutaciones son V600K (15-25%), V600R y V600D. Por esto, en todos los pacientes con melanoma está indicado realizar la determinación de BRAF, especialmente del procedente de metástasis102. En caso de no identificarse esta mutación, se buscarían otras GAs como mutaciones NRAS o c-Kit. Tal como ya recomend- aba la European Society for Medical Oncology (ESMO) en su guía del 2015102, determinar la presencia de las mutaciones BRAF, NRAS o c-Kit es algo imprescindible para el correcto manejo de pacientes con melanoma. Los melanomas que tienen mutaciones RAS, NF1 y los triples negati- vos presentan una sobreexpresión de AKT3, que es una proteín-quinasa que afecta a las vías de señalización MEK y mTOR, por lo que los inhibidores de las vías de señalización MEK y PI3K/AKT/mTOR podrían ser efectivos para estos melanomas. Las proteínas RAS pueden activar las vías de señali- zación de MAPK y PI3K. En un 20% de los melanomas se dan mutaciones INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 72 de NRAS, mientras que las mutaciones HRAS y KRAS se dan en tan sólo un 1% y 2%, respectivamente. Generalmente, la presencia de alteraciones en NRAS es excluyente de alteraciones en BRAF. Las mutaciones adquiridas en NRAS se han descrito en un 15-30% de pacientes con melanoma refrac- tario a inhibidores BRAF y parece que mediaría en la resistencia a estos fármacos103,104. Además, el melanoma es un tumor altamente inmunogénico, es decir, que desencadena con facilidad una respuesta inmune contra las células tu- morales, pero estas células neoplásicas consiguen escapar al control inmuni- tario. El mayor conocimiento de las GAs asociadas al melanoma ha contri- buido al desarrollo de algunas terapias dirigidas y, especialmente, de la inmunoterapia basada en inhibidores de puntos de control, lo que ha su- puesto un cambio radical en la supervivencia de estos pacientes105,106. Se ha descrito que en pacientes con melanoma, los agentes que actúan frente al receptor PD-1, como el nivolumab y pembrolizumab, y los fármacos frente a su ligando PD-L1, como el atezolizumab, inducen respuestas objetivas clíni- cas en un 25-45% y un mayor tasa de supervivencia a los 5 años que otras terapias36. En el melanoma metastásico, su aplicación se ha asociado a incre- mentos en la tasa de respuesta global107. Por ello, estudiar la posible sobreex- presión de PD-L1 resulta necesario en los pacientes con este tumor por ser un buen predictor de respuesta a los anti-PD1. El estudio del impacto de la carga mutacional y de mutaciones oncogénicas específicas puede ayudar a predecir la respuesta de los melanomas a los anti-PD-1/PD-L1105,106. Es im- portante determinar si ante un paciente concreto se debe pautar esta inmu- noterapia y desaconsejar su uso si la probabilidad de respuesta al tratamien- to es baja36. A pesar de la buena respuesta a los anti-PD-1, la mayoría de los pacientes terminan desarrollando resistencias a esta terapia, bien resisten- cias intrínsecas o extrínsecas108. Aquellos melanomas con alta TMB se podrían utilizar los anti-PD-1 en monoterapia mientras que para los pacientes con TMB intermedias y bajas lo recomendable sería la terapia combinada (nivolumab con ipilimumab) por ser más efectiva aunque se reconoce que la probabilidad de incrementar la toxicidad es también mayor porque el uso de ipilimumab puede ocasionar EA serios, de mayor gravedad que los descritos con los inhibidores PD-1 o PD-L1109. En 2015 la FDA aprobó el uso de ipililumab con nivolumab para el melanoma en estadio III irresecable o en estadio IV. El tratamiento estándar de primera línea del melanoma avanzado con mutaciones BRAF es la combinación de inhibidores BRAF (vemurafenib, encorafenib o dabrafenib) con inhibidores selectivos de la vía de señaliza- ción MEK (trametanib, cobimetinib o binimetinib), e inmunoterapia con anticuerpos anti-PD1 (pembrolizumab o nivolumab) y anti-CTLA4 (ipili- mumab). El objetivo de combinar fármacos es intentar evitar que se desa- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 73 rrollen resistencias terapéuticas. Vemurafenib (Zelboraf®) fue el primer in- hibidor de la serina-treonina quinasa BRAF aprobado en Europa para el tratamiento del melanoma y fue aprobado en 2011 por la FDA como trata- miento de primera línea del melanoma avanzado positivos a la mutación BRAF V600E. En 2014, la FDA aprobó el uso combinado de dabrafenib (Taflinar®) y trametinib (Mekinist®); en 2015 aprobó la combinación de ve- murafenib con cobimetinib (Cotellic®); y en 2018 aprobó el inhibidor BRAF encorafenib (Braftovi®) y el inhibidor MEK binimetinib (Mektovi®). Si la mutación en BRAF es V600K, entonces el fármaco indicado es trametinib, cuyo uso fue aprobado por la FDA en 2013. En caso de que el paciente pre- sente metástasis cerebrales, también son los inhibidores BRAF los indicados, bien solos o combinados con inhibidores MEK. Para el tratamiento de segunda línea de melanoma metastásico con mutaciones BRAF, si el paciente había sido tratado previamente con inmu- noterapia, estarían indicados los inhibidores BRAF y MEK, mientras que si estos se habían utilizado como primera línea terapéutica, en la recidiva se emplearán los anti-PD-1 y se utilizaría ipilimumab si no hay respuesta a los anti-PD-1. Ipilimumab (Yervoy®) fue aprobado por la FDA en julio de 2011 para el tratamiento de melanoma avanzado (metastásico y/o irresecable) re- sistente a, al menos, un tratamiento previo. En septiembre de 2014, la FDA aprobó el uso de pembrolizumab como segunda línea terapéutica en mela- nomas metastásico o irresecable que hubieran progresado tras tratamiento con ipilimumab o si se trataba de portadores de la mutación BRAF V600E, después de haber recibido inhibidores BRAF. Casi un año después, en julio de 2015, pembrolizumab recibió la apro- bación de la EMA como tratamiento de primera línea y a finales de 2018 se aprobó en monoterapia para tratamiento adyuvante en adultos con melano- ma en estadio III y afectación ganglionar, que hubieran sido sometidos a resección completa. Tanto nivolumab como pembrolizumab presentan un buen perfil de seguridad. Para el melanoma metastásico sin mutaciones BRAF el tratamiento indicado como primera línea serían los anti-PD-1 en monoterapia, o ipilimu- mab, tanto de primera como segunda líneas asociado a nivolumab108,110. En cambio, no están autorizados ni vemurafenib ni dabrafenib porque puede haber una estimulación paradójica de señalización MAPK que resulte en estimulación de la proliferación tumoral. La QT, con dacarbazina, fotemus- tina o paclitaxel, sólo se debería utilizar si las demás opciones han fracasado. Para los melanomas con mutación NRAS, el tratamiento indicado des- de 2017 es el inhibidor MEK binimetinib. En algunos melanomas se ha encontrado el gen de fusión NTRK111 y para ellos está indicado el uso de larotrectinib (Vitrakvi®), que es un trata- miento agnóstico, válido no sólo para melanoma sino para cualquier tumor INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 74 con esta GA, es decir, que la presencia de dicha alteración predice la buena respuesta del tumor al fármaco, independientemente de su lugar de origen o del tipo histológico. Por otro lado, los melanomas son tumores asociados a una gran angio- génesis, que favorece el crecimiento tumoral y su diseminación metastásica. Por ello, entre los tratamientos empleados en el melanoma, se incluyen los antiangiogénicos como el bevacizumab, generalmente combinado con otros citostáticos como carboplatino, paclitaxel o con interferón alfa. Además, muchos melanomas expresan c-Kit. C-Kit es una proteína que actúa como receptor del factor de crecimiento de los melanocitos epidérmicos. Las GAs del c-Kit incluyen mutaciones y amplificaciones, que serían sensibles a los inhibidores de c-Kit como imatinib, sinitinib, dasatinib y nilotinib. Resultados de la búsqueda bibliográfica La búsqueda de literatura permitió localizar 2.206 registros de PubMed, 107 de Cochrane Library y otros 7 artículos más recuperados a partir de los lis- tados de bibliografía de algunos estudios. De este total inicial de 2.320 regis- tros, 20 se excluyeron por ser duplicados. Tras la lectura del título y abstract de los demás registros, se descartaron 2.242 referencias. Las restantes 58 re- ferencias fueron recuperadas a texto completo para su lectura en profundi- dad, lo que llevó a excluir 23 artículos, quedando finalmente seleccionados 33 artículos originales, 1 único artículo112 de revisión de la evidencia sobre F1 y el artículo11 de validación de F1. De los 33 artículos incluidos, 10 estudia- ban F1 LDT o F1CDx en pacientes con NSCLC; 17 artículos, en pacientes con cáncer de mama; 1 artículo, en CCR; 3 publicaciones en melanoma y 2 en ovario. El diagrama de flujo de la selección de estos artículos se muestra en la figura 5 del anexo IV. Los artículos excluidos y el motivo de su exclusión se presentan en la tabla 3 del anexo V. La búsqueda realizada en las demás fuentes de información permitió localizar varios IETS: el único sobre FoundationOne® fue elaborado por HAYES, Inc113 que no se recuperó a texto completo para esta revisión por- que no era de acceso libre y de 5 informes localizados en NICE ninguno es- tudiaba F1 ni F1CDx y uno era un informe breve sobre CMI. Descripción de la evidencia disponible Estudios de F1 en pacientes con cáncer de pulmón En este informe se han incluido 10 artículos18,64,114-121 en los que se estudiaba el perfil genómico de pacientes con NSCLC mediante F1/F1CDx. Los prin- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 75 cipales datos y resultados de estos estudios se recogen en la tabla 4 del anexo VI. Estos artículos se habían publicado entre los años 2015 y 2018. Dos eran ensayos abiertos64,116 y los demás eran series de casos retrospectivas, tres de ellas con pacientes incluidos en el estudio de manera consecuti- va117-119. Todos los pacientes estudiados presentaban NSCLC en estadios avanzados o metastásicos. En dos estudios18,119 no se especificaba el tipo de tumor, mientras que en los demás el único tipo histológico incluido era el adenocarcinoma o bien este era el tipo predominante (con porcentajes del 75-85%). El total de pacientes de los 10 artículos fue de 9.076, de los cuales se informó que 3.387 eran hombres y 3.837 mujeres. La edad mediana infor- mada por los autores osciló entre 58-62,9 años. Dos estudios64,121 refirieron incluir pacientes con ECOG 0-1 y en un estudio116 el ECOG de los pacien- tes osciló entre 0-2. Sólo en el estudio de Hellman y cols64 emplearon F1C- Dx mientras que en el resto de trabajos se había utilizado F1 LDT. Sólo dos trabajos utilizaron alguna otra tecnología NGS además de F1: en el de Vig- neswaran y cols120 también se recogieron resultados del análisis con CMI y Response Genetics Inc, y en el Rozemblum y cols118, se analizaron muestras sanguíneas con G360 cuando no se disponía de muestras de calidad para analizarlas con F1, pero en ninguno de los dos artículos se compararon las técnicas. En seis estudios se mencionaron las GAs identificadas mediante F1/ F1CDx, bien el número total de GAs identificadas que se especificó en tres estudios114,115,121, bien el número medio de GAs por paciente que se informó en cuatro trabajos114,115,120,121, o el número de GAs intervenibles que se men- cionó en cuatro artículos114,115,118,121. Entre las GAs informadas en estas publi- caciones, las más frecuentes fueron mutaciones en TP53 (porcentaje medio del 22%), PIK3CA (21,50%), mutación KRAS (19,63%), translocación ALK (16,06%), mutaciones EGFR (15,66%), mutaciones BRAF (9,10%), reordenamientos RET o MET (7,40% y 5,53%, respectivamente), mutación ERBB2 (5,0%) y reordenamiento ROS1 (1,15%). Tres artículos se centraron en estudiar la presencia de una alteración concreta: reordenamientos ROS1 (un artículo116) y reordenamientos ALK (en dos trabajos18,117). Hellman y cols64 no analizaron las GAs sino que estudiaron la TMB y la PD-L1 como predictores de respuesta a la inmunoterapia. La TMB también fue analizada por Rozemburg y cols118. Drilon y cols121 señalaron que la utilización de F1 permitió identificar GAs intervenibles que no habían sido detectadas mediante las pruebas con- vencionales en un 65% de los pacientes, con adenocarcinomas y no fumado- res o de bajo consumo tabáquico. Seis pacientes en este estudio recibieron tratamiento y los 6 mejoraron inicialmente; después sólo uno sufrió progre- sión de la enfermedad. Ali y cols18 también refirieron que F1 había permitido INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 76 detectar reordenamientos ALK en 9 pacientes (el 19% del total de pacientes incluidos en el estudio) en los que el estudio con FISH había resultado ne- gativo. A estos 9 pacientes se les trató con crizotinib, de los cuales 7 presen- taron buena respuesta al tratamiento. Mediante FISH se detectaron 22 casos con reordenamientos ALK que también fueron identificados en el análisis de F1. Por eso, los autores aconsejaron realizar estudio con F1 a todos los pacientes por su superioridad para detectar las GAs ALK. En el estudio de DiBardino y cols114 demostró que los resultados de F1 influyeron directamente en el manejo terapéutico de 7 de los 49 pacientes (14,2%). En 2 pacientes se indicó la retirada del fármaco que ya estaba pau- tado y en 5 pacientes se modificó el tratamiento, administrando uno nuevo. También en el estudio de Lim y cols115 F1 aportó información clave para 7 pacientes que habían tenido resultados negativos con las pruebas conven- cionales porque F1 permitió identificar reordenamientos ROS1 y esto posi- bilitó su tratamiento con ceritinib; de estos casos, 6 presentaron respuesta objetiva. Pekar-Zlotin y cols117 compararon los resultados de FISH/IHC y F1 en 51 pacientes consecutivos, encontrando discordancia en 6 pacientes. Se- gún informaron los autores, F1 permitió confirmar una incidencia de reorde- namientos ALK del 13,7% y no del 7,8% como se hubiera considerado utili- zando sólo FISH. Dos de los pacientes detectados por F1 pudieron recibir tratamiento con crizotinib: uno alcanzó respuesta completa y el otro, enfer- medad estable. También Rozemblum y cols118 constataron la utilidad clínica tanto de F1 como de G360, que identificaron GAs en EGFR y ALK en 15 pacientes (14,9%) que habían presentado resultados negativos con los tests convencionales. De esos 15 casos, 12 recibieron el tratamiento recomendado por las NGS y de ellos, 8 alcanzaron una respuesta tumoral objetiva. Por otro lado, en 4 pacientes positivos a EGFR o ALK, las NGS permitieron identifi- car otras GAs. Los autores informaron de que la estrategia terapéutica se pudo modificar en 43 pacientes (42,6%). En siete artículos18,114-118,121 se informó sobre el número de pacientes que podía recibir terapia dirigida, que sumaban un total de 152 pacientes informados, bien con algún fármaco ya aprobado por las autoridades per- tinentes (67 pacientes) o bien con fármacos que sólo podían utilizarse en el entorno de un ensayo clínico (39 pacientes). En estos estudios se ofre- cieron resultados sobre la respuesta tumoral a la terapia dirigida en 80 pacientes, de los cuales se informó una respuesta objetiva en 55 (68,75%), encontrando una respuesta informada completa en 8 (10%), respuesta par- cial en 33 (41,40%), enfermedad estable en 14 (17,50%), progresión de la enfermedad en 5 (6,25%) pacientes y en 4 (5%) los pacientes aún estaban pendientes de revisión o eran pacientes perdidos en el seguimiento. Ver tabla 2. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 77 Tabla 2. Respuesta de los NSCLC al tratamiento recomendado por F1. Influencia de f1 en la decisión terapéutica. tratamiento administrado. autor n n tratados ro rc rp ee pe pendientes/ perdidos Influencia en la decisión terapéutica tto Lim, 2017 15 15 11 1 10 2 1 1 ceritinib Ali 47 9 7 1 6 1 1 19,00% crizotinib DiBardino 49 7 6 14,29% no se menciona Lim, 2016 51 7 6 13,73% ceritinib Rozemblum 101 34 22 5 17 9 3 42,60% varios Drilon 31 6 2 2 2 19,35% varios Pekar 51 2 1 1 1 6,00% crizotinib Total (N) 345 80 55 8 33 14 5 4 Total (%) 23,19 68,75 10,00 41,25 17,50 6,25 5,00 19,16% RO: respuesta objetiva (incluye RC y RP), RC: respuesta completa, RP: respuesta parcial, EE: enfermedad estable, PE: progresión de la enfermedad, tto: tratamiento administrado. En cinco artículos18,114,115,118,121 se informó sobre el impacto de los resul- tados de F1 en la decisión terapéutica (ver tabla 2), es decir, del porcentaje de pacientes en los que dichos resultados llevaron a una modificación del tratamiento previsto o del ya administrado al paciente. Estos porcentajes oscilaron entre 6% y 42,6%, con un porcentaje medio de 19,16%. En ningún estudio se informó sobre la supervivencia global y cua- tro artículos64,116-118 ofrecieron resultados de PFS: en el de Lim y cols116 se encontró una PFS entre 4,4 meses y más de 31,8 meses; en el artículo de Pekar-Zlotin y cols117, se mencionó que un paciente tratado con cri- zotinib presentó respuesta completa tras este tratamiento y alcanzó una PFS de 18 meses mientras que el segundo paciente llegó a los 6 meses; Rozenblum y cols118 informaron que 21 de 43 pacientes permanecían vivos después de un tiempo medio de seguimiento de 18 meses (rango, 1-58 meses). En el ensayo abierto publicado por Hellman y cols64 se incluyeron pa- cientes con NSCLC escamosos y no-escamosos en estadio IV o recurrentes, con una TMB ≥10 mut/Mb. Los autores consideraron varios grupos de trata- miento: un grupo de tratado combinado con nivolumab + ipilimumab, que incluyó 576 pacientes; otro de 391 pacientes tratados sólo con nivolumab y un grupo de QT con 570 pacientes. Los autores constataron que la TMB y la expresión del PD-L1 eran biomarcadores independientes efectivos para va- lorar la respuesta tumoral. Compararon la PFS del grupo tratado con nivo- lumab + ipilimumab (PFS de 30,9%) frente al tratado con QT (17%), inde- pendientemente de la TMB o del nivel de expresión de PD-L1. También la PFS resultó significativamente mayor cuando se ajustaba según expresión INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 78 del PD-L1 (para aquellos con PD-L1 ≥1%), y en el grupo de tumores con alta TMB (≥10 mut/Mb) la PSF fue significativamente superior, con una me- diana de 7,2 meses (IC 95%: 5,5-13,2) vs 5,5 meses (IC 95%: 4,4-5,8). Los autores mencionaron una tasa de respuesta objetiva del 45,3% en el grupo tratado con la combinación de nivolumab e ipilimumab, frente al 26,9% de los pacientes tratados con QT. El 43% de los que recibieron tratamiento combinado, al año se mantenían libres de enfermedad en contraste con el 13% de los tratados con QT. Por esto, los autores reconocieron la necesidad de confirmar los resultados de la combinación de inmunoterapia + QT y determinar si algún punto de corte concreto de TMB podría predecir una buena respuesta a la monoterapia con nivolumab. El tratamiento combina- do de nivolumab con ipilimumab frente a QT presentó un HR de progresión de la enfermedad o muerte de 0,48 (IC 95%: 0,27-0,85). Por el contrario, en pacientes con baja TMB (<10 mut/Mb) y PD-L1 <1%, la PSF a un año fue del 18% tanto con nivolumab más dosis bajas de ipilimumab como con nivo- lumab más QT y del 16% con QT. Este estudio recogió datos de seguridad del tratamiento dirigido re- comendado por F1CDx. Los autores comprobaron que dosis de 3 mg/Kg de nivolumab cada 2 semanas y de 1 mg/Kg de ipilimumab cada 6 sema- nas eran seguras y efectivas. La tasa de EA en el grupo de nivolumab+i- pilimumab fue ligeramente superior en los que tenían una TMB >10 mut/ Mb. Se informó de una tasa global de EA de grados 3 y 4 similar entre ambos grupos de tratamiento (31% vs 36%), pero en los casos con una TMB ≥10 mut/Mb, el 26% de los pacientes tratados con inmunoterapia presentó EA frente a tan solo un 9% de los tratados con QT. El porcen- taje de pacientes que tuvo que suspender el tratamiento debido a los EA fue mayor en el grupo de nivolumab+ipilimumab que en los que recibie- ron QT (17,4% vs 8,9%). Los que abandonaron el tratamiento de nivolu- mab en monoterapia fueron un 11,5%. El EA más frecuente en los pa- cientes que recibieron inmunoterapia, tanto combinada como sólo nivolumab, fue la reacción cutánea (33,9% y 20,7%, respectivamente). Y entre los EA grados 3 y 4, los más frecuentes fueron los eventos hepáti- cos (8,0% y 3,3%, respectivamente). Del grupo de pacientes tratados con nivolumab+ipilimumab, 7 (2,1%) fallecieron (3 por neumonía, los demás por miocarditis, necrosis tubular aguda, colapso circulatorio y tapona- miento cardiaco, respectivamente); de los tratados con QT, 6 (1,1%) fa- llecieron (2 por sepsis, el resto por infarto cerebral, enfermedad pulmo- nar intersticial, trombocitopenia y sepsis, respectivamente); y entre los tratados sólo con nivolumab, 2 (0,5%) fallecieron (uno por neumonitis y el otro por sepsis). El estudio de Rozenblum y cols118 fue el único que hizo mención sobre el tiempo medio hasta obtener los resultados de F1, que fue de 13 días. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 79 Estudios de F1 en pacientes con cáncer de mama En esta revisión se incluyeron 17 artículos74,80,82,122-135. Los principales datos y resultados de estos estudios se recogen en la tabla 5 del anexo VI. Todos eran series de casos salvo un ECA (ensayo controlado y aleato- rizado)74 y fueron publicados entre 2013 y 2017. Entre las series de casos, cuatro de ellas eran consecutivas122,126,127,135. La mayoría eran estudios retros- pectivos, excepto tres130,131,133 prospectivos, uno de ellos, multicéntrico130. El número total de pacientes incluidos fue de 1.067, con una mediana de 44 pa- cientes porque salvo el ECA74 y uno de los trabajos de Ross y cols135, que incluyeron 302 y 138 pacientes, respectivamente, en el resto de los artículos el número de pacientes osciló entre 20 y 75. Según datos informados por los autores, 1 de los pacientes era hombre, mientras que 689 eran mujeres. La edad mediana osciló entre 48 y 62 años, con un rango de edad de 14-93. Sólo en el estudio de Parsons y cols130 se mencionó que las pacientes presentaban un ECOG entre 0 y 2. Todos los carcinomas de mama estaban en un estadio avanzado y se incluyeron diversos tipos: metaplásico80, inflamatorio en los dos estudios122,124, mucinoso125, filodes131 y carcinoma lobular invasivo134. En la mayoría de los artículos se describía el estado de receptores hormonales y/o la sobreexpresión HER2, presentando unos porcentajes variables: en un artículo80 el 100% de las pacientes eran HER2 negativas, en otros dos128,130 el 100% eran triples negativos. Todos habían utilizado la plataforma F1 para analizar las muestras ti- sulares, bien del tumor primario o de metástasis. Una gran parte de los estu- dios refería haber realizado FISH y estudio IHC y de ellos, 4 artícu- los122,124,125,130 daban resultados de concordancia con F1 del 70%, 94% y en dos casos, del 100% (este último valor se refería a la detección de amplifica- ciones ERBB2). Sólo dos artículos comparaban los resultados de F1 sobre tejido tu- moral frente al estudio NGS en ctDNA: Chae y cols124 encontraron que F1 permitía detectar un número medio de GAs por paciente sigificativamen- te superior a G360 (4,56 (SD=2,98) vs 2,16 (SD=2,31), P<0,0001; IC 95%: 1,28-3,52). El 32,5% de las alteraciones se detectaron sólo mediante ctD- NA mientras que el 53,3% sólo en el estudio del tejido y no en ctDNA. En el estudio de Parsons y cols130 se encontró una concordancia del 70% en- tre F1 y el análisis sobre ctDNA (no se menciona qué test se empleó). Nozad y cols126 utilizaron ambas técnicas, F1 y F1 Heme, según fuera ne- cesario para el diagnóstico de las GAs, pero no compararon resultados entre ambas. Ninguno de los artículos seleccionados para este informe comparaba los resultados de F1 con los de otras plataformas de secuenciación con muestras tisulares. En el trabajo de Patel y cols133, se estudió si diferentes INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 80 herramientas web identificaban opciones terapéuticas similares para un conjunto dado de GAs detectadas en biopsias tumorales y si estas opcio- nes concordaban con las recomendadas por F1. Estas herramientas web fueron diseñadas para ajustar fármacos dirigidos a las dianas terapéuticas identificadas, y fueron las siguientes: Drug-Gene Interaction Database (DGIdb), My Cancer Genome (MCG), Personalized Cancer Therapy (PCT), cBioPortal (cBio). Los autores encontraron que sólo existía una concordancia parcial en las opciones terapéuticas recomendadas para las mismas GAs identificadas entre las herramientas web y F1. En el 33% de los casos existió acuerdo entre las 4 herramientas para recomendar un fár- maco para al menos una mutación y en 72% de los casos existió concor- dancia entre 2 o más herramientas para recomendar la entrada de la pa- ciente en un ensayo clínico Tal como se recoge en la tabla 5 de extracción de datos y resultados de los estudios de cáncer de mama, el objetivo de la mayoría era estudiar me- diante F1 la presencia de GAs intervenibles y contribuir a la toma de deci- siones terapéuticas de estas pacientes con cáncer de mama avanzado. El nú- mero total de GAs detectadas por F1 e informadas por los autores de 8 artículos fue de 1.110. La mediana de GAs por paciente fue de 4,56, con unas medias informadas en 9 artículos que oscilaron entre 3,1 y 5,7. Del total de GAs, las GAs intervenibles fueron 398, con una mediana de 40 y la media de GAs intervenibles por paciente fue de 1,59. Wheler y cols127 consideraron que la mayoría de las 131 GAs identificadas con F1 eran intervenibles aun- que no concretaron el número. En los 17 artículos incluidos en este informe, F1 detectó GAs en más de 24 genes y/o vías de señalización celular. Las GAs identificadas con más frecuencia en el total de pacientes fueron las siguien- tes: mutaciones TP53 (porcentaje medio de pacientes del 49%), mutaciones PIK3CA (32%), amplificaciones MYC (26%), amplificaciones FGFR1 (17%), amplificaciones CCND1 (18%), mutaciones ERBB2 (23%) y dele- ciones PTEN (10%). Balko y cols128 estudiaron sólo el perfil molecular de las pacientes con cáncer de mama residual tras haber recibido QT y recomendaron la realiza- ción del estudio genómico para todas las pacientes que hubieran demostra- do resistencia a la QT por la posibilidad de detectar algunas GAs para las que se pudiera administrar terapia dirigida. Meric-Bernstam y cols129 compa- raron el perfil genómico de 33 muestras de tumores primarios y recurrentes emparejados, y encontraron que 97 de 112 (86,6%) mutaciones somáticas fueron concordantes; además, informaron que en 40 pacientes (93%) se pre- sentaron GAs intervenibles en el tumor primario y la mayoría se detectaron también en las recurrencias/metástasis. Ross y cols125 constataron que la am- plificación ERBB2 se daba con una frecuencia significativamente superior en los tumores recurrentes en comparación a los primarios (p=0,03). Vasan y VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 81 cols131mencionaron que no se encontraron diferencias significativas entre la media de GAs por tumor en el primario y en los metastásicos hipertratados (2,9 vs 3,4; p=0,31) y que el número medio de GAs potencialmente interve- nibles era similar en el tumor primario y en los metastásicos hipertratados (1,6 vs 2,0; p=0,24). Entre las pacientes con cáncer de mama metastásico estudiadas por Yuan y cols123, se detectaron alteraciones intervenibles en un porcentaje muy elevado (95%). La vía de señalización con mayor número de alteraciones en estas pacientes fue la PI3K/mTOR, de ahí que el tratamiento recomendado con más frecuencia fuera el everolimus. La presencia de amplificación FGFR1 se asoció a una sobreexpresión de RNA, RE+, expresión p53 y a un peor pronóstico. Los autores señalaron la falta de acceso a muchos de los fármacos que potencialmente pudieran utilizarse como terapia dirigida fren- te a las alteraciones intervenibles encontradas, al tiempo que recordaron la importancia de poder acceder a ensayos clínicos en los que las pacientes puedan recibir la terapia dirigida. Sólo 5 trabajos82,128-131 mencionaron los tratamientos previos recibidos. Cinco artículos especificaron el número de pacientes que recibió terapia di- rigida seleccionada a partir de los resultados de F1: en dos artículos74,82 el fármaco administrado fue everolimus; en el de Parsons y cols130 se dio tera- pia dirigida o inmunoterapia a 4 pacientes: bicalutamida (a la paciente con AR+), carboplatino/inhibidor PARP (a la paciente con mutación BAP1), trametanib (a la paciente con amplificación MAP2K1) y trastuzumab (a la paciente con mutación ERBB2); en el estudio de Yuan y cols123, los resulta- dos aportados por F1 llevaron a administrar everolimus a 5 pacientes con mutaciones en PIK3CA o TSC1 y pazopanib a 2 pacientes por presentar amplificación FGFR. Y Ross y cols135 utilizaron varios anti-HER2 en 3 pa- cientes: la paciente con mutación L755S ERBB2 respondió a neratinib; la que presentó la mutación S310F respondió a trastuzumab, pertuzumab y ful- vestrant; y la paciente con la mutación V777L y S310F respondió a terapia anti-HER2 combinada con QT. Cuatro estudios 82,123,130,132 analizaron la respuesta tumoral al tratamien- to. Exceptuando Yuan y cols123, los demás utilizaron la clasificación RECIST para su valoración. De las 44 pacientes estudiadas por Yuan y cols123, 7 pre- sentaron un beneficio clínico tras la terapia indicada por F1, con duración de entre 8 a 34 semanas, e incluso 3 pacientes tratadas con everolimus presen- taban una buena respuesta durante más de 32 semanas; 8 pacientes sufrieron finalmente progresión de la enfermedad. Niu y cols82 trataron a 28 pacientes pero la valoración de la respuesta tumoral sólo pudo hacerse en 13. De estas 13, de las 7 tratadas con everolimus y exemestane, 5 mostraron estabilidad de su enfermedad durante al menos 6 meses; 5 pacientes fueron tratadas con fulvestran y de ellas, 4 sufrieron progresión de la enfermedad mientras que INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 82 1 logró que la enfermedad se mantuviera estable durante 8 meses; la otra paciente fue tratada con tamoxifeno y presentó progresión de la enferme- dad. También Parker y cols132 mencionaron respuesta parcial en 5 pacientes y enfermedad estable en 7 durante al menos 6 meses. Por último, Parsons y cols130 describieron enfermedad estable durante 9 meses en una paciente tratada con trastuzumab, mientras que otras 3 pacientes que recibieron otros fármacos dirigidos respondieron inicialmente pero tras varias semanas su- frieron progresión de la enfermedad. Yuan y cols123 observaron que de las pacientes con cáncer de mama metastásico recogidas en su estudio, un 33% de las que presentaban altera- ciones intervenibles no pudieron iniciar la terapia dirigida por rápido dete- rioro o lo comenzaron pero en menos de 2 semanas tuvieron que suspender- lo y también mencionaron la falta de acceso a este tipo de fármacos en algunos casos. Este último motivo fue esgrimido por Parker y cols132 como la principal causa de no recibir el tratamiento dirigido. Pocos estudios utilizaron F1 para determinar la TMB y el estatus de microsatélites. Nozad y cols126 encontraron que todos presentaban MMS y una baja TMB, todos por debajo del nivel de 10 mut/MB, con una mediana de 2,7 mut/Mb y unos valores muy similares y sin diferencias significativas entre la TMB del tumor primario y las metástasis. El único estudio sobre F1 en cáncer de mama en el que se hace men- ción a la seguridad es el estudio de Yuan y cols123, que mencionó la aparición de toxicidad asociada al tratamiento con pazopanib. La paciente afectada sufrió un incremento de enzimas hepáticas que llevó a suspender la adminis- tración del fármaco. En un estudio se mencionó que el informe de F1 tardó entre 7-14 días en llegar al oncólogo. En otro artículo130 también se hizo referencia al tiem- po transcurrido desde el envío de las muestras tisulares hasta disponer del resultado de F1, que osciló entre 12-30 días y se pudo indicar el tratamiento en menos de 28 días al 60% de las pacientes. Estudios de F1 en pacientes con CCR Sólo el artículo de Gong y cols87, que utilizaba F1 para estudiar el CGP de pacientes con CCR cumplía los criterios para ser incluido en este informe. Los autores estudiaron el perfil molecular de 138 pacientes con CCR mediante esta NGS con el objetivo de caracterizar las GAs que se sabía que eran dianas para la terapia dirigida y que estaban relacionadas con el pronóstico de la en- fermedad o con una posible resistencia terapéutica. Además, describieron otras GAs poco frecuentes en mCCR. Se trata de un estudio unicéntrico, re- trospectivo, que incluyó pacientes entre abril de 2013 y febrero de 2016. De los 138 pacientes, 82 (59,4%) eran hombres y 56 (40,6%) mujeres, con una edad VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 83 mediana de 56 años (rango, 27-88). Todos presentaban CCR avanzado o me- tastásico y habían recibido varias líneas terapéuticas previamente. Las muestras para F1 se tomaron a partir de la resección quirúrgica, biopsia core o biopsia excisional. El estudio con F1 permitió detectar muta- ciones RAS en el 51,4% de los tumores; la mayoría (n=68; 49,3%) fueron mutaciones KRAS en exón 2 (que predice falta de respuesta a anti-EGFR); 15,5% eran otras mutaciones que también se asociaron a resistencia a los anti-EGFR. En 3 (2,2%) pacientes se encontraron mutaciones NRAS. Tam- bién se detectaron mutaciones RAF en 7,2%. La mayoría (n=9; 6,5%) fueron BRAF V600E activadoras, que se han asociado a peor pronóstico, a resisten- cia a la QT y a falta de respuesta a los anti-EGFR. En torno al 41% de pa- cientes no presentaba mutaciones RAS/RAF. Dos pacientes presentaron mutaciones KRAS y BRAF simultáneas, a pesar de que suelen ser mutua- mente excluyentes y se asociaron a peor pronóstico. Otras GAs identificadas por F1 fueron amplificaciones MET (n=3; 2,2%) que se asociaron a peor pronóstico, a fenotipos más agresivos y a resistencia a tratamiento con inhibidores MEK. También mutaciones PIK3CA (n=25; 18,1%), mutaciones PTEN (n=15; 10,9%) y mutaciones AKT (n=4; 2,9%), que se dieron en tumores más agresivos y que no respondían a anti-EGFR. La mayor parte de los pacientes presentaba tumores con menos de 9 CR- GAs (121 o 87,7%) y de ellos, la mayoría eran tumores de colon izquierdo y todos MSS. Catorce (10,1%) pacientes tenían entre 9-16 CRGAs y sólo 3 pacientes (2,2%) presentaban entre 17 y 25 CRGAs, detectándose en los tres una elevada TMB. En el 25% de los tumores hipermutantes se detectaron mutaciones POLE (polimerasa ε). En general, tanto los tumores con alta TMB como aquellos en los que se detectan mutaciones POLE responden bien a los anti-PD-1. En este estudio se identificaron algunas mutaciones RAS poco fre- cuentes que tuvieron gran importancia clínica dada su resistencia a los fár- macos anti-EGFR. También se detectó en 2 pacientes una amplificaciones KRAS y en otro, una amplificación NRAS, ambas muy raras en CCR. Estas GAs se dieron en pacientes con CCR con diseminación metastásica difusa que evolucionaron hacia la progresión tumoral incluso con varias líneas de tratamiento, y que resultaron ser resistentes también a los anti-EGFR. Los autores sólo concretaron el tratamiento administrado a un escaso número de pacientes. Una paciente con amplificación KRAS fue tratada con FOLFI- RI+panitumumab y mostró enfermedad estable tras 6 meses. Otro paciente también con amplificación KRAS sufrió progresión rápida tras anti-EGFR y una paciente con amplificación NRAS también progresó tras dos meses de tratamiento con FOLFIRI+cetuximab. Cuatro de los 7 pacientes con ampli- ficación ERBB2 RAS wild-type recibieron tratamiento anti-EGFR; de ellos, tres experimentaron estabilización de la enfermedad durante más de 4 me- ses y un paciente presentó respuesta parcial durante más de 5 meses. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 84 A la vista de estos resultados, los autores recomendaron que a los pa- cientes con CCR se les debía realizar un análisis del CGP que estudiara el mayor número posible de genes, incluyendo más de los recomendados por la National Comprehensive Cancer Network (NCCN)136. Además, recomenda- ron estudiar la TMB en pacientes con CCR porque lo consideraron un mejor indicador que el estado de inestabilidad de los microsatélites para determi- nar un perfil hipermutante que predeciría una buena respuesta a la inmuno- terapia con anti-PD-1. Estudios de F1 en pacientes con cáncer de ovario Se han seleccionado dos artículos137,138 en los que se utilizaba F1 para el estu- dio de tumores de ovario que cumplieron con los criterios de inclusión esta- blecidos para el presente informe. Ambos eran retrospectivos y ambos se realizaron en un único centro hospitalario. El estudio de Dougherty y cols137 se analizaron 209 muestras de carci- nomas serosos de alto grado recogidas de pacientes que habían respondido a la QT basada en platino pero que posteriormente sufrieron una recaída. El objetivo era estudiar la evidencia clínica y biológica de las mutaciones somá- ticas en BRCA1/2 como predictoras de respuesta al olaparib para el trata- miento de mantenimiento. La mutación en estos genes se consideraba pre- dictora de buena respuesta a los inhibidores PARP. Utilizaron F1 para realizar el análisis genómico, encontrando mutaciones BRCA1/2 en 114 (55%), de las que 78 se presentaban en BRCA1 y 36 en BRCA2. La concor- dancia de los resultados de F1 con los de la secuenciación de Sanger fue alta (grado de acuerdo del 97%). Los autores informaron sobre una respuesta favorable al olaparib en los que tenían mutaciones BRCA1/2, aunque no se aportaron datos sobre esta efectividad terapéutica. El segundo estudio138 incluido se realizó en 48 pacientes con cáncer de ovario en estadio avanzado, con una edad media en el momento del estudio del perfil genómico de 55,7 años; rango de 23 a 76 años. El 79% de los tumo- res eran carcinomas serosos, la mayoría de alto grado. En todas las pacientes el perfil genómico se analizó mediante F1, que permitió detectar un total de 141 GAs, con una media de 2,9 alteraciones por tumor (rango: 0-8). Las GAs más frecuentes fueron las siguientes: mutación TP53 (en el 79% de los tumo- res), amplificación MYC (25%), truncamiento BRCA1/2 (23%), mutación/ amplificación HRAS (16,6%) y mutación NF1 (14,5%). De todas las GAs, 67 eran intervenibles: 11 (22,9%) tumores presentaron mutaciones BRCA1/2, que eran potencialmente sensibles a inhibidores PARP; los 8 casos con GAs en KRAS predecían resistencia a los anti-EGFR y sensibilidad a los inhibido- res MEK; las alteraciones en NF1 potencialmente predecían respuesta a los inhibidores mTOR; la mutación ATM indicaba buena respuesta a inhibidores VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 85 PARP; en dos tumores se detectaron amplificaciones en c-MET predecían buena respuesta a los inhibidores MET, incluyendo el crizotinib. En cuanto a la relación entre las GAs y el tipo histológico, las mutaciones TP53 se identi- ficaron en el 79% de los tumores, aunque más frecuentemente en los carcino- mas papilares serosos (83%) frente a los no-papilares serosos (50%). Los autores señalaron la ventaja de utilizar F1 como plataforma de NGS que fa- cilitaba el estudio simultáneo de todo tipo de GAs en un único test. En ninguno de los dos estudios se aportó información relativa a trata- miento, a posible respuesta tumoral ni otros resultados de efectividad clíni- ca. Tampoco se evaluó el desarrollo de posibles EAs. Estudios de F1 en pacientes con melanoma Tres artículos100,105,139 de pacientes con melanomas estudiados con F1/F1CDx cumplieron los criterios de inclusión de este informe. Los principales datos y resultados de estos estudios se recogen en la tabla 6 del anexo VI. Se trata de estudios retrospectivos realizados sobre muestras muy pequeñas de pacien- tes, donde F1 se utilizó con diferentes objetivos y en los que se han estudiado variables de resultados diferentes entre sí. En el estudio de Carlson y cols100 se utilizó F1 como test para analizar el perfil genómico completo e identificar las GAs que pudieran influir en el tratamiento de 30 pacientes (17 hombres y 13 mujeres) con melanoma me- tastásico. Mediante F1 se pudo comprobar que todos los pacientes tenían al menos 1 GA. En total se detectaron 83 GAs, con una mediana de 2,5 GAs por muestra (rango, 1-7). Las GAs más frecuentes fueron sustituciones (54/83; 65%), amplificaciones (17/83; 20%), pérdidas del gen completo o de exones (11/83; 13%). Se encontró un número significativamente mayor de GAs en los melanomas pobremente diferenciados y en los anaplásicos. Y se detectó que la mutación BRAF era significativamente más frecuente en el melanoma de fenotipo nevoide (100% vs 32%, p=0,02). Además, las princi- pales vías de señalización afectadas fueron MAPK (77%), PTEN-PI3K- AKT (50%) y p16INH4a-CCND1-CDK4-RB1 (43%). Por otro lado, me- diante F1 se pudo comprobar que todos tenían, al menos, 1 CRGA. Del total de 83 GAs, se identificaron 64 CRGAs (77%; 64/83) y por tumor, se encontró una mediana de 2 CRGAs (media de 2,1; rango: 1-7). Un 29% (24/83) de las muestras presentaron GAs intervenibles. Los autores consideraron que la importancia del uso de F1 radicaba en su capacidad para identificar un ele- vado número de CRGAs, lo que permitiría modificar o influir en la toma de decisiones terapéuticas. En el trabajo de Johnson y cols105 el objetivo era analizar el valor de la TMB como factor predictivo de la respuesta de los melanomas metastásicos a la inmunoterapia. Utilizaron F1 para determinar la TMB y establecieron INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 86 unos valores de corte para clasificar a los pacientes en tres grupos según la probabilidad de respuesta al tratamiento: alta TMB (>23,1 mut/Mb), inter- media (3,3-23,1 mut/Mb) y baja (<3,3 mut/Mb). Los fármacos utilizados fue- ron nivolumab y pembrolizumab (como anti-PD-1) y atezolizumab (como anti-PD-L1). Los autores encontraron una TMB significativamente mayor en los respondedores a anti-PD-1/PD-L1 (mediana de 45,6 vs 3,9 mut/Mb; p=0,003). Además, la tasa de respuesta objetiva resultó mayor en los de alta TMB en comparación a los de intermedia y baja (85% vs 29% vs 14%; p<0,001), igual que la PFS y supervivencia global que también fueron supe- riores de forma significativa en el grupo de alta TMB. Por otro lado, se vio que la mediana de TMB era diferente según la mutación driver de cada caso, según los resultados obtenidos con F1: BRAF, NRAS, NF1 y triple wild-type (12,0 vs 17,6 vs 62,7 vs 2,2 mut/Mb; p<0,001). También F1 permitió constatar que los melanomas con mutaciones BRCA2 presentaban mayor TMB (me- diana de 68,2 vs 15,9; p=0,028). Además, mediante F1 se observó que las GAs detectadas en NF1 fueron más frecuentes en el grupo de respondedores (50% vs 21%; p=0,015) mientras que el triple wild-type fue más frecuente en los no-respondedores (13% vs 35%; 0=0,045). El tercer estudio incluido en este informe es el de Wheler y cols139. En él los autores seleccionaron una muestra consecutiva de 10 pacientes con melanoma avanzado con mutación BRAF en los que el tratamiento conven- cional (mediana de 2 líneas terapéuticas previas) ya había fracasado. A to- dos los pacientes se les hizo F1, además de realizar estudio IHC para valorar la presencia de deleciones PTEN y PCR para detectar alteraciones BRAF, y en los casos en que fue posible, se estudiaron también KRAS, NRAS, PIK- 3CA y TP53. Siete pacientes recibieron tratamiento con inhibidores BRAF, 1 paciente con inhibidores MEK y 2 pacientes fueron tratados con inhibido- res BRAF y MEK. En ellos se hizo evaluación radiológica de la respuesta por CT y/o PET aplicando criterios RECIST v1.0 o v1.1 y encontraron una respuesta completa en 4 (40%) pacientes y respuesta parcial en 6 (60%). El tiempo hasta el fallo del tratamiento (TTF) de los pacientes con respuesta completa fue de 5,6; 23,6+; 27,4+ y 28,7+ meses. Y en los pacientes que res- pondieron parcialmente, el TTF fue de 3,0; 4,2; 5,7; 7,0; 7,9 y 11,2 meses. Todos los pacientes tenían la mutación BRAF V600E pero también se constató que la mayoría presentaba múltiples GAs. En opinión de los autores, estas otras GAs podrían estar implicadas en la resistencia al tratamiento con inhibido- res BRAF y/o MEK. Artículo de revisión de la evidencia Se ha seleccionado un único artículo112 de revisión de la evidencia publicada sobre tres plataformas comerciales de estudio de perfil genómico. En él se VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 87 recoge el trabajo de un panel de expertos multidisciplinares especialistas en cáncer que analizaron y compararon los resultados de CMI, F1 y Onco- DEEP®, que eran las técnicas de NGS más utilizadas en España. Las tres plataformas llevaban el marcado CE y se realizaban en laboratorios con cer- tificado CLIA y con acreditación por el CAP. También en este artículo se había realizado una amplia revisión de la literatura, aunque no sistemática, y de los sitios web de cada una de estas tecnologías. Los autores señalaron las ventajas que ofrecían estas plataformas comerciales en comparación a los test utilizados en laboratorios locales o con pequeños paneles de genes, ventajas derivadas del estudio centralizado de un alto número de pacientes y de la posibilidad de generar evidencia sobre la utilidad clínica de las mis- mas de forma más rápida, permitiendo una incorporación también más rápi- da a la clínica asistencial. Para comparar las tres plataformas, los autores analizaron las tecnolo- gías utilizadas en cada una de ellas, su proceso de validación analítica, la evidencia empleada para asociar sus resultados con determinados trata- mientos para tumores sólidos o con resistencias a ciertos fármacos, y los es- tándares de calidad de cada una de ellas. En las tres, CMI, F1 y OncoDEEP®, se incluye la tecnología NGS para el estudio de 592, 315 y 150 genes, respec- tivamente. En resumen, los autores constataron que las tres plataformas eran capaces de identificar mutaciones puntuales, indels y CNA; que F1 tam- bién identificaba reordenamientos de genes y OncoDEEP®, translocaciones de genes; que CMI y F1 estudiaban, también, la TMB. CMI y OncoDEEP® incluyen IHC, pirosecuenciación y análisis de la inestabilidad de microsaté- lites, y sólo CMI secuenciación de RNA y CISH. Para este panel de expertos, CMI tiene un gran valor predictivo frente a un elevado número de quimio- terápicos, hormonoterapia, terapia dirigida, inmunoterapia y fármacos en investigación en ensayos clínicos; F1 tenía valor predictivo frente a terapia dirigida, fármacos en investigación, inmunoterapia a partir de la TMB y QT basada en platinos por su asociación a mutaciones BRCA1/2; y OncoDEEP® era predictivo de respuesta a terapia dirigida, fármacos en investigación, in- munoterapia y de los quimioterápicos, sólo los agentes basados en platino, los análogos de nucleósidos y los taxanos. No se encontró que F1 y Onco- DEEP® fueran predictivos de respuesta a hormonoterapia. Los autores también revisaron la utilidad clínica de las tres platafor- mas, definiendo dicha utilidad clínica como cualquier uso de los resultados del test que aportara información para el manejo clínico del paciente y en la toma de decisiones. Encontraron que CMI había permitido un cambio en la decisión terapéutica en 120 de 137 (88%) casos y 348 de 473 (74%) pacientes fueron tratados de acuerdo al informe emitido por CMI. De los pacientes estudiados con F1, la decisión terapéutica se modificó en 36 de 132 (27%) y solo 285 de 1,174 (24%) pacientes recibieron el tratamiento recomendado INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 88 por F1. Para OncoDEEP® no se encontraron artículos publicados que ofre- cieran estos datos. También analizaron el beneficio clínico de estos tests, es decir, el im- pacto en resultados de salud del paciente a consecuencia de las decisiones tomadas en base al perfil genómico de cada test. Este beneficio se midió en forma de PFS, respuesta tumoral (si respuesta completa o parcial, o estabili- zación de más de 6 meses), tiempo hasta el siguiente tratamiento (TNT) y la supervivencia global. El porcentaje de pacientes en los que se observó bene- ficio clínico tras utilizar CMI o F1 fue de 40% y 27%, respectivamente. La mediana de supervivencia global de los registros observacionales (n=1180) estudiados con CMI fue de 422 días, mayor en los tratados de acuerdo al resultado genómico (HR=0,68; p=0,001) y la mediana de TNT en el estudio colaborativo en red que utilizó CMI fue de 33 días más en los pacientes tra- tados según indicación de CMI (248 días vs 215 días, HR=0,85; p=0,00018). Los autores no encontraron datos sobre supervivencia global ni TNT de los pacientes estudiados con F1. En conclusión, los autores consideraron que estas plataformas tenían un valor clínico potencialmente alto y que utilizados correctamente podía aportar un marcado beneficio al paciente. Señalaron algunos contextos clíni- cos en los que resultaría de gran interés como el tratamiento de pacientes con enfermedades para las que haya terapias dirigidas aprobadas; para el screening de pacientes candidatos a participar en ensayos clínicos; y para aquellos pacientes en los que el test de biomarcadores estándar no identifi- cara GAs intervenibles y no puedan ser incluidos en ensayos clíncios. Los autores consideraron que CMI era la multiplataforma más completa y justificaron la utilización de esta prueba por el beneficio clínico que genera. Por otro lado, señalaron que desde la perspectiva del paciente, la infor- mación que se debe dar a los pacientes antes de la prueba genómica debe ser “clara, transparente y honesta”, y se debían presentar de forma correcta las potenciales expectativas, en especial si cuando se realiza el test el paciente ya está en una fase muy avanzada del proceso tumoral donde es posible su- frir un rápido deterioro que imposibilite la administración de los fármacos que se pudieran recomendar. Además, otro elemento crucial a tener en cuenta son las limitaciones y barreras en el acceso al tratamiento y/o reem- bolso de fármacos no aprobados para una patología concreta. Los autores reclamaron que estas plataformas de perfil genómico fue- ran introducidas en la práctica clínica y que en la autorización para el uso de estas plataformas y la aprobación de algunos de los fármacos sugeridos de- bían tenerse en cuenta determinadas situaciones clínicas de difícil trata- miento como los tumores raros, los carcinomas de origen desconocido, el cáncer de mama triple negativo o el carcinoma colorrectal avanzado y re- fractario a varias líneas terapéuticas. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 89 Ensayos clínicos con F1/F1CDx Se han identificado nueve ensayos clínicos que evalúan aspectos relacionado con F1 (tabla 8 del anexo VIII), de los cuales cuatro están activos. Siete de estos ensayos fueron realizados por Foundation Medicine Inc. (Cambridge, Massachusetts, EEUU). El primer estudio realizado con F1 fue el estudio titulado Foundatio- nOneTM Test Registry Study. Realizado entre 2013 y 2016 por Foundation Medicine Inc., el objetivo era caracterizar los patrones de utilización de la prueba F1 por parte de oncólogos de EEUU bajo condiciones de práctica clínica rutinaria. El siguiente estudio es IMAGE Study: Individualized Molecular Analy- ses Guide Efforts in Breast Cancer - Personalized Molecular Profiling in Can- cer Treatment at Johns Hopkins que fue realizado, entre 2013 y 2017, por el centro integral del cáncer Sidney Kimmel de Johns Hopkins en colaboración con Foundation Medicine Inc. Era un estudio controlado no aleatorizado de dos brazos con asignación paralela. Los pacientes diagnosticados con cáncer de mama metastásico eran asignados a dos grupos. En uno de los grupos se analizaba el perfil genético del tumor de las muestras de tejido de los pacien- tes con F1 y se sugería un tratamiento en función al perfil genético. En el otro grupo, también se analizaban las muestras sanguíneas de los pacientes con F1 pero no se sugería ningún tratamiento. El objetivo del estudio era estudiar la viabilidad para la identificación de pacientes que podrían benefi- ciarse del análisis del perfil molecular del tumor así como analizar los resul- tados de los pacientes que siguieron la sugerencia del “Molecular Profiling Tumor Board” en comparación con los que no lo hicieron. El estudio observacional realizado entre 2014 y 2017 titulado Concor- dance Between ctDNA Assay and FoundationOne tuvo como objetivo eva- luar si un nuevo ensayo de ctDNA desarrollado por Foundation Medicine Inc. era capaz de detectar alteraciones genómicas en la sangre periférica que fueran consistentes con las alteraciones genómicas detectadas en la muestra de biopsia tumoral primaria y/o metastásica de un paciente mediante F1. El estudio fue financiado por Foundation Medicine Inc., y colaboraron 29 uni- versidades y centros de investigación de EEUU. Otro estudio realizado entre 2015 y 2018, titulado Outcomes of Foun- dationOne Directed Therapy in Cancer of Unknown Primary, consistía en determinar si F1 proporcionaba información que permitiera a los médicos tomar decisiones terapéuticas con terapias dirigidas utilizadas en ensayos clínicos o terapias aprobadas por la FDA, incluyendo fármacos fuera de la indicación de la ficha técnica. El objetivo era evaluar si los resultados, en términos de supervivencia global, eran mejores en los pacientes que recibían la terapia dirigida en comparación con los resultados de los pacientes que INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 90 recibían la terapia estándar. Se trataba de un estudio observacional del tipo estudio de caso, realizado por Foundation Medicine Inc. en colaboración con 29 centros de EEUU, en el que participan 125 pacientes diagnosticados de tumor primario de origen desconocido avanzado no operable o metastásico. El estudio titulado Genomic Profiling in Previously Untreated Metasta- tic Non-small Cell Lung Cancer, realizado entre 2015 y 2017, era un estudio observacional comparativo no aleatorio con siete cohortes. Las cohortes se diferenciaban entre sí en función de si el perfil genético del tumor se anali- zaba por F1 o por otra plataforma, si los resultados mostraban una altera- ción genética intervenible y si el paciente recibía la terapia dirigida indicada por la plataforma utilizada. El objetivo era comparar los datos de supervi- vencia y costes basándose en el uso diferente de la elaboración de perfiles genómicos. El estudio estaba realizado por la empresa Cota Inc. en colabo- ración con Regional Cancer Care Associates LLC, Foundation Medicine Inc. y Horizon BlueCross BlueShield of New Jersey. El estudio terminó sin com- pletarse en 2017 por no alcanzar el número preestablecido en la cohorte de Horizon BlueCross BlueShield. El estudio Comprehensive Gene Sequencing in Guiding Treatment Re- commendations Patients With Metastatic or Recurrent Solid Tumors, que co- menzó en 2013 y aún sigue activo, es un ensayo clínico piloto que implemen- ta la secuenciación genómica integral para guiar las recomendaciones de tratamiento en pacientes con tumores sólidos metastásicos o recurrentes. Está realizado por Ohio State University Comprehensive Cancer Center en colaboración con Foundation Medicine Inc. Los objetivos primarios de este estudio son evaluar la factibilidad y la logística asociadas con un ensayo clí- nico utilizando F1 en un entorno terapéutico académico, así como determi- nar la proporción de pacientes que recibirán una terapia relacionada con el cáncer sobre la base de los resultados proporcionados por la prueba F1. En el estudio participan 150 pacientes diagnosticados con cáncer recurrente o en estadio IV de mama, colon o recto. PROFILER 02 (Evaluation of the Added Value of a Large Molecular Profiling Panel Versus a Limited Molecular Profiling Panel in Advanced So- lid Tumors), es un ensayo clínico multicéntrico aleatorizado con asignación paralela, que comenzó en 2017 y se encuentra en fase de reclutamiento, que se está llevando a cabo en el centro Leon Berard de Francia con la colabora- ción de Roche Pharma. El objetivo es comparar la relevancia clínica de F1 frente al panel CONTROL en pacientes con tumores sólidos avanzados. La medida principal de resultado es comparar la proporción de pacientes para los que se podría iniciar una terapia recomendada identificada genómica- mente utilizando el panel NGS de F1 frente al panel CONTROL, desarro- llado en el centro Leon Berard “Unidad de Caracterización Tumoral”, capaz de analizar 87 genes relacionados con el cáncer. Entre las medidas de resul- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 91 tado secundarias destacan la progresión libre de enfermedad, la tasa de res- puesta global, la duración de la respuesta, medidas de calidad de vida del paciente, número de pacientes con alteraciones dirigidas detectadas por am- bas plataforma, entre otras. El estudio BLCIO (Beating Lung Cancer in Ohio Protocol in Impro- ving Survival in Patients With Stage IV Non-Small Cell Lung Cancer), que comenzó en 2017, es un ensayo controlado aleatorizado con asignación para- lela y sin cegamiento, realizado por Ohio State University Comprehensive Cancer Center en EEUU. El objetivo principal del estudio es observar du- rante seis meses cuáles son las prácticas de atención habitual, supervivencia y calidad de vida de pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón de célu- las no microcíticas en estadio IV. Tras esos seis meses, los pacientes son asig- nados aleatoriamente a dos grupos distintos. Un grupo recibe el tratamiento habitual y en el otro grupo, los pacientes se someten a la toma de muestras de tejido para ser analizado con F1 y muestras de sangre para ser analizados con FoundationACT. En este último grupo, interviene un comité de genómi- ca en el asesoramiento para la toma de decisiones. TEMPO study: A Prospective Observational Trial Evaluating Outco- mes of FoundationOne (Registered Trademark)-Directed Matched Targeted Therapy in Patients with Cancer of Unknown Primary fue un estudio realiza- do entre 2015-2017 por el Instituto del Cancer Peter MacCallum - East Mel- bourne y financiado por Foundation Medicine Inc. Se trataba un estudio observacional prospectivo de un solo brazo que terminó antes de tiempo por dificultades en el reclutamiento de pacientes. El objetivo principal era eva- luar la utilidad clínica de F1 para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de primario desconocido. Se mandaron muestras de todos los pa- cientes a Foundation Medicine Inc. para ser analizadas con F1. Los resulta- dos se enviaron al médico, junto con otras pruebas diagnósticas realizadas, para establecer el plan de tratamiento. Los pacientes se sometían a un segui- miento cada tres meses para obtener información sobre su estado y trata- miento. A parte de los estudios mencionados anteriormente, se han identifica- do cuatro ensayos clínicos en los que se utiliza F1 para elaborar el perfil ge- nómico de los pacientes enrolados en los distintitos ensayos clínicos que evalúan principalmente la respuesta a distintos fármacos antitumorales. El primero de estos ensayos es CheckMate 451: An Investigational Im- muno-therapy Study of Nivolumab, or Nivolumab in Combination With Ipi- limumab, or Placebo in Patients With Extensive-Stage Disease Small Cell Lung Cancer (ED-SCLC) After Completion of Platinum-based Chemothe- rapy. Este estudio comenzó en 2015 y está realizado por Bristol-Myers Squi- bb. Se trata de un ensayo clínico en fase 3, aleatorizado con asignación para- lela y cegamiento de participantes, investigador, evaluador de resultados y INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 92 proveedor de cuidados. El estudio cuenta con tres brazos: en uno de ellos los pacientes reciben nivolumab, en otro brazo, reciben una terapia combinada de nivolumab y ipilimumab y en el tercer brazo reciben un placebo. La me- dida principal es la supervivencia global, y las medidas secundarias la PFS, análisis descriptivos de supervivencia global y PFS para evaluar la monote- rapia con nivolumab frente a la terapia combinada de nivolumab con ipili- mumab. Otra medida de resultados es la TMB que es medida con la platafor- ma F1CDx. El ensayo International Breast Cancer Biomarker, Standard of Care and Real World Outcomes Study BREAKOUT, comenzó en 2017 y está siendo realizado por AstraZeneca en distintos países. Es un estudio de una cohorte de pacientes con cáncer de mama metastásico con receptor HER2 negativo que, han iniciado una QT citotóxica sistémica de primera línea. El estudio estimará la prevalencia BRCA y otros genes de reparación de recombina- ción homóloga (HRR). El estudio también describirá los tratamientos admi- nistrados y estimará los resultados clínicos asociados de la supervivencia global y la PFS entre las portadoras de mutaciones en el contexto de un en- torno de tratamiento con un inhibidor de la ribosa polimerasa de bajo con- tenido en polipropileno ADP. La mutación del gen BRCA analizará, utili- zando una muestra de sangre obtenida preferiblemente durante la práctica clínica de rutina, con la prueba Germline BRCA Test. Cuando se disponga de suficiente cantidad de muestras tumorales almacenadas del paciente se realizará el perfil genómico del tumor utilizando la plataforma F1CDx. Pos- teriormente, se realizará el seguimiento durante 30 meses de los pacientes que hayan dado positivo para los genes gBRCA y sBRCA y otros genes HRR para evaluar los patrones de tratamiento y los resultados clínicos aso- ciados. El estudio titulado Evaluation of the Safety and Tolerability of Nirapa- rib With Everolimus in Ovarian and Breast, realizado por el Hospital Avera McKennan Hospital en EEUU, comenzó en 2017 y tienen un diseño de en- sayo clínico no aleatorizado. Este estudio tiene como objetivo determinar la dosis máxima tolerada de la combinación de niraparib y everolimus, me- diante un diseño tradicional de escalado de dosis, comenzando con el nivel de dosis más bajo y aumentando hasta el nivel de dosis máximo permitido según se especifica en el protocolo. El estudio cuenta con cuatro brazos que se diferencian en las dosis de everolimus y niraparib y en el número de días de administración durante ciclos de 28 días. Una de las medidas secundarias de resultados es evaluar si los pacientes con ciertas alteraciones moleculares responden mejor a la combinación de medicamentos, según indicación de la plataforma F1. Otro estudio realizado también por el Hospital Avera McKennan Hos- pital se titula Evaluation of the Safety and Tolerability of TAK-228 with TAK- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 93 117 and Paclitaxel in Advanced Solid Tumors. Es un ensayo clínico no alea- torizado, que comenzó 2017, cuyo objetivo es determinar la factibilidad y tolerabilidad de la combinación de TAK-228 y TAK-117. El estudio está for- mado por cinco cohortes en las que se varían las dosis de los medicamentos Paclitaxel, TAK-228 y TAK-117. La plataforma F1 es utilizada para evaluar si los pacientes con alteraciones genómicas responden más favorablemente en el grupo de combinación de fármacos. El último estudio identificado, KATIA-Unraveling KAdcyla (Trastuzu- mab Emtansine; T-DM1) Resistance In HER2-positive Advanced Breast Cancer (ABC): a Prospective GEICAM Study, comenzó en 2019, y es reali- zado por el Grupo Español en Investigación de Cáncer de Mama en varios hospitales españoles con la colaboración de Roche Pharma. El objetivo de este estudio es evaluar los mecanismos de resistencia primaria y adquirida a Kadcyla®. F1 se utiliza para analizar el perfil genético de las muestras obte- nidas antes y después del tratamiento. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 94 Discusión En este informe se presenta una revisión sistemática de la literatura científi- ca sobre F1/F1CDx como tecnología NGS para el estudio de cáncer de pul- món, mama, CCR, ovario y melanoma. Desde noviembre de 2018, F1CDx es la tecnología comercializada y ha sustituido a la anterior F1. En los estudios revisados se ha podido ver la evo- lución en el tiempo de este test, con un incremento en el número de genes estudiados. Inicialmente analizaba 3.320 exones de 182 genes relacionados con el cáncer y 37 intrones de 14 genes que frecuentemente presentaban reordenamientos. Después se amplió el análisis a 4.557 exones de 287 genes relacionados con el cáncer y 47 intrones de 19 genes frecuentemente ordena- dos. Con el tiempo, incluyó 315 genes e intrones seleccionados de 28 genes con frecuencia reordenados y la plataforma actual, F1CDx, analiza, hasta el momento, 324 genes. Tan sólo en un artículo64 de los incluidos en esta revi- sión se había utilizado F1CDx. El objetivo de este informe ha sido estudiar si existe suficiente eviden- cia sobre la efectividad diagnóstica y clínica de F1/F1CDx. La validez analí- tica de F1 ya se había demostrado tal como se detalló en el artículo de Frampton y cols11, publicado en 2013. Esta validez analítica se considera un paso previo fundamental antes de que cualquier NGS sea incorporada a la práctica clínica. La revisión de los estudios seleccionados para este informe ha permitido confirmar la validez diagnóstica y utilidad clínica de F1/F1CDx como plataforma genómica en pacientes con alguno de los cinco tumores malignos sólidos seleccionados. F1/F1CDx ha identificado las GAs más fre- cuentes que caracterizan a cada tumor, siendo concordantes con las GAs esperadas y descritas por TCGA, entre otros. Para el estudio genómico de cáncer de pulmón, los estudios inclui- dos18,64,114-121 han mostrado la utilidad de F1 para detectar e identificar las principales GAs y para facilitar, en muchos casos, la selección de un trata- miento específico en función de las GAs encontradas. En algunos estudios se destacó el papel de F1 para detectar otras GAs poco comunes119, algunas de las cuales resultaron ser susceptibles de terapia dirigida. En algunos estudios previos en NSCLC se sugería que la presencia de determinadas GAs excluía otras. Por ejemplo, en los NSCLC con mutacio- nes KRAS se aceptaba que la probabilidad de tener alteraciones en EGFR y ALK era baja. De hecho, algunos algoritmos proponen comenzar el estu- dio analizando la presencia de mutaciones KRAS y sólo en los casos negati- vos se indicaría realizar el análisis de las alteraciones en EGFR y ALK140. Sin embargo, otros autores120 han comprobado que la coexistencia de multitud de GAs en el mismo tumor no es tan baja como se consideraba. También VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 95 estos mismos autores recomiendan realizar un estudio de perfil genómico completo y no hacer estudio secuencial en función de los resultados para evitar el retraso en el inicio del tratamiento si finalmente el análisis NGS confirma la presencia de dianas terapéuticas, especialmente teniendo en cuenta que se trata de pacientes con enfermedad avanzada. Por otro lado, un resultado negativo de NGS resulta de interés para derivar a los pacientes a otros tratamientos o incluso a tratamiento paliativo. Respecto a la validez diagnóstica de F1 en cáncer de mama, los artícu- los seleccionados74,80,82,122-135 confirman su efectividad para identificar las GAs. En el documento de consenso141 surgido de la MAP conference, se decía que el panel de genes óptimo para cáncer de mama debía incluir el estudio de mutaciones AKT1, PIK3CA, PTEN y ESR1 y amplificaciones FGFR1, ade- más de analizar la presencia de los HR, HER2 y BRCA1/2. Ya en la guía clínica de ASCO (American Society of Clinical Onclogy) del 2018 se aconse- jaba estudiar la presencia de GAs en ERBB2 tanto en el momento del diag- nóstico inicial como en las recurrencias142. En la guía de la ESO-ESMO so- bre cáncer de mama avanzado143 se reconoce que la presencia de estas cinco GAs somáticas en PIK3CA, AKT1, ERBB2, mutaciones ESR1 y fusiones NTRK se han asociado a respuesta objetiva. Sin embargo, se dice que la uti- lización de paneles de múltiples genes para análisis mediante NGS no ha demostrado su beneficio clínico y todavía es incierto el impacto en los resul- tados de salud del paciente, por lo que explícitamente aconsejan que no se deben utilizar de forma rutinaria en la práctica clínica. Por el contrario, sí se recomienda que la paciente participe en ensayos clínicos donde se adminis- tren fármacos aún en estudio. Tampoco se recomienda en esta guía el uso de técnicas que estudien el ctDNA. En el único artículo87 incluido sobre F1 en CCR, se observó que F1 fue capaz de detectar las GAs más habituales descritas en este tumor, pero tam- bién otras mutaciones poco frecuentes que tuvieron importancia por su in- fluencia en la toma de decisiones terapéuticas. En los dos únicos estudios137,138 que utilizaron F1 para realizar el estudio genómico de pacientes con cáncer de ovario se comprobó la utilidad de F1 para identificar mutaciones BRCA1/2 como predictoras de buena respuesta a inhibidores PARP. La capacidad diagnóstica para detectar las GAs, en concreto para identificar las CRGAs, y facilitar la elección de inmunoterapia fue señalada por los autores100,105,139 que evaluaron el papel de esta técnica en el estudio de pacientes con mela- noma. Esta capacidad de F1/F1CDx para identificar genes y/o sus alteraciones tiene implicaciones a nivel pronóstico y terapéutico. La utilidad pronóstica se refiere a que estadios de la misma enfermedad podrían tener pronósticos distintos en base al perfil genómico. La información generada podrá tener gran utilidad clínica al posibilitar un tratamiento personalizado de acuerdo INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 96 al perfil genómico de cada tumor144. En unos casos es posible que se trate de una terapia dirigida aprobada para unas GAs concretas; en otros casos, se podrá dirigir al paciente hacia algún ensayo clínico, incluyendo los nuevos tipos de ensayos clínicos, ensayos en paraguas o en cesta, que potencialmen- te tienen menos restricciones por tipo de tumor o perfil molecular. Entre los artículos seleccionados, la utilidad clínica de F1/F1CDx se ha podido estudiar con más detalle en pacientes con cáncer de pulmón porque se aportaban suficientes datos sobre la terapia administrada, sobre la res- puesta tumoral y sobre algunos resultados en salud del paciente, como PFS. Por el contrario, para los demás tumores estos datos sólo aparecían recogi- dos en algún estudio y de forma desigual. A partir de los datos informados por los autores se ha calculado que en torno al 23% de pacientes con cáncer de pulmón recibió el fármaco reco- mendado por F1/F1CDx. Los fármacos dirigidos más utilizados fueron TKIs anti-EGFR como erlotinib, o anti-ALK y MET como ceritinib, crizotinib o alectinib, o MKIs como cabozantinib. Algunos autores18 recomendaron que dada la buena respuesta de los pacientes con fusiones ALK al crizotinib, se empleara este mismo fármaco también para los casos de translocaciones ALK no-EML4, como primera línea o tras QT. Varios estudios confirmaron un marcado beneficio clínico en los pacientes pues se llegó a observar una respuesta objetiva (respuesta parcial y completa) en casi el 70% y estabiliza- ción de la enfermedad en más del 17%. En la mayoría de los estudios revisados, se aplicaron los criterios RE- CIST pero su utilización como método estándar de evaluación de la respues- ta a la terapia dirigida e inmunoterapia es un tema en debate, puesto que RECIST puede infraestimar el efecto terapéutico de la inmunoterapia y no permite evaluar la denominada pseudoprogresión. Por este motivo, a la lar- go del tiempo se han ido desarrollando modificaciones al RECIST (irRE- CIST, iRECIST, imRECIST) aunque no se ha concretado una definitiva y RECIST todavía estaría en uso en la práctica clínica rutinaria44. También se ha observado que F1/F1CDx influye directamente en el manejo clínico del paciente, modificando la toma de decisiones de los profe- sionales sanitarios al recomendar o sugerir los fármacos potencialmente más efectivos para cada caso, en función del perfil genómico identificado. Diver- sos estudios145 han señalado que los resultados de F1 pueden influir en hasta un 21% de los casos, un porcentaje muy similar al encontrado en esta revi- sión para los pacientes con NSCLC (19,16%). Gong y cols87 confirmaron que F1 permitió identificar algunas mutacio- nes en CCR que predicen con gran seguridad la falta de respuesta a los an- ti-EGFR y además de descartar mutaciones RAS en varios pacientes que tenían amplificaciones ERBB2. De estos últimos, algunos pacientes pudie- ron ser tratados con anti-EGFR y controlar la enfermedad durante más de 4 VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 97 meses. Estos autores destacaron la importancia de realizar un análisis del CGP con el mayor número posible de genes, como también se recomienda en la guía de la SEOM31, de 2019, y en la GPC elaborada por las sociedades científicas American Society for Clinical Pathology, College of American Pa- thologists, Association of Molecular Pathology y la American Society of Clin- cial Oncology, publicada en 2017146. Se debe realizar un estudio de perfil genético completo del CCR con el objetivo de descartar la presencia de mu- taciones BRAF y el “extended” o “expanded” RAS para detectar mutaciones en exones 3 y 4 de KRAS y exones 2, 3 y 4 de NRAS antes de tomar decisio- nes terapéuticas. Ese análisis mutacional “expanded RAS” tiene un alto va- lor predictivo negativo (con alta probabilidad el paciente no va a responder al tratamiento anti-EGFR). Por esto, la terapia dirigida anti-EGFR sólo es- taría indicada una vez descartada la presencia de dichas mutaciones y esta prueba se ha convertido en un requisito imprescindible antes de utilizar los fármacos cetuximab o panitumumab85. No se han encontrado suficientes datos para establecer la utilidad de F1 para evitar el uso de terapias innecesarias. Tan sólo algunos autores114 aportaron datos referentes a esta posibilidad pero el número de pacientes analizados ha sido muy escaso. Además de identificar GAs, F1/F1CDx incluye el análisis y cuantifica- ción de los biomarcadores predictivos de respuesta a la inmunoterapia, TMB y MSI. Diversos estudios110,147,148 han confirmado la correlación entre niveles altos de TMB y una buena respuesta tumoral a los anti-P1 y anti-PD-L1, en especial en tumores como el NSCLC64,118 y melanoma100,105,139, que se caracte- rizan por su elevada carga mutacional. Tanto la respuesta tumoral como otros resultados de supervivencia global y PFS han resultado significativa- mente superiores en comparación con los de pacientes con TMB baja/inter- media139. Hellman y cols64 estudiaron los biomarcadores TMB y la expresión de PD-L1 como predictores de respuesta a la inmunoterapia con nivolumab + ipilimumab, confirmando una buena respuesta al tratamiento (respuesta objetiva en un 45% de los pacientes) y que tanto esta respuesta tumoral como la PFS eran significativamente superiores en los casos en que la TMB era >10 mut/Mb y PD-L1>1%. También la supervivencia fue mayor en los tratados con inmunoterapia frente al grupo de QT (24% frente al 3%). En cambio, Rozemburg y cols118 no encontraron relación entre la TMB y la res- puesta a la inmunoterapia con nivolumab o pembrolizumab. Existe acuerdo entre los artículos revisados sobre la utilidad de realizar F1 a los pacientes con tumores recidivantes o recurrentes por su utilidad para diagnosticar si existen nuevas GAs que justifiquen la recurrencia tumo- ral o la resistencia a ciertos fármacos, pues se ha demostrado que el tumor evoluciona con el tiempo y las GAs potencialmente intervenibles pueden ser diferentes del tumor primario, lo que llevaría a cambiar la medica- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 98 ción82,149,150. Por ejemplo, las amplificaciones ERBB2 parece que serían más frecuentes en los tumores de mama recidivantes125. No obstante, otros auto- res129 constataron una alta concordancia en las GAs en el tumor primario de mama y en las recurrencias o metástasis, por lo que sólo recomendaban re- petir el estudio de F1 en nuevas biopsias de recurrencias/metástasis cuando la sospecha de cambio molecular en el tumor secundario era evidente. Sin embargo, la opinión más extendida es que los resultados del CGP de una muestra pueden no ser representativos del tumor meses o años después151,152 y se cuestiona la utilidad de los resultados de un test NGS realizado sobre muestra del tumor primario cuando el objetivo es aconsejar el tratamiento de futuras recurrencias153. Por tanto, sería recomendable realizar una nueva biopsia antes de iniciar un nuevo tratamiento, aunque esto no siempre es posible, bien por inaccesibilidad de las recurrencias o por insuficiente canti- dad de tejido, además del inconveniente de tener que someter al paciente, de nuevo, a un intervención invasiva y el retraso potencial en el inicio del trata- miento, además del incremento de los costes económicos. Además, es posible que el perfil genómico sufra cambios relacionados con el tratamiento admi- nistrado123. Por eso, cuando el tumor progresa y se sospecha que ha desarro- llado resistencias al tratamiento, también se recomendaría realizar un nuevo estudio de muestras de biopsias recientes siempre que sea factible. No está claro si debe realizarse el estudio de CGP en los tumores ini- ciales aunque algunos autores sí lo recomiendan. Se cree que posiblemente se obtendrían mejores resultados si se iniciara antes el tratamiento persona- lizado, cuando todavía los tumores se han sometidos a pocas líneas de trata- miento y no se han hecho resistentes. De hecho, muchos fármacos dirigidos están ya indicados como primera línea terapéutica. Además, en los artículos revisados uno de los motivos mencionados con más frecuencia por el que los pacientes no han llegado a recibir el tratamiento recomendado o sugerido por F1 es el marcado deterioro clínico que muchos presentan cuando se rea- liza el test o cuando llegan sus resultados123,145,150,154. Según algunos estudios, hasta un 25% de los pacientes no lograría un beneficio terapéutico, bien por estar ya muy avanzada la enfermedad o bien por el deterioro del paciente que lleve a desaconsejar el tratamiento sistémico155,156. Por esto, diversos au- tores150,154,157 cuestionan el momento de realizar los tests genómicos y propo- nen que se debería realizar de manera precoz en el curso de la enfermedad con el fin de facilitar la identificación y uso de terapias dirigidas, dando opor- tunidad a los pacientes a recibir un tratamiento dirigido que pudiera ser efectivo pero antes de que la enfermedad progrese y el deterioro clínico del paciente desaconseje su utilización. Por otro lado, en los pacientes en los que la enfermedad ha progresado y se ha decidido realizar un estudio del perfil genómico para buscar un tra- tamiento dirigido a las CA intervenibles, resulta importante disponer lo an- VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 99 tes posible de esta información. Por eso, un elemento importante a conside- rar en las plataformas de NGS para su aplicación clínica es el tiempo que tarda cada test en generar el informe, el denominado turnaround time, pues- to que generalmente durante este tiempo el paciente no está recibiendo nin- gún tratamiento a la espera del que sugiera la NGS. Se puede disponer del informe de F1/F1CDx en unos 14 días y otras plataformas de NGS pueden generarlo incluso antes. En el estudio comparativo entre F1 y PCDx realiza- do por Weiss y cols158, PCDx fue significativamente mejor que F1 en este aspecto, con una diferencia mediana de 9 días. Con la evolución tecnológica en el ámbito del análisis bioinformático, se espera acortar el tiempo de ob- tención de resultados con las NGS. Especialmente aquellas plataformas NGS con paneles de más de 100 genes, requieren al menos 7 días hasta ob- tener resultados, a diferencia de las técnicas de secuenciación tradicionales de estudio de hotspot de un solo gen83. Cuanto más corto sea este tiempo, mayor influencia clínica podría tener. La realización de F1CDx en un paciente tendría sentido cuando existe un tratamiento dirigido aprobado para su uso en la patología concreta de ese paciente. En estos casos, es importante confirmar que el paciente tiene la diana molecular sobre la que actuará el fármaco. Otra situación en la que se podría indicar el análisis con F1CDx es si el tratamiento estándar del tumor ha fracasado y es necesario buscar otros fármacos, incluyendo la terapia di- rigida. También en pacientes con alto riesgo de progresión de la enfermedad, la información genómica nos ayudaría a plantear tratamientos incluso en situaciones en las que el tratamiento convencional estaría descartado. En opinión de Johnson y cols159 el paciente candidato a F1 sería aquel con cán- cer metastásico o irresecable candidato a tratamiento sistémico con al me- nos una de las siguientes condiciones: no hay disponible otros tests genéticos para el tumor en estudio en concreto; al paciente ya se le han realizado otros tests genéticos pero no se han detectado alteraciones intervenibles; no existe tratamiento estándar o las opciones son mínimas o se quiere testar con el fin de decidir su inclusión en ensayos clínicos. Por otro lado, no todos los pacientes candidatos a un fármaco recibie- ron finalmente dicha medicación y esto fue debido a diferentes motivos: en algunos casos fue por la falta de disponibilidad o de acceso al fármaco128,138,160 o por la imposibilidad de participar en algún ensayo clínico donde se utiliza- ra dicho fármaco; otras veces, como ya se ha mencionado, fue por el estado de salud del paciente, pues a veces el proceso tumoral está en un estadio ya muy avanzado y el paciente tiene un deterioro significativo que desaconseja su uso123; en otros casos es el propio paciente quien rechazó el tratamiento o incluso es posible que hubiera fallecido antes de disponer de los resultados de F1. También los problemas relacionados con la financiación o reembolso de esta técnica se mencionan como impedimento para someterse al trata- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 100 miento porque pueden no estar incluidos en las coberturas sanitarias públi- cas o privadas, siendo el coste una de las barreras principales para su uso clínico. En muchos de los artículos revisados se hace mención a que la elección del tratamiento es decisión del clínico encargado del paciente. Algunos au- tores proponen que para este tipo de decisiones, sería conveniente la crea- ción de un comité de expertos, que a la vista de la información genética y de las opciones terapéuticas disponibles, tomara, por consenso, esa decisión. En algunos centros hospitalarios de reconocido prestigio se han puesto en mar- cha comités de tumores, con profesionales multidisciplinares, para estudiar e interpretar las GAs encontradas en cada tumor y cada paciente, para revisar las GAs intervenibles y para revisar la evidencia científica publicada sobre las GAs identificadas y los posibles fármacos recomendados en función de las mismas. Entre estos Comités puede mencionarse a GAITWAY (Genetic Alterations in Tumors With Actionable Yields), de John Hopkins Kimmel Cancer Center130. También en San Diego Moores Cancer Center se consituyó el Molecular Tumor Board en la Universidad de California, con el fin de optimizar el manejo terapéutico de pacientes con cáncer de mama avanzado hipertratado132. Las terapias dirigidas tienen como diana aquellas GAs específicas del tumor, y es esta especificidad la que permite actuar sobre las células tumo- rales sin dañar a las células sanas no tumorales, generando menos EAs que la QT convencional. No obstante, tanto la terapia dirigida como la inmuno- terapia no están exentas de EAs, por lo que la decisión de utilizarlas deberá estar sólidamente respaldada para evitar que se utilicen en pacientes que no vayan a responder, exponiéndoles a un riesgo innecesario a los EA se- cundarios. De hecho, para iniciar el tratamiento con cualquier fármaco diri- gido es necesario que se haya confirmado la presencia de la GA diana para dicho fármaco. Entre los EAs relacionados con el uso de terapia dirigida, los más frecuentes son diarreas y problemas hepáticos, como hepatitis o incremento de las enzimas hepáticas. Otros son problemas cutáneos (rash, sequedad de piel, despigmentación del pelo); incrementos en la tensión ar- terial; trastornos de coagulación y de forma muy excepcional, perforación gastrointestinal. Algunos de estos EAs se dan en los pacientes que mejor están respondiendo al tratamiento161,162. En general, se acepta que la inmu- noterapia se tolera mejor que la QT pero también se han descrito algunos irEAs asociados que si no son reconocidos y diagnosticados a tiempo, pue- den ocasionar un incremento en la morbilidad y, con menos frecuencia, el fallecimiento del paciente. El irEA más frecuente suele ser la fatiga. Otros irAE descritos son neumonitis, hipotiroidismo, nefritis, rash cutáneo, colitis, pero son relativamente poco frecuentes (en un 4-8%, de todos los grados de severidad)163. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 101 Sólo en dos artículos seleccionados para esta revisión se han aportado datos sobre la seguridad de F1/F1CDx. En el artículo de Hellman y cols64 se comprobó que la frecuencia de EAs había sido superior en los pacientes con NSCLC tratados con inmunoterapia, en comparación a los que recibieron QT. La complicación más habitual fue la toxicidad a nivel cutáneo, y entre los EAs de grados 3 y 4, el incremento de enzimas hepáticas. Además, estos autores informaron sobre varios fallecimientos en los tres grupos de trata- miento estudiados. Yuan y cols123 mencionaron la aparición de toxicidad (in- cremento de enzimas hepáticas) asociada al pazopanib con una paciente con cáncer de mama, que la obligó a suspender el tratamiento. En algunos estudios incluidos en esta revisión se ha analizado la con- cordancia entre F1 y otras técnicas convencionales como FISH o el análisis IHC pero, en general, se limitaba a pocos pacientes y en los casos discrepan- tes, resultaba difícil precisar si se trataba de falsos positivos de una prueba o falsos negativos de la otra, tal como reconocieron algunos autores114. Esta ausencia de patrón de referencia ya había sido mencionada en un estudio comparativo entre varias plataformas genómicas en cáncer de mama164. Va- rios estudios18,117,137 confirmaron que la efectividad diagnóstica de F1 era su- perior, detectando algunas GAs en pacientes con resultados falsos negativos con FISH o IHC, lo que podía suponer una clara influencia en el tratamien- to. En la práctica clínica, muchos centros utilizan IHC como test de scree- ning por ser rápido y de bajo coste, en comparación a FISH que implica un mayor consumo de tiempo y de costes. A la vista de los resultados de esta revisión, en aquellos casos negativos, estaría indicado realizar NGS para confirmar o no el diagnóstico y poder tratar a los pacientes que potencial- mente se beneficiarían de la terapia dirigida, especialmente cuando la pro- babilidad de identificar GAs intervenibles es alta, por ejemplo, en pacientes jóvenes no fumadores con adeconcarcinoma de pulmón118,165. Desde diferentes sociedades y entidades científicas se reconoce que el avance en el conocimiento de las GAs ha facilitado el desarrollo y uso de terapias dirigidas e inmunoterapia y contribuido a un mejor pronóstico de vida de estos pacientes con NSCLC33,47. También se reconoce en la guía de la SEOM sobre el tratamiento del NSCLC66 publicada recientemente. Existe un acuerdo bastante generalizado sobre la importancia de realizar estudio del perfil genómico a todos los pacientes con NSCLC independientemente del tipo histológico120. El análisis debe incluir la detección de las GAs y la determinación de los biomarcadores de respuesta a la inmunoterapia. La guía elaborada en 2018 por el College of American Pathologists, la Interna- tional Association for the Study of Lung Cancer y la Association for Molecu- lar Pathology47 establece las recomendaciones de análisis molecular en cán- cer de pulmón avanzado para facilitar la toma de decisiones terapéuticas. Se definen 3 categorías de genes: una formada por EGFR, ALK y ROS1, que INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 102 debían estudiarse en todos los pacientes con adenocarcinoma de pulmón; un segundo nivel de genes que incluye BRAF, MET, RET, ERBB2 y KRAS, que se analizarían si se dispone de suficiente material; y el resto de genes, que se consideran todavía en investigación. También en esta guía se reco- mienda estudiar a los pacientes con mutaciones EGFR sensibles a TKIs an- ti-EGFR que progresen tras dicho tratamiento por la posibilidad de que hayan desarrollado la mutación EGFR T790M y se aconseja emplear tests que hayan demostrado su capacidad diagnóstica con tan sólo un 5% de cé- lulas viables. Si se presenta esta mutación T790M, el tratamiento recomen- dado es osimertinib; y si las GAs identificadas son la sustitución L858R en el exón 21 o deleciones en el exón 19, los tratamientos aprobados que se indi- carían son erlotinib, afatinib y gefitinib. También en esta guía se recomienda el estudio de los genes ROS1 y ALK en todos los pacientes con adenocarci- nomas, independientemente de las características clínicas. La IHC se acepta como test de sceening para estudiar las GAs en ROS1, aunque todo resulta- do positivo debe confirmarse con pruebas moleculares. Además, se reconoce que GAs en genes como BRAF, MET, KRAS, ERBB2 y RET verán incre- mentada su importancia clínica a medida que las tecnologías NGS avancen. No se recomienda realizar el análisis molecular de forma individual de estos genes de manera rutinaria en todos los pacientes, pero sí incluirlos como parte de paneles mayores de genes cuando el análisis de EGFR, ALK y ROS1 haya sido negativo. Los autores consideran que los paneles de múlti- ples genes son preferibles frente a múltiples tests de un único gen para poder identificar otras opciones terapéuticas más allá de EGFR, ALK y ROS1. Respecto a los tumores que no fueran adenocarcinomas, esta guía recomien- da que el estudio molecular sólo se debe realizar si existen características clínicas que hagan sospechar con una alta probabilidad la presencia de dri- vers oncogénicos. Además, en esta guía se incluyen recomendaciones sobre el estudio del ctDNA para pacientes con adenocarcinoma de pulmón, que no estaría indicado para el tumor primario sino sólo para las recurrencias o cuando del tumor progresa o se desarrollan resistencias a los TKIs EGFR. En aquellos casos en los que el test de ctDNA presente un resultado negati- vo, se recomienda realizar el análisis molecular sobre muestras tisulares para confirmar el resultado. También desde 2014, la NCCN recomienda que en los pacientes con cáncer de pulmón metastásico se debe realizar un estudio de “perfil molecu- lar amplio” que incluya las siguientes GAs: mutaciones EGFR, fusiones ALK, mutaciones BRAF, mutaciones ERBB2, amplificaciones MET, reorde- namientos RET y reordenamientos ROS161. Igualmente, en la MAP (Mole- cular Analyses for Personalized Medicine) conference141 se recomendó estu- diar de forma rutinaria en la práctica clínica mutaciones EGFR y reordenamientos ALK y ROS1 en todos los pacientes con NSCLC, y para VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 103 valorar si incluir a los pacientes en ensayos clínicos debían analizarse las si- guientes GAs: mutaciones en EGFR, BRAF, HER2, KRAS, PIK3CA, NTKR, ALK, MET, AKY1, BRCA1/2, HRAS y NRAS; reordenamientos de ALK, ROS1 y NTRK; amplificaciones en RET, MET y EGFR; y mutaciones o amplificaciones en FGFR1/2/3 y NOTCH1/2. Sin embargo, a pesar de que existe cierto consenso entre las sociedades científicas europeas y americanas en cuanto a las recomendaciones de estu- dio molecular de los tumores de pulmón, su seguimiento es muy desigual entre los diferentes países y centros hospitalarios45,118. Entre los motivos de esta falta de adherencia a las recomedaciones de estudio genómico están algunas de índole financiera (reembolso por los sistemas de salud), la insufi- ciente cantidad de tejido para el análisis o problemas en la obtención de las muestras biológicas, las limitaciones en la coordinación de los distintos pro- fesionales sanitarios o la dificultad en la interpretación de resultados166. La revisión de la literatura ha puesto de manifiesto que existen muy pocos estudios comparativos entre F1 y otras plataformas genómicas, y nin- guno que compare F1CDx con otras. Capdevilla y cols112 compararon CMI, F1 y OncoDEEP®, analizando diferentes aspectos como las tecnologías em- pleadas, la validez analítica y el impacto clínico, y concluyeron que CMI era la plataforma más completa porque estudiaba un mayor número de genes, tenía una mayor capacidad predictiva de respuesta a numerosos fármacos y mayor impacto clínico que F1 (de OncoDEEP® no localizaron datos sobre utilidad ni beneficio clínico). No obstante, la revisión no fue sistemática tal como reconocieron los autores. Weiss y cols30 realizaron una evaluación comparativa entre F1 y PCDx a partir de muestras de 21 tumores sólidos y comprobaron la existencia de discrepancias significativas en la detección de las alteraciones intervenibles entre las dos plataformas y de un TAT más rápido para PCDx. Se han empleado otras plataformas de NGS pero sólo para comple- mentar el diagnóstico de las GAs, no se trataba de estudios comparativos entre dichas GAs. Así, en dos de los estudios revisados118,124 utilizaron G360 para analizar el ctDNA cuando no se disponía de suficiente tejido muestral, en uno126 utilizaron también F1 Heme y en otro artículo120 se utilizaron CMI y Response Genetics Inc, además de F1. Existen algunas alternativas a F1CDx aprobadas por la FDA como CDx para la detección de algunas GAs sobre muestras tumorales FFPE de los cinco tumores para los que está aprobado F1CDx19. Ver listado en el ane- xo II. Para NSCLC sólo una de las técnicas aprobadas es una NGS, Oncomi- ne CDx Target Test, que se utilizaría para identificar la deleción en el exón 19 y la mutación L585R del gen EGFR. El resto de tests para NSCLC están basados en PCR. Para pacientes con cáncer de ovario, el estudio de BRCA1/2 se puede hacer con la NGS Foundation Focus CDxBRCA. En pacientes con INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 104 CCR, las mutaciones en los genes KRAS y NRAS se pueden estudiar con la NGS Praxis Extended Ras Panel. Los otros dos tests aprobados como CDx se basan en PCR y sólo estudian el gen KRAS. Para melanoma y mama, la FDA no ha aprobado ninguna técnica NGS como CDx. Por tanto, quedaría un número importante de GAs en estos tumores para los que no existe una alternativa diagnóstica CDx aprobada por la FDA. La gran ventaja de F1C- Dx es la posibilidad de estudiar otros muchos genes de forma simultánea en el mismo test, mientras que las demás pruebas sólo permitirían identificar GAs en uno o un número muy escaso de genes. En el momento actual, existen diversos tests moleculares comercializa- dos, con diferentes niveles de evidencia, cuya elección supone un reto para los oncólogos158. En la práctica clínica oncológica resulta fundamental la ca- pacidad del test para informar de la manera más exacta posible sobre aque- llas alteraciones moleculares que sean intervenibles y clínicamente significa- tivas, y que el informe aportado indique de la manera más clara y concisa posible los fármacos disponibles para las GAs detectadas. Oncólogos del National Cancer Institute reconocieron tener un escaso conocimiento en el ámbito genético además de falta de tiempo durante la asistencia a los pa- cientes, y consideraron fundamental que los informes de las diferentes plata- formas de NGS fueran concisos y claros para ayudar en la elección de los fármacos dirigidos más adecuados en cada caso167. F1CDx, igual que otras plataformas NGS, presenta ciertas limitaciones técnicas. Por un lado, unas limitaciones relacionadas con la muestra tumoral. Es necesario disponer de una cantidad suficiente de DNA para poder reali- zar el test. Algunas muestras proceden de biopsias core de pequeño tamaño, de aspiraciones con aguja fina o de bloques celulares de tejido maligno pleu- ral, pericárdico o peritoneal, que suelen contener una proporción relativa- mente baja de células tumorales (alta contaminación por células no tumora- les y de contenido necrótico) que afectarían a la sensibilidad de la prueba153, a diferencia de las muestras tomadas en el ámbito de la investigación donde es más frecuente disponer de un alto contenido tumoral. Por eso se requie- ren protocolos en los que sea posible el manejo de pequeñas cantidades de tejido. Se estima que los paneles de 400 genes requieren unos 60 ng de DNA y los paneles de 50 genes, unos 10 ng de DNA. Dado que en una célula hay aproximadamente 1 pg de DNA, el total de células necesario para realizar un estudio NGS de calidad oscilará entre 10 y 60.000 células120. La proporción de células tumorales en un cáncer es una característica propia del tumor mientras que las diferencias de pureza en la muestra no lo son, sino que se deben a otras cuestiones metodológicas, como la destreza del cirujano al tomar la muestra, y pueden afectar a los resultados de los análisis genéticos, interfiriendo con las terapias diseñadas basados en ellos168. Se acepta que una pureza tumoral del 60% sería suficiente para detectar el VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 105 perfil genómico de un tumor respecto a las células normales de la muestra. Para estudiar CNAs es necesario que la muestra contenga al menos un 20% de núcleos tumorales. Si no se alcanza este porcentaje, el riesgo de no detec- tar amplificaciones en el número de copias o pérdidas homocigóticas se in- crementa considerablemente83. Por otro lado, se manejan muestras de tejido FFPE y, además, en el proceso de secuenciación el DNA puede sufrir daños, que podrán evitarse o limitarse aplicando protocolos rigurosos de extracción del DNA y la cons- trucción de librerías de secuenciación. También la heterogeneidad intratu- moral153, que se mide por la presencia de multitud de GAs subclonales, pue- de repercutir en la calidad de la biopsia y en la exactitud diagnóstica del posterior análisis genético, lo que representa un reto para establecer un tra- tamiento personalizado adecuado. Tampoco está claro que el análisis de una sola muestra de biopsia sea siempre representativo de lo que ocurre a nivel global en el tumor153, y espe- cialmente si la enfermedad tumoral está diseminada. De modo que aún falta por resolver cuál es el origen (tumor primario, de las recurrencias, de las metástasis o si utilizar el DNA circulante) más adecuado de donde tomar las muestras. Mientras que la biopsia tisular presenta las limitaciones por toma de muestra en una única localización, el análisis del ctDNA de sangre peri- férica permitiría valorar la heterogeneidad tumoral al incluir DNA de célu- las metastásicas de diferentes lugares. La desventaja de este test en ctDNA es que este DNA sólo aparece en sangre una vez que las células tumorales han sufrido hipoxia y necrosis y han liberado el DNA al torrente sanguíneo. Algunos autores como Jones y cols169 consideran que es necesario rea- lizar la secuenciación de tejido sano además de analizar el tejido tumoral porque se cree que hasta un 15-20% de las GAs detectadas en un tumor puedan ser, realmente, alteraciones en la línea germinal. De esta manera se podrá discriminar entre alteraciones somáticas y de la línea germinal, e iden- tificar las GAs dianas frente a las que tomar las oportunas decisiones tera- péuticas133. En el mismo tumor se pueden dar varias GAs que sean dianas terapéu- ticas por lo que surje la necesidad de priorizar aquellas frente a las que se establecerá el tratamiento. Todavía faltan por establecer algoritmos que es- tratifiquen o representen la mejor secuencia terapéutica a seguir. Es posible que para el mismo tumor se den varias recomendaciones de distintos fárma- cos y que la opción de combinar varios fármacos sea la más adecuada, aun- que para pocas combinaciones de fármacos se dispone de resultados de se- guridad procedentes de ensayos clínicos. En otros casos, aunque se den varias GAs en el mismo tumor, administrar una sola terapia dirigida para una sola GA podría resultar efectivo131. Además, el impacto de una GA y su respuesta al tratamiento puede ser diferente según el tipo de tumor. Por INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 106 ejemplo, la mutación BRAF V600E predice buena respuesta al vemurafenib en melanomas pero no en CCR. A pesar de estos riesgos relativos a la muestra y a los procesos técnicos, varios estudios114,170 han comprobado que F1CDx, como otras NGS, se puede aplicar de forma satisfactoria en la mayoría de las muestras tumorales, inde- pendientemente del método empleado para la obtención de las mismas (ex- cisión quirúrgica, biopsia con aguja gruesa, PAAF, etc) y del tiempo transcu- rrido desde la obtención de las muestras. Algunas de las limitaciones se podrían resolver con las técnicas de biop- sia líquida que permiten estudiar las células tumorales circulantes y el ctD- NA. Se espera que en un futuro próximo, el análisis del ctDNA se pueda utilizar como biomarcador no invasivo para detectar en tiempo real la pre- sencia de tumores residuales, monitorizar la respuesta tumoral al tratamien- to171, con la ventaja de no ser invasiva y permitir la repetición del análisis a lo largo del tiempo, si fuera necesario44,172. La evolución en esta tecnología está permitiendo niveles de sensibilidad y especificidad elevados, incluso con can- tidades muy bajas de ctDNA en las muestras sanguíneas lo que contribuirá a detectar y tratar de forma precoz a los pacientes con cáncer. Algunos auto- res130 han confirmado, que la biopsia líquida permite detectar más mutacio- nes en cáncer de mama que el análisis NGS tisular, y para otros171,173 permiti- ría diferenciar si persiste enfermedad residual microscópica, que requeriría un tratamiento añadido sistémico, de aquellos otros casos sin enfermedad diseminada que podrían tratarse sólo con terapia local. Sin embargo, en los estudios de Chae y cols124,174 se encontró una baja concordancia entre ambas pruebas, siendo F1 la técnica que permitía detectar un número de GAs signi- ficativamente superior. Los autores consideraron que el análisis de ctDNA resultaba más útil para confirmar la presencia de alteraciones genéticas que para descartarlas, dada su alta especificidad. Chae y cols124,174 estudiaron sub- clones y VUS con el fin de realizar un estudio comparativo lo más completo posible de la concordancia de la NGS en tejido tumoral y en ctDNA, con el objetivo de estudiar si ambas técnicas coincidían no sólo en los genes afecta- dos sino también si eran capaces de identificabar las mismas secuencias. Estos autores concluyeron que había una alta concordancia entre los dos tests cuando se estudiaba si las GAs estaban presentes o ausentes, pero si el obje- tivo era analizar un subgrupo concreto de genes con alteraciones en el DNA, la concordancia entre los tests era relativamente baja. Se detectaron más mu- taciones en el tejido tumoral obtenido de biopsia que en el análisis del ctD- NA, aunque se reconoció que existía una cantidad considerable de mutacio- nes que se sólo podían detectar mediante una de las plataformas y que una gran proporción de GAs no eran detectadas por ambas NGS. Así, en el estu- dio referente a pacientes con cáncer de mama124, un 25,6% de las alteraciones tisulares se encontraron también en el ctDNA y un 30,3% de las alteraciones VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 107 detectadas en ctDNA se encontraron en las muestras tisulares. En torno al 50% de las mutaciones detectadas por una técnica no eran detectadas por la otra, lo que se explicaría por la heterogeneidad tumoral y ante este hecho los autores consideraron la posibilidad de que ambas tecnologías tuvieran un papel complementario. Es posible que la concordancia de resultados entre los tests genómicos NGS realizados en tejido tomado de biopisa y sobre el ctDNA dependa de algunos factores como el tiempo transcurrido entre la toma de ambas muestras, el tipo de cáncer y el sitio donde se realizó la biop- sia. Parece que en los tumores de páncreas, ovario, CRC, mama, vejiga, gas- troesofágicos, melanoma y CHC, la probabilidad de detectar ctDNA es ma- yor que en los tumores cerebrales, renales, de próstata y tiroides. El único IETS sobre las tecnologías NGS fue realizado por NICE para estudiar la efectividad clínica de CMI como guía para el tratamiento del cáncer175 y se confirmó que CMI influía en la toma de decisiones terapéuticas en varios tumores sólidos y que los tratamientos indicados suponían un in- cremento en la PFS, superior a la de aquellos pacientes en los que la decisión terapéutica la habían tomado sólo los clínicos sin información de CMI. La opinión de cuatro especialistas recogida en este informe en relación a aspec- tos como la población en la que estaría indicado el uso de CMI, su impacto clínico y el impacto sobre el sistema sanitario en términos de costes, puso de manifiesto opiniones diversas, incluso contrarias en algunos aspectos. Sí hubo acuerdo entre los expertos en la necesidad de realizar más estudios en centros de Reino Unido pues todos de los revisados se habían realizado fue- ra, en que se hicieran estudios comparativos entre CMI y otras alternativas y estudios de análisis coste-efectividad. Tal como manifiestan Joosten y cols6, la implantación de las diferentes plataformas basadas en NGS dependerá de factores, económicos, organiza- tivos, éticos y sociales. Ante este tipo de pruebas diagnósticas será necesario preguntarse si los hospitales disponen de los medios técnicos y humanos requeridos para su implantación, si existe el conocimiento suficiente para utilizar la información aportada por estos paneles en la práctica clínica y si es posible administrar el tratamiento dirigido que estos tests recomiendan. Aunque el coste de F1 no era objeto de estudio de esta revisión, en al- gunas publicaciones se hace referencia a ellos. Así, en el estudio comparativo de Weiss y cols158 se recoge que el coste de un test con PCDx es de USD $4.880 por muestra y con F1, USD $5.800. Rozenblum y cols118 mencionaron que, en su entorno y a fecha de 2015, el coste de un test NGS sobre tejido tumoral era de USD $5.274 y el de NGS sobre biopsia líquida de USD $4.838. El elevado coste de la mayoría de las terapias dirigidas podría ser una limitación para su uso, pero algunos estudios han constatado que la identificación de determinadas dianas terapéuticas y la administración de una terapia dirigida suponen una potencial reducción en los costes totales. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 108 Por ejemplo, Henk y cols176 observaron que en pacientes con NSCLC avan- zado, el tratamiento con erlotinib dirigido a mutaciones EGFR se asociaba a unos costes inferiores que el tratamiento con QT y agentes biológicos, tanto como primera y segunda línea terapéuticas, por resultar más efectivo y por ocasionar una menor tasa de EA. Uno de los problemas asociados al estudio genético con F1CDx son los relacionados con aspectos éticos. Por un lado, no existe acuerdo respecto a la información que debe recogerse y ofrecerse al paciente en cada informe ge- nerado. Tampoco está claro cómo manejar ni interpretar hallazgos inespera- dos: si informar o no sobre ellos al paciente, porque algunas alteraciones patogénicas en individuos concretos pueden llegar a no desarrollar la enfer- medad, por esto las mutaciones patógenas inesperadas no se debe interpre- tar de manera aislada, pero también porque algunas GA son sólo VUS por el momento pero en un futuro podrían tener una significación patológica. Por otro lado, no todas las variantes encontradas suponen las mismas conse- cuencias clínicas ni de la misma relevancia, unas veces en el individuo, otras en su descendencia pero no en el propio individuo y otras sólo suponen mayor riesgo, pero no implican que la enfermedad se desarrolle con total seguridad. También se asocian problemas relacionados con la confidenciali- dad de la información, el almacenamiento de los datos, posible acceso a los mismos para investigación, etc. El progreso en las plataformas NGS, integrando otros niveles de infor- mación como la proteómica o la epigenética, supondrá un mayor conoci- miento molecular de la enfermedad tumoral y permitirá el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos, que se espera conduzcan a unos mejores resulta- dos en salud para los pacientes. Pero, además, permitirá que GAs que hoy no son intervenibles lo sean en un futuro, haciendo que la terapia dirigida sea más efectiva y se consigan alcanzar mejores resultados en salud para el pa- ciente, en especial, la supervivencia y calidad de vida. Por esto, algunos auto- res159 proponen que aquellos pacientes con VUS sean tratados en el contexto de ensayos clínicos, porque probablemente en el futuro sean identificadas como marcadores pronósticos o predictivos de respuesta tumoral aunque en el momento del diagnóstico no se disponga de suficiente evidencia. Otros autores9, por el contrario, consideran que tanto las VUS como las alteracio- nes genómicas de baja frecuencia, de las que sólo se dispone de información procedente de estudios de un único caso o presentaciones en abstracts de congresos o de datos experimentales, no deberían utilizarse para la toma de decisiones terapéuticas pues se espera que la mayoría no sean patogénicas y si se consideran podrían exponer al paciente a terapias no efectivas, costosas e incluso que provoquen eventos adversos. Esto fue una de las críticas reali- zadas al estudio de validación del F1 de Frampton y cols11, donde se propu- sieron ciertas terapias dirigidas para algunas VUS identificadas. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 109 El avance tecnológico permitirá mejoras en el sentido de realizar se- cuenciaciones a mayor profundidad, o poder medir la expresión de ciertas proteínas y no sólo las alteraciones genómicas (como ya ocurre con PCDx porque incluye el análisis IHC además del test NGS). La investigación avan- za hacia otras formas alternativas más rápidas, sencillas y de menor coste, como es la secuenciación de tercera generación, con la que se elimina la etapa de amplificación del DNA y se realiza la secuenciación a partir de una única molécula de DNA con la tecnología SMRT (single molecule real time sequencing), basada en la lectura de la hebra molde de DNA (hebras de mayor longitud). Calidad de la evidencia El diseño de los estudios incluidos, que en su mayoría eran series de casos retrospectivas, el número pequeño de pacientes incluidos, la heterogeneidad de los datos recogidos y los analizados, además de una infranotificación mar- cada de resultados lleva a dar una valoración global de baja calidad a los artículos incluidos en esta revisión. Limitaciones de esta revisión Se debe señalar, en primer lugar, la dificultad encontrada en el proceso de búsqueda bibliográfica para la localizar literatura publicada en relación a F1/F1CDx, dificultad posiblemente relacionada con la indexación de los ar- tículos, incluso en varios artículos no se refieren a esta plataforma genómica por su nombre. Esta misma limitación había sido señalada también por Cap- devilla y cols112, que reconocieron que las plataformas genómicas estaban en continua evolución pero sus resultados no se solían publicar ni indexar de manera formal. Las características mencionadas anteriormente de los artículos, que han llevado a valorar como baja la calidad de la evidencia, suponen una limi- tación para la generalización de los resultados y para establecer conclusio- nes sólidas. El hecho de que la casi totalidad de estudios sean series de casos retrospectivas, generalmente de pocos pacientes y con una gran heterogenei- dad entre estudios, tanto en lo que respecta a los pacientes como al tumor, hace que, a pesar de encontrar que F1/F1CDx es una prueba con efectividad diagnóstica y de utilidad clínica, sean necesarios más estudios para confir- mar estos resultados. Los pacientes estudiados tenían distintos niveles de afectación clínica consecuencia de su proceso tumoral, habían recibidos dis- tintos tratamientos y un número diferente de líneas terapéuticas. En cuanto al tumor, también se ha detectado una gran heterogeneidad, tanto en el tipo histológico como en el estadio tumoral, además de encontrar muy diferentes INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 110 GAs y genes afectados. Las terapias propuestas fueron también diferentes y tampoco ha sido comparable el seguimiento entre estudios. Además, los es- tudios incluidos tenían diferentes objetivos: algunos estudios se centraban únicamente en la descripción de las GAs encontradas y los genes afectados en los tumores, analizando características como el tipo de alteración, la fre- cuencia o el porcentaje de alteraciones intervenibles. Otros artículos se rea- lizaban en pacientes con alguna GA concreta y analizaban la concordancia de resultados entre F1 y otras pruebas convencionales como PCR, IHC o FISH. Algunos estudiaban la respuesta tumoral a determinados tratamien- tos dirigidos o a inmunoterapia y resultados como supervivencia o PFS, con variables de resultado de efectividad y seguridad que no han sido comunes a todos los artículos. Esta heterogeneidad entre estudios y especialmente la infranotificación de datos y resultados relativos a las principales variables relevantes de efectividad clínica, como la PFS, la supervivencia global, la respuesta tumoral, llevaron a descartar la posibilidad de realizar un análisis cuantitativo (meta-análisis) de los resultados. Otras variables escasamente informadas han sido el tiempo transcurrido desde la realización del estudio de perfil genómico hasta el inicio del tratamiento o las pruebas de imagen u otras utilizadas para valorar la respuesta tumoral. Por otro lado, se esperaba poder recoger datos sobre la seguridad de F1/F1CDx en el sentido de estudiar si el uso clínico de esta plataforma y la administración de los tratamientos recomendados a partir de sus resultados suponía algún riesgo para los pacientes. Sin embargo, muy pocos estudios64,123 han mostrado información relativa a los EAs, ni sobre el tipo de EA, ni el número de pacientes afectados ni el grado de severidad de los mismos. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 111 Conclusiones Conclusiones de la revisión de la literatura • El análisis de las GAs tumorales es una herramienta diagnóstica fundamental en la práctica clínica, con implicaciones pronósticas y predictivas de la respuesta al tratamiento oncológico. • F1CDx ha sustituido a F1 como tecnología de NGS que permite identificar las GAs en muestras tisulares. • Se ha demostrado la validez analítica de F1/F1CDx. • En la literatura revisada se reconoce la efectividad diagnóstica y uti- lidad clínica de F1/F1CDx aunque la calidad de la evidencia encon- trada es limitada. • Se reconocen las ventajas que presenta F1CDx como plataforma de análisis NGS. Especialmente cabe señalar su capacidad para identi- ficar con gran exactitud las GAs más relevantes en un elevado nú- mero de genes sobre muestras tisulares de tumores sólidos, en un único test y de forma rápida. Su utilización permite evitar la realiza- ción de otras pruebas que analizan la presencia una sola GA en un único gen. • F1/F1CDx ha demostrado influir en el tratamiento de los pacientes estudiados, permitiendo que sean tratados con un fármaco dirigido o inmunoterapia potencialmente efectivos, aunque todavía se desco- noce el porcentaje de pacientes que se beneficiará del análisis de F1CDx. • El tratamiento recomendado por F1CDx vendrá especificado en el informe final junto con el resto de la información aunque la decisión de seguir o no esta recomendación se tomará de forma conjunta en- tre médico y paciente. • Será necesario revisar la accesibilidad de los pacientes a estos fárma- cos, tanto a los aprobados por las autoridades pertinentes como a través de ensayos clínicos, con el fin de garantizar la equidad en el tratamiento. • En comparación con las técnicas convencionales no-NGS, F1/F1C- Dx muestra alta concordancia con las GAs que pueden detectar di- chas técnicas pero F1/F1CDx ha demostrado tener una capacidad diagnóstica superior identificando otras GAs que sin su utilización no se hubieran detectado. • No se dispone de suficiente información que compare F1/F1CDx con otras técnicas de NGS por lo que no es posible determinar si esta técnica presenta o no un valor añadido frente a alguna de las demás. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 112 • Existe muy poca información sobre la seguridad de F1/F1CDx, es- pecialmente sobre los posibles EAs relacionados con el tratamiento recomendado por el test o por retrasar su inicio. Tampoco se dispone de suficiente información sobre la potencial toxicidad evitada por el hecho de sustituir un fármaco no efectivo por otro indicado por F1/ F1CDx. • La utilización de F1/F1CDx en la práctica asistencial no supondría cambios organizativos. Si se requiere seguimiento riguroso de las pautas indicadas en las especificaciones técnicas para que la recogi- da y manejo de las muestras sea correcta y se eviten daños en el DNA antes del envío de las mismas a los laboratorios de referencia. • Como con otros tests genéticos, la utilización de F1CDx debería rea- lizarse en centros con suficiente experiencia clínica y/o de investiga- ción sobre el proceso tumoral en que será aplicada y se definirán unos criterios de inclusión y exclusión de pacientes en los que reali- zar el test. Para investigaciones futuras • Es importante insistir en la necesidad de realizar estudios con un número alto de pacientes y un diseño adecuado que permita estu- diar la capacidad diagnóstica de F1CDx, su valor pronóstico y pre- dictivo, su capacidad para influenciar y modificar la decisión tera- péutica, y para evaluar la respuesta tumoral y evolución del paciente, con un tiempo mínimo de seguimiento donde sea posible comprobar el beneficio clínico y si se ocasionan eventos adversos asociados a la terapia recomendada por esta tecnología. • Una recogida exhaustiva de cada uno de estos datos permitirá reali- zar un análisis completo de resultados con suficiente robustez y ba- sado en una evidencia de adecuada calidad con el fin de poder gene- ralizar los resultados encontrados y generar información que pueda contribuir a la toma de decisiones sobre la incorporación e imple- mentación de F1CDx a la práctica asistencial. • Son necesarios más estudios sobre F1CDx puesto que ha sustituido a F1 y el número de publicaciones hasta el momento es aún muy escaso. • Antes de decidir su incorporación a la práctica asistencial, sería de gran valor clínico cuantificar la información diagnóstica añadida por F1CDx en comparación a otras pruebas ya existentes en la práctica habitual, y determinar la importancia que puedan tener los posibles falsos positivos y negativos en la toma de decisiones. • Sería interesante realizar futuros estudios que comparen la efectivi- dad y utilidad clínica de F1CDx frente a otras plataformas de NGS VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 113 de modo que se pueda determinar si tienen un valor diagnóstico y pronóstico similar y la repercusión de cada una de ellas en resulta- dos en salud de los pacientes, y así poder establecer las mejores indi- caciones clínicas para cada una de estas NGS. • Sería conveniente establecer en qué situaciones clínicas la biopsia líquida presenta ventajas frente a F1CDx. • El futuro de la investigación incluirá el desarrollo de nuevas tecno- logías genómicas, ventajosas desde el punto de vista técnico, como son las NGS de tercera generación, al mismo tiempo que evolucio- nen los sistemas bioinformáticos y todo ello irá acompañado de un desarrollo de nuevos fármacos. • Algunos aspectos de interés que debieran analizarse son los referen- tes a cuestiones éticas, sobre el almacenamiento y manejo de toda la información generada o garantías para preservar la confidenciali- dad, de modo que toda la previsible evolución bioinformática y far- macológica tendrá que ajustarse al marco jurídico de la investiga- ción y de la protección de datos. • Facilitar la adecuada inclusión de pacientes en ensayos clínicos au- mentará el conocimiento sobre las GAs y los nuevos fármacos en investigación. • También son necesarios estudios de coste-efectividad y coste-utili- dad de F1CDx para intentar garantizar un correcto balance benefi- cios/costes. Valoraciones finales • A pesar del gran interés suscitado por la medicina de precisión y por la utilización de tests como F1CDx con los que determinar el perfil genético de los tumores, se reconoce la importancia de hacer un uso adecuado de los mismos, sobre todo por no trasladar al paciente fal- sas expectativas respecto a la posibilidad de tratar su tumor. El pro- fesional debería plantearse si los resultados de estos tests van a in- fluir en el manejo terapéutico de cada paciente en concreto. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 114 Bibliografía 1. Garraway LA. Genomics-driven oncology: framework for an emerging paradigm. Journal of Clinical Oncology. 2013;31(15):1806-1814. 2. Janssens JP, Schuster K, Voss A. Preventive, predictive, and personalized me- dicine for effective and affordable cancer care. EPMA J. 2018;9(2):113-123. 3. Gong J, Pan K, Fakih M, Pal S, Salgia R. Value-based genomics. Oncotar- get. 2018;9(21):15792-15815. 4. FDA. 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VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 129 Anexos ANEXO I. Lista de genes estudiados por F1CDx Genes con regiones exónicas codificantes incluidas en FoundationOne CDxTM para la detección de sustituciones, indels y alteraciones en el número de copias. Genes con regiones intrónicas para la detección de reordenamientos, un gen con una región promotora y un gen RNA no-codificante. Listado de genes que estudia F1CDx. Tomada de FoundationOne CDxTM Technical Information10. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 130 ANEXO II. Listado de otros tests CDx aprobados por la FDA para las GAs que detecta F1CDx FISH: hibridación fluorescente in situ, IHC: inmunohistoquímica, CISH: hibridación in situ cromogénica, ISH: hibridación sin situ, PCR: reacción en cadena de la polimerasa, NGS: secuenciación de nueva generación. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 131 ANEXO III. Estrategia de búsqueda en PubMed y Cochrane Library pubmed nº pregunta resultados #1 Search (“FoundationOne” OR “Foundation Medicine” OR “FoundationOne CDx” OR “next-generation sequencing” OR “high-throughput sequencing” OR “comprehensive genomic profiling” OR “hybrid-capture-based sequencing”) 41008 #2 Search (lung[Title/Abstract] OR breast[Title/Abstract] OR colon[Title/Abstract] OR colorectal[Title/Abstract] OR ovarian[Title/Abstract] OR ovaric[Title/Abstract] OR melanoma[Title/Abstract]) 1431294 #3 Search (cancer*[Title/Abstract] OR tumour*[Title/Abstract] OR tumor*[Title/Abstract] OR neoplasm*[Title/Abstract] OR carcinoma*[Title/Abstract] OR “non-small cell lung cancer”[Title/Abstract] OR “NSCLC”[Title/Abstract] OR adenocarcinoma[Title/ Abstract] OR squamous[Title/Abstract]) 3013215 #4 #1 AND #2 AND #3 3542 #5 #4 Filters: Publication date from 2012/01/01 to 2019/06/05; Humans 2206 cochrane Library nº pregunta resultados #1 (lung AND (canc* OR tumo* OR neoplasm*)):ti,ab,kw 24817 #2 (breast AND (canc* OR tumo* OR neoplasm*)):ti,ab,kw 34635 #3 (colon AND (canc* OR tumo* OR neoplasm*)):ti,ab,kw 5963 #4 (colorectal AND (canc* OR tumo* OR neoplasm*)):ti,ab,kw 14749 #5 (melanoma AND (canc* OR tumo* OR neoplasm*)):ti,ab,kw 4158 #6 ((ovarian OR ovaric) AND (canc* OR tumo* OR neoplasm*)):ti,ab,kw 7118 #7 #1 OR #2 OR #3 OR #4 OR #5 OR #6 81461 #8 (Foundation one):ti,ab,kw 1711 #9 (FoundationOne):ti,ab,kw 31 #10 (Next Generation sequencing):ti,ab,kw 0 #11 (Comprehensive genomic test profiling platform):ti,ab,kw 2 #12 #4 OR #5 OR #6 #7 1714 #13 (#7 AND #12) with Publication Year from 2010 to 2019, with Cochrane Library publication date from Jan 2010 to Mar 2019, in Trials 107 INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 132 ANEXO IV. Diagrama de flujo de selección de estudios Figura 5. Proceso de selección de estudios. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 133 ANEXO V. Estudios excluidos y motivo de exclusión Tabla 3. artículos excluidos y motivo de exclusión. primer autor, año tumor motivos de exclusión Gautschi y cols177, 2017. Vaishnavi y cols178, 2013. NSCLC No utilizan F1 sino otra NGS. Sacher y cols165, 2016. NSCLC No queda claro que se trate de F1 pero en todo caso no mencionan ningún resultado. Capelletti y cols179, 2014. NSCLC No es un estudio clínico sino de investigación en laboratorio. Lindeman y cols47, 2018. NSCLC No es un estudio clínico sino una guía clínica. Wheler y cols79, 2015. Mama Incluyeron los mismos tres pacientes que en estudio del 2014. Wheler y cols81, 2014. Mama Sólo utilizaron F1 en 3 pacientes. Hutchinson y cols180,2013. Melanoma No es un estudio clínico sino de investigación en laboratorio. Gunderson y cols181, 2016. Ovario Incluye diversos tumores ginecológicos, no sólo ovario y no da resultados por separado de ovario. Balasubramaniam y cols99, 2017. Ovario No estudia efectividad de F1, incluye FoundationFocus CDx BRCA test. Lim y cols182, 2017. Ovario No es un estudio clínico sino una revisión narrativa. Fernandes y cols34, Goodman y cols147, Grenader y cols183, Hirshfield y cols150, Hohnson y cols159, Kuderer y cols184, Park y cols160, Sohal y cols145, Weiss y cols158, Chae y cols174, Wheler y cols157, Zhong y cols27 Varios tumores Se aportan resultados para el total de tumores, no resulta posible discriminar los resultados por separado para cada tipo de tumor. NSCLC: cáncer de pulmón no microcítico, NGS: secuenciación de nueva generación, F1: FoundationOne. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 134 ANEXO VI. Tablas de extracción de datos de los artículos incluidos Tabla 4. estudios de f1 en pacientes con tumores de pulmón. autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características de la población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Hellmann y cols64, 2018, EEUU. Estudiar la supervivencia libre de progresión (PFS) de nivolumab + ipilimumab frente a QT en pacientes con una TMB ≥10 mut/Mb, independientemente del nivel de expresión del PD-L1. Ensayo open-label en fase 3 (Checkmate 227). Se aleatorizaron pacientes con PD-L1 ≥1% y <1% a los tres grupos de tratamiento. N=1.739 N=1.189 con ≥1% de expresión del PD-L1. N=550 con <1% de expresión del PD-L1. Adultos con ECOG=0-1 que no hubieran recibido tratamiento sistémico previo por NSCLC avanzado o metastásico. Se excluyeron pacientes con mutaciones EGFR o ALK translocaciones. Se pudo estudiar la TMB en 1.044 pacientes (57,7%). De estos, 444 (44,2%) tenían alta carga mutacional (TMB ≥10 mut/Mb). De ellos, 139 recibieron nivolumab+ipilimumab y 160 recibieron QT. F1 CDx para determinar la TMB. No hay comparador. NSCLC escamosos o no escamosos, en estadio IV o recurrente. No Nivolumab (3 mg/Kg cada 2 semanas) + Ipilimumab (1mg/Kg cada 6 semanas) como primera línea. vs QT según tipo histológico. vs nivolumab cada 2 semanas (si ≥1% de expresión del PD-L1) o nivolumab cada 3 semanas + QT según tipo histológico (si <1% de expresión del PD-L1). - Seguimiento mínimo de 11,2 meses. - Tiempo mediano de duración de tratamiento con nivolumab+ipilimumab fue de 4,2 meses (rango de 0,03-24,0) y con QT, de 2,6 meses (rango, 0,03-22,1). - Tasa de PFS al año en el total de pacientes, independientemente de la TMB y del nivel de expresión del PD-L1, fue de 30,9% en el grupo de nivolumab + ipilimumab vs 17,0% en el grupo de QT, HR de progresión o muerte=0,83 (IC 95%: 0,72-0,96). PFS mediana de 4,9 meses (IC 95%: 4,1-5,6) vs 5,5 meses (IC 95%: 4,6-5,6). - Tasa de PFS al año en pacientes con TMB ≥10 mut/Mb (alta carga tumoral mutacional) fue de significativamente superior en el grupo de nivolumab + ipilimumab: 42,6% vs 13,2% en el grupo de QT. PFS mediana de 7,2 meses (IC 95%: 5,5-13,2) vs 5,5 meses (IC 95%: 4,4-5,8). HR de progresión o muerte=0,58 (IC 97,5%: 0,41-0,81; P<0,001). Y de este grupo, ajustando en función de si PD-L1 era ≥1% o <1%, el HR=0,57; IC 97,5%: 0,40-0,80; P<0,001. Y si además, PD-L1 ≥1%, la PFS era mayor que en los PD-L1<1%, y mayor entre los pacientes con tumor escamoso que no escamoso. - En pacientes con TMB<10 mut/Mb, la PFS mediana de 3,2 meses (IC 95%: 2,7-4,3) vs 5,5 meses (IC 95%: 4,3-5,6), sin diferencias entre ambos grupos (HR=1,07; IC 95%: 0,84-1,35). - Tasa de respuesta objetiva: 45,3% en grupo nivolumab+ipilimumab frente a 26,9% en grupo QT. Progresión de la enfermedad en los pacientes con TMB ≥10 mut/Mb en el 37,8% y 47,2%, respectivamente. - Duración de la respuesta: 43% libres de progresión al año en el grupo de nivolumab+ipilimumab frente al 13% del grupo de QT. El porcentaje de pacientes con respuesta después del año fue del 68% en grupo nivolumab+ipilimumab frente a 25% en grupo QT. - No se encontraron diferencias en la PFS entre los pacientes tratados con nivolumab (N=71) vs QT (N=79) con TMB ≥13 mut/Mb y PD-L1 ≥1%. - Seguridad, de acuerdo al NCI CTCAE v.4.0: porcentaje global de EA similar en grupos nivolumab+ipilimumab y QT. El porcentaje de EA grados 3 o 4 fue de 31,2% en grupo nivolumab+ipilimumab y 36,1% en grupo QT. Entre los pacientes con TMB ≥10 mut/Mb, los del primer grupo sufrieron un 25,9% de EA y los de QT un 8,8%. - Entre los pacientes con TMB ≥10 mut/Mb, el 24,4% de los tratados con nivolumab+ipilimumab y el 3,1% de los tratados con QT seguía en tratamiento al cierre del estudio. - No existe relación entre la TMB y el nivel de expresión de PD-L1. - De los asignados al grupo de QT, un 30% recibió posteriormente inmunoterapia. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 135 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características de la población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Lim y cols116, 2017, Corea. Estudiar la actividad antitumoral y el perfil de seguridad del ceritinib en pacientes con NSCLC y reordenamientos ROS1. Ensayo abierto de fase II, multicéntrico. Mayores de 20 años, ECOG:0-2. Hacen F1 en muestras de 15 pacientes. Todos eran FISH positivos a reordenamientos ROS1. - FISH: los 15 positivos a reordenamientos ROS1. - IHC: 9 positivos y 2 negativos. - F1. NSCLC localmente avanzado o metastásico. Todos son adenocarcinomas. No se menciona. Ceritinib. - De los 15 pacientes a quienes hicieron F1, 11 dieron un resultado positivo: los reordenamientos encontrados fueron: CD74-ROS1 (n=2), SLC34A2-ROS1 (n=2) y EZR-ROS1 (n=7). - 4 tuvieron un resultado negativo con F1. De estos 4, uno había sido también negativo con IHQ y clínicamente progresó tras tratamiento con ceritinib por lo que se considera que fue un falso positivo de FISH. Dos negativos con F1 presentaron respuesta parcial al ceritinib, lo que sugiere que son falsos negativos de F1 (los autores lo relacionaron con disponer de una cantidad limitada de tejido muestral). - Respuesta tumoral al ceritinib valorados por RECIST v.1.1: RC en 1 paciente, RP en 10, progresión en 1 paciente, estabilización tumoral en 2 y no disponible esta información en 1 paciente. - PFS en los pacientes con RP osciló entre 4,4 meses a más de 31,8 meses. Vigneswaran y cols120, 2016, EEUU. Revisar los resultados del perfil genómico exhaustivo realizado a pacientes con NSCLC. Evaluar el porcentaje de pacientes con GAs potencialmente dianas terapéuticas. Evaluar el porcentaje de pacientes con alteraciones concurrentes previamente consideradas excluyentes. Caracterizar el grupo de pacientes con mutaciones KRAS. Retrospectivo de una serie de casos, de un centro universitario, recogidos en 5 años (dic-2009 a ago-2014). N=160 pacientes analizados con F1. Edad media de 62,1 años. Hombres: n=79 (49%) Mujeres: n=81 (51%). No fumadores: 22%. - F1 (en 160 pacientes). - Caris Molecular Intelligence. - Response Genetics Inc. - No comparador. NSCLC avanzado. De los 160 estudiados con F1: Adenocarcinomas: n=120 (75%). Carcinoma de células escamosas (SCC): n=15 (9%). NSCLC-no especificado de otra manera (NOS): n=7 (4%). Carcinoma de células grandes: n=4 (3%). No se menciona. No se administra. - El 99,4% de los pacientes analizados con las NGS presentaron al menos una GA, con una media de 10,8 alteraciones/tumor. - El estudio se centró en los pacientes con adenocarcinoma (n=120). La mayoría de las GAs implicaban a los genes de receptores de quinasa/ factores de crecimiento (RTK/GFs). - Se identificaron GAs en la vía MAPK/RAS en un 56,7% (68/120) y en la vía PI3K/mTOR en un 30% (36/120), GAs en genes asociados al ciclo celular en 25% (30/120), mutaciones KRAS en 32,5% de las que un 10% se dieron en no fumadores. - 46% de alteraciones en EGFR y 61% de las alteraciones en ALK se dieron en no fumadores. - Las GAs identificadas mediante las NGS se dieron en los genes: EGFR (23,3%), KRAS (32,5%), ALK (7,5%), ROS1 (0,8%), RAF1 (1,7%), RET (10,8%), ERBB2 (4,2%), PIK3CA (10,0%), MET (5,0%), BRAF (12,5%) y en el gen potencialmente intervenible CBL (6,7%). - En 36,25% de las muestras (58/160) se encontraron múltiples GAs. Se trata de un porcentaje de casos superior al esperado. Ali y cols18, 2016, California, EEUU. Estudiar el papel de F1 para realizar un CGP que permita identificar reordenamientos ALK en pacientes con NSCLC y comparar su capacidad diagnóstica frente a FISH. Serie de casos. N=1.070 pacientes. Y una segunda serie de 45 pacientes de otro centro. 47 pacientes con reordenamiento ALK. - FISH. - F1. Profundidad de cobertura media >650x para al menos 3.769 exones de 236 genes relacionados con cáncer y 47 intrones de 19 genes que presentan reordenamientos en casos de cáncer. NSCLC avanzado. No se menciona. Crizotinib en 9 pacientes en los que FISH había sido negativo. En total, de los 47 pacientes, se tratan con crizotinib 28, no se poen tratamiento en 4 y en los 15 restantes, se desconoce este dato. - Con F1, 47 (4,4%) pacientes presentaron reordenamientos ALK: 41 fusiones EML4-ALK. - Con FISH, de los 47 pacientes, se tienen datos de 31: 11 (35%) eran FISH negativos a reordenamientos ALK. - 9 pacientes de los 11 con FISH negativo recibieron crizotinib porque con F1 había dado resultado positivo a fusión ALK. 7 respondieron (RP: n=6, RC: n=1). Duración de la respuesta: 5-28 meses (mediana >17 meses). Dos no respondieron. - 2 pacientes no fueron tratados con crizotinib: uno no ha progresado, el otro se perdió su seguimiento. - 22 casos con reordenamientos ALK detectados por FISH también fueron detectados por F1. Todos fueron fusiones EML4-ALK. - De los 23 casos negativos con FISH, 22 también lo fueron con F1 y 1 caso fue un reordenamiento SOCS5-ALK. - Los autores recomendaron realizar estudio de F1 en todos los NSCLC avanzados para detección de reordenamientos ALK dado que FISH no resulta suficiente para identificar todos los casos impidiendo que estos pacientes que no son identificados por FISH reciban el tratamiento adecuado. A la vista de la respuesta a la terapia dirigida con crizotinib, insistieron en administrar este fármaco, no sólo a los pacientes con fusiones EML4-ALK sino también a aquellos con translocaciones no-EML4-ALK, como primera línea o tras QT. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 136 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características de la población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados DiBardino y cols114, 2016, EEUU. Identificar dianas terapéuticas en las muestras tumorales. Restrospectivo de una serie de casos. Unicéntrico. Muestras recogidas entre 2012-2014. N=49 pacientes. Mujeres: n=30 (61%). Hombres: n=19 (39%). Edad mediana: 62,9 (rango, 42-93). Fumadores: n=35 (71,4%). - FISH, PCR. - F1: en al menos 50 ng de DNA; se analizaron por captura de hibridación 3.320 exones de 236 genes relacionados con el cáncer y 47 intrones de 19 genes que con frecuencia presentan reordenamientos. NSCLC. Adenocarcinoma: n=45 (92%) Escamosos: n=2 (4%) Sarcomatoide: n=1 (2%) Otros: n=1 (2%) Metástasis en 30 pacientes (61,2%). No se menciona. No se menciona. - El test se pudo realizar bien en 41 casos; en 5 la muestra fue insuficiente y en 3 el test falló. - En total, 40 tumores pudieron ser analizados. Se detectaron 179 GAs, con una media de 4,37 por tumor y 63 eran CRGAs. De los 40 tumores, 30 tenían alguna CRGA y en estos 30 casos, todos tenían al menos 1 fármaco disponible aprobado por la FDA. De los otros 10 tumores, había 13 fármacos en fase I o I/II de ensayo clínico. - Las GAs más frecuente fueron mutación en TP53, pérdida CDKN2A, amplificación MCL1 y amplificación RICTOR, en este orden. - Las CRGAs más frecuentes fueron mutaciones en EGFR, PIK3CA, KRAS y ERBB2. - En 25 muestras se detectaron alteraciones en ALK con FISH en 20 tumores y en los 25 mutaciones EGFR en exones 18-21 con PCR, mutación V600E en BRAF con PCR en 16 tumores y mutaciones KRAS con PCR en 22 tumores. - Comparando estos resultados con F1 sólo hubo 1 discrepancia: se detectó fusión EML4-ALK en un caso que no se detectó por FISH. - 7 de 49 pacientes (14,3%) los resultados de F1 contribuyeron a modificar el tratamiento: en 2 pacientes se suspendió el tratamiento que tenían y en 5 se instauró una nueva terapia. Lim y cols115, 2016, Corea. Realizan CGP a muestras de cáncer de pulmón previamente negativas a EGFR, KRAS y ALK, con el fin de identificar a los pacientes candidatos a terapia dirigida. Estudio unicéntrico de una serie de casos. Entre 2013 y 2015. N=51 pacientes. Mujeres: n=33. Hombres: n=18. Edad mediana: 58 años (rango, 29-77). No fumadores:n=39 (76%) - Todos eran triples negativos con secuenciación convencional y/o FISH a EGFR/KRAS/ALK. - F1: secuenciación a cobertura mediana de 564x, en muestras con ≥20% núcleos tumorales y ≥50 ng de DNA. Secuenciador: Illumina HiSeq2500. NSCLC. Adenocarcinomas: 100%. Estadio IV: n=25 (49%). No se menciona. - 7 pacientes con reordenamiento ROS 1 fueron tratados con ceritinib. - Total de 190 GAs conocidas y 601 desconocidas. - Media de 3,7 GAs por paciente (rango, 0-10). - Sustituciones de bases no-sinónimas (50%, 80 de 190), indels (15%, 29 de 190), mutaciones (3%, 5 de 190), amplificaciones (20%, 39/190), genes de fusión (7%, 14/190) - Entre las primeras, las GAs más frecuentes fueron: TP53 (30%, n=24/80), KRAS (10%, n=8/80) y EGFR (10%, n=24/80). - En 8 pacientes negativos según las pruebas convencionales, F1 permitió detectar mutaciones EGFR y en otros 8, KRAS. - 17 pacientes (33%) presentaron GAs en la vía PI3K-AKT-mTOR. - En 16 pacientes (31%) se identificaron GA para los que hay terapia dirigida aprobada. Siete pacientes con reordenamiento ROS 1 recibieron ceritinib y 6 presentaron respuesta objetiva. En 14 pacientes (27%) se encontraron otras GAs con fármacos utilizados en ensayos clínicos. - Valoración de la respuesta tumoral al tratamiento mediante RECIST v1.1. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 137 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características de la población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Rozenblum y cols118, 2016, Israel. Estudiar el impacto de los resultados de las NGS en las decisiones terapéuticas y resultados clínicos de pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Estudio retrospectivo de una serie de pacientes consecutivos incluidos entre nov-2011 y oct-2015. Unicéntrico. N=101 Mujeres: n=54 (53,5%) Hombres: n=47 (46,5%) Edad mediana 63 (rango, 20-84). No fumadores: n=45 (44,6%) - RT-PCR para mutaciones EGFR, n=86 (85,2%). - IHC y/o FISH para reordnamientos ALK, n=72 (71,3%). - F1 en 82 (81,2%). - Guardant360 (ctDNA) si no había suficiente muestra de tejido tumoral, n= 19 (18,8%). NSCLC avanzado (94%). Adenocarcinoma: n=86 (85,1%). No se menciona. 12 pacientes con mutación EGFR fueron tratados con EGFR TKIs; otros 13 con crizotinib (7 por alteraciones ALK, 4 en MET y dos en ROS1). 5 pacientes con reordenamientos RET fueron tratados con cabozantinib y 1 con alectinib. 1 paciente con mutación V600E fue tratado con vemurafenib. - 81 de 101 pacientes (80,2%) eran negativos a mutaciones EGFR y 71 de 101 (70,3%) negativos a reordenamientos ALK. - NGS antes de iniciar tratamiento en 52 pacientes (51,5%). - NGS después de fracaso del tratamiento en 49 pacientes (48,5%). - Tiempo mediano hasta obtener resultados de NGS fue de 13 días (rango, 8-460). - Tiempo mediano hasta empezar el tratamiento de 8 días desde que se reciben los resultados. - Al menos una GA intervenible con fármaco aprobado por la FDA en 73 pacientes (89,0%) de los 82 análisis con F1 y en 11 (57,9%) de los 19 análisis con Guardant360. En 23 pacientes (22,8%) se detectaron 2 GAs intervenibles y en 6 (5,9%) ≥3 GAs intervenibles. - NGS identificó GAs dianas en 50% de los pacientes: EGFR (18%), RET (9%), ALK (8%), MET (6%) y ERBB2 (5%). - En 15 pacientes (14,9%) con tests convencionales negativos a alteraciones EGFR/ALK, las NGS sí detectaron alteraciones. 12 fueron tratados y 8 (67%) alcanzó RC o RP. - En 4 pacientes con tests positivos a EGFR/ALK, las NGS detectaron alteraciones en otros genes diferentes. - La estrategia terapéutica fue modificada en 43 pacientes (42,6%). F1 modificó el tratamiento en 37 de 82 pacientes (45,1%) y G360 en 6 de 19 (31,6%). - La respuesta tumoral se mide con RECIST v.1.1. La tasa de respuesta global en estos pacientes fue del 65%: en 5 pacientes (14,7%) se alcanzó RC, en 17 (50%) RP, en 9 (26,5%) estabilización y en 3 (8,8%) progresión. - Se administró inmunoterapia a 33 pacientes (nivolumab a 20 y pembrolizumab a 13), la mayoría de ellos no presentaban drivers intervenibles (13 presentaban mutación KRAS), alcanzando una tasa de control de la enfermedad en 32%. Se encontró relación no significativa entre TMB y respuesta a la inmunoterapia frente a los pacientes con enfermedad estable o progresión. Suh y cols119, 2016, China. Estudiar la viabilidad y utilidad de perfil genómico completo en la práctica clínica. Serie de casos consecutivos entre sept-2012 y mayo-2015. N=6.832 pacientes. Edad mediana de 64 años (rango, 13-88). Mujeres: 53% - F1: Secuenciación a una profundidad media de cobertura de 576x en Illumina HiSeq2000 o HiSeq2500. - No otros comparadores. NSCLC avanzado. Tipo histológico: Adenocarcinoma: n=5.380 (79%). Otros carcinomas no microcíticos (NSCLC-NOS: n=1.345 (20%) Carcinoma adenoescamoso (ADSQ): 72 (1%) Carcinoma de células grandes (LCC): 35 (0,5%). No se menciona. No se especifica ni valora respuesta al tratamiento. - Se observó una diferencia estadísticamente significativa (p<0,0001) entre los casos de adenocarcinomas (75%) y ADSQ (68%) con al menos una GA frente a los pacientes con NSCLC-NOS (57%) y LCC (37%). - En 5,4% de casos presentaron GAs que afectaban a más de un gen. - En 4.876 muestras (71%) se identificaron GA en los genes EGFR (1.324; 20%), ALK (280; 4,1%), BRAF (388; 5,7%), ERBB2 (408; 6,0%), MET (383; 5,6%), ROS1 (100; 1,5%), RET (166; 2,4%) o KRAS (2.178; 32%). En el 29% restante no se detectó ninguna GA. - De acuerdo a las guías CAP/IASLC/AMP y NCCN, el 15% de los casos fueron positivos para mutaciones puntuales e indels con conocida sensibilidad en EGFR, 3,9% para reordenamientos en ALK, 2,1% positivas para la mutación V600E en BRAF, 3,5% positivas para mutaciones e indels en ERBB2, 3,1% positivos para amplificaciones en MET, 2,8% positivas para mutaciones en MET, 1,3% para reordenamientos en ROS1 y 1,9% para reordenamientos en RET. - CGP identificó otras GAs potencialmente intervenibles que incluían 5,9% de casos con amplificaciones en EGFR, 3% con mutaciones en BRAF no V600E, 0,2% con reordenamiento en BRAF, 3% con amplificación en ERBB2, 3,2% con mutaciones resistentes EGFR T790M y 0,1% en mutaciones resistentes ALK. - En 1.339 casos de adenocarcinomas no se encontraron GAs en esos 5 genes sino que se detectaron otras GA que implicaban a oncogenes conocidos: NF1 (13%), PIK3CA (5,4%), NRAS (2,3%), MAP2K1 (1,2%) y HRAS (0,7%). Un total de 273 genes con GA (0,1% casos) muchas de las cuales se asocian a potenciales beneficios con una terapia dirigida o que permiten su inclusión en ensayos clínicos: STK11 (21%), MYC (9,8%), RICTOR (6,4%), CDK4 (4,3%), CCND1 (4,0%), BRCA2 (2,5%), BRCA1 (1,7%), NTRK1 (0,7%) y NTRK3 (0,2%). INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 138 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características de la población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Drilon y cols121, 2015, EEUU. Definir el potencial beneficio incremental de F1 al detectar GAs no diagnosticadas previamente en 11 genes (mutaciones EGFR, ERBB2, KRAS, NRAS, BRAF, MAP2K1, PIK3CA y AKT1, fusiones en ALK, ROS1, y RET) y susceptibles de terapia dirigida en pacientes no fumadores o fumadores ocasionales. Serie de casos. Pacientes estudiados en un solo centro, entre 2006 y 2013. N=31. Mujeres: n=18 (58%) Hombres: n=13 (42%) Edad mediana: 60 (rango, 29-78). No fumadores: n=22 (71%). ≤15 paquetes de cigarrillos al año: n=9 (29%). ECOG: 0-1. Otros tests moleculares negativos. Suficiente muestra para realizar NGS. - F1 - Espectrometría de masas (Sequenom) para estudiar 91 mutaciones puntuales. - FISH para estudiar reordenamientos en ALK, ROS1 y RET. Adenocarcinoma de pulmón. Estadio IIIB/IV o precoz pero sospecha radiológica de recurrencia no candidata a tratamiento local. No se especifica. Erlotinib al paciente con EGFR G719A. Crizotinib a los pacientes con las GAs SOCS5-ALK, HIP1-ALK y CD74-ROS1. Cabozantinib a los pacientes con KIF5B-RET (n=2) y CCDC6-RET. - En 29 (94%) pacientes se encontró, al menos, 1 GA. En total, 96 GAs con una mediana de 3 GAs (rango, 0-7) por muestra. - Las GAs más frecuentes fueron TP53 (14%, n=13 de 96), EGFR (7%, n=7), MDM2 (5%, n=5), KRAS (4%, n=4), CDK4 (4%, n=4) y SETD2 (4%, n=4). - En 8 pacientes (26 %) se encontró GA con tratamiento dirigido aprobado. En estos 8 pacientes las alteraciones detectadas fueron: EGFR G719A, BRAF V600E, SOCS5-ALK, HIP1-ALK, CD74-ROS1, KIF5B-RET (n=2) y CCDC6-RET. De ellos, 6 recibieron tratamiento: 2 tuvieron RP; otros 2, EE (reducción tumoral <30%); otros 2 pendientes de evolución. Los otros 2 fallecieron antes de iniciar el tratamiento. - En 12 pacientes (39%) se encontraron GAs con tratamiento “off-label” o en investigación en ensayo clínico. - Por tanto, con F1 fue posible determinar la presencia de GAs intervenibles no detectadas con las pruebas convencionales en un 65% de los tumores de pacientes no fumadores o fumadores ocasionales. Pekar-Zlotin y cols117, 2015, Israel. Estudiar la capacidad diagnóstica de FISH e IHC, y NGS en los casos discordantes para detectar reordenamientos EML4-ALK. Consideran F1 como el gold standard. Retrospectivo, transversal. Entre 2011 y 2013. 57 pacientes consecutivos. Sólo muestra suficiente en 51. - FISH. - IHC. - F1. Secuenciador Illumina HiSeq2000, lecturas pareadas con 49 pb, a una profundidad media de cobertura de 843x. Cortes de muestras FFPE de 10 µm. NSCLC. Todos eran adenocarcinomas. No se menciona. De los 6 casos discordantes, sólo 2 pacientes recibieron crizotinib. - De 51 pacientes, FISH-IHC fueron discordantes en 6, que se estudiaron con F1: -- 5 IHC positivo y FISH negativo: en 4 de ellos, F1 fue positivo para ALK. --1 paciente con FISH positivo e IHC negativo, fue negativo con F1. - Por tanto, incidencia de reordenamiento EML4-ALK del 13,7% y no del 7,8% como se hubiera considerado sin utilizar F1. - De los casos discordantes, dos pacientes tratados con crizotinib. Uno presentó RC, con PFS de 18 meses. El otro, enfermedad estable, con PFS de 6 meses. CGP: perfil genómico completo, CRGA: Clinical relevant genomic alteration, ctDNA: DNA tumoral libre circulante, EA: eventos adversos, ECOG: Eastern Cooperative Oncology Group, F1: FoundationOne, FDA: Food and Drug Administration, FISH: hibridación in situ fluorescente, GA: alteración genómica, IHC: inmunohistoquímica, QT: quimioterapia, NSCLC: cáncer de pulmón no microcítico, NGS: secuenciación de nueva generación, RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, PD-L1: ligando de muerte programada 1, PFS: supervivencia libre de progresión, RC: respuesta completa, RP: respuesta parcial, TMB: carga mutacional tumoral. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 139 Tabla 5. estudios de f1 en pacientes con cáncer de mama. autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Chae y cols124, 2017, EEUU. Estudiar la concordancia de alteraciones genéticas detectadas por NGS en tejido tumoral y ctDNA. Retrospectivo. N= 45 pacientes. Mujeres: n=44 (97,8%) Hombres: n=1 (2,2%) Edad mediana: 55 años. Cáncer ductal: n=34 (75,6%). Cáncer inflamatorio de mama: n=34 (75,6%). - F1: muestra de tejido tumoral. - G360: ctDNA. F1 se considera el gold standard en este estudio. Intervalo mediano entre la toma de las muestras de biopsia y sangre de 146 días. Cáncer de mama. Estadio IV: n=31 (68,9%). No se menciona. No se indica. - Estudiaron concordancia entre 45 y 67 genes comunes a ambas plataformas para cada paciente individual. - Concordancia de negativos: 91,0% incluyendo todos los genes estudiados, aunque cuando se estudian los genes con alteraciones en DNA detectadas con ambos tests, la concordancia de positivos total y parcial cae a 10,8%-15,1% y 13,8%-19,3%, respectivamente. - Concordancia excluyendo los genes no estudiados por G360: 94,2%. - 32,5% de alteraciones fueron sólo detectadas mediante ctDNA y 53,3% sólo en el estudio del tejido y no en ctDNA. - Número medio de alteraciones por paciente fue significativamente superior en el NGS tisular vs ctDNA: 4,56 (SD= 2,98) vs 2,16 (SD=2,31), P<0,0001; IC 95%: 1,28-3,52). - Se detectaron más mutaciones en el tejido: 38 de 45 pacientes (84,4%). - En concreto, para los genes TP53, PIK3CA, ERBB2, BRCA1 y BRCA2, excluyendo las VUS, los valores globales de sensibilidad, especificidad valores predictivos positivo y negativo y exactitud diagnóstica fueron 35,7%, 95,0%, 71,4%, 80,9%, 79,6%, respectivamente, e índice J de Youden de 0,3. Incluyendo las VUS, los valores de estos mismos parámetros fueron similares. - En 2 pacientes se estudió la utilidad clínica del análisis ctDNA: en una paciente, se comprobó el cambio genético en respuesta al tratamiento; en la otra se comprobó una respuesta molecular compatible con la respuesta parcial observada mediante técnicas de imagen. Nozad y cols126, 2017, EEUU. Estudiar el perfil genómico de tumor filodes maligno para identificar GAs que orienten sobre posibles terapias dirigidas para este tipo de tumores. Serie consecutiva de casos. N=24 Mujeres: 100% Edad mediana: 54 años (rango, 14-70). F1 o F1 Heme. Las muestras procedían de mama en 15 pacientes y de metástasis en 9 pacientes. Tumor filodes maligno de mama. No se menciona. No se menciona. - Se identificaron 136 GAs en 43 genes. - El número medio de GAs por muestra fue de 5,7 (rango 0-9) con al menos 1 GA identificada en 95,8% casos (23/24). - La carga tumoral mutacional (TMB) mediana fue de 2,7 mut/Mb. (rango de 0,8-7,5). Ningún caso presentó una TMB >10 mut/Mb. No diferencias entre TMB del tumor primario y metástasis. - 20/24 pacientes fueron evaluados para estatus microsatélites. Todos ellos mostraron patrón microsatélite estable. - Las alteraciones más frecuentes se encontraron en TP53 (58,3%), TERT-promoter (57,9%), NF1 (45,8%), MED12 (45,8%), CDKN2A/B (33,3%) y MLL2 (33,3%). - Se detectaron CNA en 62,5% (15/24); la más frecuente fue una deleción homocigótica en CDKN2A/B. - Alteraciones en las vías de señalización del receptor de tirosina quinasa y RAS/RAF en 79,1% (19/24). INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 140 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Parsons y cols130, 2017, EEUU. Estudiar la viabilidad de obtener el perfil molecular tumoral en menos de 28 días con el fin de recomendar un tratamiento. También se investigó el uso de ctDNA para estudiar el perfil molecular tumoral bajo la hipótesis de que las muestras sanguíneas son una fuente de fácil acceso al DNA tumoral. Estudio prospectivo en varias clínicas de la misma institución, entre sept-2013 y abril-2015. N= 26 mujeres. Edad mediana de 55 (rango, 25-78). ECOG: 0-2. - F1. De nueva biopsia de las metástasis sólidas. - IHC para receptores E, P y aromatasa, y HER2. - ctDNA de muestras de sangre. Cáncer de mama triple negativo metastásico. Todas habían recibido, al menos, 1 línea de QT previa. Número mediano de líneas de QT previas fue 1 (rango, 0-4). Número mediano de líneas de hormonoterapia previas fue 1,5 (rango, 1-2). Antraciclinas y taxanos en 16 pacientes; antraciclinas en 2; taxanos en 2 y otros en 2. Bicalutamida (paciente con AR+). Carboplatino/inhibidor PARP (paciente con mutación BAP1). Trametanib (paciente con amplificación MAP2K1). Trastuzumab (paciente con mutación ERBB2). - Se estudia la concordancia entre las GAs (sólo las mutaciones en los 27 genes estudiados en sangre) detectadas mediante NGS en muestras sólidas y de sangre. En 18 pacientes se pudo hace análisis de tejido y ctDNA y 23 de 33 mutaciones (70%) fueron concordantes. En 5 pacientes se encontró discordancia de resultados. En 2 pacientes, ninguno de los tests detectó mutaciones. - 20 (77%) pacientes se pudo realizar correctamente el estudio NGS en muestras tisulares. De estos 20 pacientes, todos presentaban 1 GA al menos. Y en 24 se obtuvo suficiente muestra para ctDNA. - Tiempo desde obtención de muestra hasta envío a FM: 4 días (2-7) - Tiempo hasta tener informe de FM: 15,5 días (12-30). - Tiempo hasta que el comité emite su recomendación: 5 días (3-10). - Recomendación terapéutica en menos de 28 días en 12 pacientes (60%). - Mutaciones potencialmente intervenibles: 15. - Las GAs más frecuentes se dieron en los siguientes genes: TP53 (n=19; 35%), MYC (n=6; 11%), CCNE1 (n=5; 9%), MCL1 (n=5; 9%), NOTCH1 (n=4; 7%), FGFR1 (n=3; 6%), MYST3 (n=3; 6%), PIK3CA (n=3; 6%), PTEN (n=3; 6%) y RB1 (n=3; 6%). - Terapia dirigida recomendada por el comité de tumores: 13. - 4 pacientes recibieron tratamiento. - La paciente con AR+ tratada con bicalutamida experimentó progresión de la enfermedad a las 2 semanas y se retiró el fármaco. - La paciente tratada con carboplatino/inhibidor PARP presentó enfermedad estable tras dos ciclos y progresión tras 4 ciclos. - La paciente tratada con trametanib progresó tras varias semanas de tratamiento. - La paciente tratada con trastuzumab progresó después de 10 meses de tratamiento. Luego recibió capecitabina y mantuvo enfermedad estable durante 9 meses. Yuan y cols123, 2017, EEUU. Se presentan los resultados y el impacto clínico del uso de NGS en pacientes con cancer de mama metastásico, estudiadas entre enero de 2014 y mayo de 2016. Serie de casos. Estudio retrospectivo. N=44 Mujeres: 100%. Edad mediana en el momento de realizar la NGS: 54,5 (rango: 34-78 años). - F1: muestras tumorales de biopsias tomadas en diferentes órganos (14 mama, 9 nódulo linfático, 6 piel, 4 hígado, 3 pulmón, 2 hueso, 2 cerebro, 1 pared torácica, 1 tejido blando, 1 glándula adrenal y 1 otro), con la plataforma Illumina HiSeq2000. -No otro comparador. Cáncer de mama con metástasis. Triple negativo (n=24), ER+ (n=16) y HER2+ (n=4). Varios tratamientos: mediana de 3 (rango, 0-13). Más de 3 líneas de tratamiento en 23 pacientes. - Everolimus a 5 pacientes por mutaciones en PIK3CA o TSC1. - Pazopanib a 2 pacientes por amplificación FGFR. - Mutaciones intervenibles en 42 pacientes (95%). - Las GAs más frecuentes fueron mutaciones TP53 (68%), mutación o amplificación PIK3CA (41%), amplificación MYC (27%), pérdida PTEN (23%), otras en <20% de pacientes. - Recibieron tratamiento dirigido: 23 de las 42 (52%). - Respuesta evaluable en 16 de las 23 (70%) (duración ≥6 semanas). Se valoró respuesta según cambios en CT, gammagrafía ósea o valoración clínica, pero no según RECIST. - En 7 pacientes se describió beneficio clínico, de 8 a 34 semanas: 3 pacientes tratadas con everolimus presentaron respuesta de más de 32 semanas; en 8 se observó progresión. - 1 paciente suspendió el tratamiento con pazopanib por elevación de enzimas hepáticas. - No evaluables: 7 pacientes (30%) por tiempo muy corto de tratamiento (<2 semanas). - No recibieron tratamiento dirigido 19 (45%): 7 recibieron tratamiento paliativo, 5 QT convencional, 4 agotaron todas las opciones y 3 declinaron la terapia dirigida. - En total, 14 pacientes de las 42 (33%) pasaron a tratamiento paliativo en los 2 siguientes meses del resultado del test. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 141 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Hortobagyi y cols74, 2016, EEUU. Explorar con NGS el perfil genético de tumores de pacientes incluidas en el ensayo clínico BOLERO-2 para identifcar correlaciones potenciales entre alteraciones genéticas y la eficacia del tratamiento con everolimus. Ensayo clínico controlado y aleatorizado. Grupos everolimus + exemestane vs placebo + exemestane. N=724. Subgrupo análisis NGS: n=302 (42%). 244 con muestras de tumor primario (81%), 57 metástasis y 1 muestra de origen desconocido. 209 pacientes en el grupo de everolimus y 93 en grupo placebo. F1 Cáncer de mama avanzado, HR+ y HER2 negativo. No se menciona. Everolimus. - Los genes afectados con más frecuencia fueron: PI3KCA (47,6%), CCND1 (31,3%), TP53 (23,3%) Y FGFR1 (18,1%). - Se encontraron similares perfiles genómicos en las muestras del tumor primario y metastásicas. - Las pacientes con mutaciones mTOR parecen presentar mejores resultados al tratamiento con everolimus. - La presencia de mutaciones en exón 9 de PIK3CA se asoció a mayor beneficio clínico del everolimus que las mutaciones en el exón 20. Casi se produjo el doble de efecto antiproliferativo en las pacientes con mutación en exón 9. - El beneficio del everolimus fue similar entre pacientes con y sin amplificaciones FGFR1 (mediana de PFS de 4 meses en ambos casos). - En 7 pacientes con mutación FGFR2 se encontró una mediana de PFS, tras everolimus, de 2,7 meses significativamente menor que la mediana de 7 meses de PFS de los que no presentaban dicha mutación. - La amplificación CCND1 o GAs en los genes de control del ciclo celular no se asociaron a ningún beneficio en PFS tras tratamiento con everolimus. Patel y cols133, 2016, EEUU. Estudiar si diferentes herramientas web identifican opciones terapéuticas similares para un conjunto dado de GAs detectadas en biopsias tumorales y si estas opciones concuerdan con las recomendadas por F1 con el que se realizó el estudio de perfil genómico. Prospectivo, unicéntrico de pacientes incluidas en un ensayo clínico reclutadas entre jun-2013 y jun-2015. N=75 pacientes. - F1. - 4 herramientas web diseñadas para ajustar fármacos dirigidos a las dianas terapéuticas identificadas: Drug-Gene Interaction Database (DGIdb), My Cancer Genome (MCG), Personalized Cancer Therapy (PCT), cBioPortal (cBio). Muestras de metástasis. Cáncer de mama metastásico. No se menciona. Varios. - Número mediano de genes mutados por muestra: 5 (rango, 2-18). - Los genes más frecuentemente afectados fueron: TP53 (49%) y PIK3CA (40%). - 43 genes (42%) tenían al menos un fármaco aprobado por la FDA recomendado por al menos una herramienta. - La herramienta web que identificó más fármacos fue DGIdb (para 36 genes) seguida de F1 (para 31 genes), cBioPortal (para 25 genes), MCG (para 10 genes) y PCT (para 9 genes). - Los fármacos más recomendados fueron temsirolimus (para GAs en 15 genes), everolimus (para GAs en 14 genes) y regorafenib (para GAs en 10 genes). - Sólo para alteraciones en los genes Kit y FLT3 las 5 herramientas web recomendaron el mismo fármaco. - Para los genes BRAF, GFFR1 y FGFR2 las 5 herramientas recomendaron fármacos pero estas recomendaciones fueron parcialmente discordantes. - Para 7 genes, 4 herrramientas web recomendaron el mismo fármaco; para otros 11 genes, sólo coincidieron 3 herramientas web en al menos una recomendación terapéutica; y para 12 genes, sólo coincidieron 2 herramientas en recomendar el mismo fármaco. - En el 33% de los casos existe acuerdo entre 4 o más de las herramientas para recomendar un fármaco para al menos una mutación y en 72% de los casos existió concordancia entre 2 o más herramientas para recomendar entrar en un ensayo clínico. - Por tanto, sólo existe concordancia parcial en las opciones terapéuticas recomendados para las mismas GAs identificadas entre las herramientas web y F1. Ross y cols125, 2016, EEUU. Estudiar si el CGP realizado con una NGS puede sugerir un tratamiento dirigido. Serie de casos. N=22. Mujeres: 100%. Edad mediana de 57 años (rango, 32-79). - F1 sobre muestras con 20% contenido nuclear tumoral, 50 ng DNA extraído de muestras FFPE de 40 micras. Profundidad media de secuenciación de 564x. Muestras de tumor primario (n=11) y de tumor recurrente o metástasis (n=11). - IHC y/o FISH para estudio de ER, PR y HER2. Carcinoma de mama mucinoso recurrente metastásico, estadio IV (100%). ER+: n=21 (96%) PR+: n=19 (86%) HER2+: n=3 (14%). No se mencionan. No se menciona si se administró alguna terapia dirigida a las pacientes con CRGA ni se hace mención a la respuesta. - 132 GAs (6 GA por tumor), de las cuales 53 eran clínicamente relevantes (CRGA), con una media de 2,3 CRGA por tumor. - Las GAs más frecuentes fueron: amplificación FGFR1 (36%), mutación TP53 (32%), amplificación CCND1 y FGF3/4/19 (27%), mutación PIK3CA (23%) y MYST3 (23%), amplificación y/o mutación ERBB2 (23%). - La amplificación ERBB2 se detectó en 5 pacientes mediante F1 y sólo 3 mediante IHC/FISH. Esta GA se presentó con una frecuencia significativamente superior en los tumores recurrentes en comparación a los primarios (p=0,03). INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 142 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Ross y cols135, 2016, EEUU. Determinar la prevalencia de mutaciones ERBB2 como diana terapéutica en cáncer de mama metastásico e identificar GAs asociadas al cáncer de mama metastásico clínicamente avanzado. Serie de casos consecutivos. N= 5.605 De las 138 mujeres con mutaciones en ERBB2, la mediana de edad fue de 59,6 años (29-93). - F1. Cáncer de mama metastásico clínicamente avanzado. No se mencionan. Varios anti-HER2. - 697 casos (12,5%) presentaban alteraciones en ERBB2: 596 (10,6%) amplificaciones y 138 (2,4%) mutaciones. En 38 pacientes (0,7%) se daban las dos. - Los genes más frecuentemente alterados junto con las mutaciones ERBB2 fueron: TP53 (49%), PIK3CA (42%), CDH1 (37%), MYC (17%) y CCND1 (16%). - Una paciente con mutación L755S ERBB2 respondió a neratinib. - Paciente con mutación S310F respondió a trastuzumab, pertuzumab y fulvestrant. - Paciente con mutación V777L y S310F respondió a terapia anti-HER2 combinada con QT. Niu y cols, 201582, EEUU. Estudiar la incidencia y la implicación clínica de la mutación en ESR1 en pacientes con tumores de mama tratados avanzados. Estudio retrospectivo de pacientes incluidos entre nov-2012 y nov-2014 en 5 centros hospitalarios. Cohorte de 341 pacientes. Sólo se detectó la mutación en ESR1 en 28. De estos 28, la edad mediana fue de 55,5 años (rango, 34-75). - F1: muestras de recurrencia (n=3) y de metástiasis (n=25). - IHC en todas las muestras para estudiar ER, PR y HER2. - FISH para HER2. Cáncer de mama avanzado. De media, habían recibido al menos 2 líneas de QT con citotóxicos y 3 líneas de tratamiento hormonal adyuvante. Todos habían recibido al menos una línea con un inhibidor de aromatasa (AI). - Fulvestrant en 5 de 13. - Tamoxifeno a 1 paciente. - Exemestane y everolimus a 5 pacientes. - F1 detectó una mutación en ESR1 en 28 pacientes. Se detectó en 27 pacientes de 217 ER+ (27/217=12,45%), en 24 pacientes de 177 PR+ (24/177=13,6%). En total, la mutación en ESR1 se daba en 12,1% de HR+. Se detectó esta mutación en 2 de 30 pacientes ER+ y HER2+ (6,7%) y sólo en 1 paciente triple negativo (1/119=0,8%). - La mutación en ESR1 más frecuente fue Y537 (17/28=60,7%) seguida de la mutación D538 (9/28=32,1%). - 19 pacientes (67,9%) presentaban 3 o más GAs; 7 (25%) presentaban 1 o 2 GAs, y 2 (7%) sólo la mutación en ESR1. - Las GAs más frecuentes implicaban a los genes PIK3CA (35,7%), GATA3 (21,43%), CCND1 (17,86%), FGF (17,86%) y FGFR1 (17,86%). - Valoración del tratamiento: se excluyen 15 pacientes por recibir QT. - De los 13 restantes, 3 recibieron fulvestran inmediatamente antes de F1 y 2 después de F1. De ellos, 1 paciente logró EE durante 8 meses y 4 PE. Por tanto, beneficio clínico en 25% (1/5). - 1 paciente recibió tamoxifeno. No respondió al tratamiento. - 3/3 pacientes tratados antes de F1 y 2/4 después de F1 tratados con exemestane y everolimus lograron EE al menos durante 6 meses. Parker y cols132, 2015, EEUU. Presentar la experiencia de un comité para el estudio molecular de tumores centrado en pacientes individuales con cáncer de mama avanzado. Serie de casos estudiados por un equipo multidisciplinar. N=43 Edad media de 59 años DE: 11 (IC 95%: 55,71-62,29). - F1. Se indicó para establecer tratamiento tras progresión. Muestra de tumor mamario: n=13 (30%) y de las metástasis: 30 (70%). - No comparador. Cáncer de mama avanzado. HR+, HER2 negativos: n=23 (54%). Triples negativos: n=10 (23%). Triples positivos: n=7 (16%). HR negativos y HER2+: n=3 (7%). Mediana de 3 (rango, 1-13) tratamientos previos. A 17 pacientes se les administró terapia dirigida de acuerdo a las consideraciones del Comité. - 40/43 (93%) presentaban al menos 1 GA intervenible. Media de 4,79 GA por paciente, rango de 1-14. - Tiempo medio desde la solicutud al resultados del test de 27 días (mediana de 11 para la adquisición y de 14 para el procesamiento diagnóstico). - Sólo 2 pacientes presentaron el mismo perfil molecular. - 73 genes presentaron alteraciones. Se detectaron 119 GAs diferentes. - Las GAs más frecuentes fueron mutaciones TP53 (n=20; 46%), amplificaciones MYC (n=11; 25%), mutaciones o amplificaciones ERBB2 (n=10; 23%), mutación GATA3 (n=10; 23%), amplificación CCND1 (n=8; 18%), mutaciones o amplificaciones PIK3CA (n=8; 18%), amplificación FGFR1 (n=6; 13%), amplificación FGF4 (n=6; 13%), amplificación ZNF217 (n=6; 13%), amplificación FGF3 (n=6; 13%), amplificación FGF19 (n=6; 13%). - 17 de 43 pacientes (40%) fueron tratados de acuerdo a la opinión del comité basándose en el resultado de F1. - 7 pacientes (16% de 43) alcanzaron enfermedad estable durante al menos 6 meses (n=2) o remisión parcial (n=5) con PFS de 4, 7, 7, 8 y 9 meses, respectivamente. - La principal causa de no recibir el tratamiento dirigido fue la falta de acceso al mismo. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 143 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Ross y cols122, 2015, EEUU. Identificar potenciales terapias dirigidas para pacientes con cáncer inflamatorio recurrente. Estudio restrospectivo de una serie de casos, consecutivos. N=53 pacientes. 100% mujeres. Edad mediana 53,7 (rango, 33-82) años. - F1: muestras FFPE de tejido tumoral primario o metastásico. -IHC y/o FISH. Cáncer de mama inflamatorio, estadio avanzado (III o IV). HER2+: 13/52 (25%). Triple negativo: n=19/44 (39%). No se menciona. No se menciona. - Un total de 266 GAs, media de 5 GAs por paciente. En 51 tumores (96%) tenían al menos una GA clínicamente relevante. - Los genes con más alteraciones fueron: TP53 (62%), MYC (32%), PIK3CA (28%), ERBB2 (26 %), FGFR1 (17 %), BRCA2 (15 %) y PTEN (15 %). - Las vías genómicas más afectadas por las GA fueron: vía del ciclo celular y apoptosis (87%), vía PI3K (56%) y vía RTK/RAS (49%). - En 1 paciente: concordancia 100% entre la amplificación de ERBB2 detectada por NGS y HER2 determinado por IHC y/o FISH. Ross y cols80, 2015, EEUU. Estudiar potenciales terapias para pacientes con carcinoma metaplásico de mama. Serie de casos. N=20 Edad mediana=62 años (rango, 42-86) - F1 - IHC y FISH para determinar los receptores estrógenos y progesterona, y HER2. Carcinoma metaplásico de mama, avanzado. 87% eran triple negativos; 13% eran ER+ o PR+. De 16 (80%) se disponían de resultados sobre el estatus HER2: el 100% era HER2 negativas. QT, pero no se concreta nada más. Posibles tratamientos dirigidos pero no se especifica cuáles administran ni la respuesta a los mismos. - F1 identificó 93 GAs. Al menos 1 GA, media de 4,65 (SD=2,08) por tumor. - Las GAs más frecuentes se encontraron en TP53 (n=15; 75%), MYC (n=6; 30%), MLL2 (n=6; 30%) y KDM6A (n=2; 10%). - 19 (95%) presentaban 36 GA potencialmente dianas de terapia dirigida (media de 1,8; SD=1,08, por tumor). - Las pacientes HER2 negativas con IHC eran negativas a la amplificación ERBB2. Meric- Bernstam y cols129, 2014, EEUU. Comparar mediante NGS el perfil genómico en los tumores primarios y en los recurrentes de pacientes con cáncer de mama. Estudio retrospectivo de una cohorte de pacientes de las que se disponía de muestras tanto del tumor primario como de la recurrencia. N=43 pacientes. 74 tumores: 36 primarios y 38 recurrencias/metástasis. Edad mediana de 48 años (rango, 30-83). - F1. - IHC para determinar los niveles de expresión de ER, PR y HER2. - FISH para determinar el número de copias de HER2 si en IHC daba un score 2+ o si valores discordantes en el mismo paciente entre tumor primario y recurrente/ metastásico. Cáncer de mama. I: n=3 II: n=22 III: 17 IV: n=1 HR+: n=50 HER2+: n=16 Triple negativos: n=8. QT adyuvante: n=36 Tamoxifeno: n=34 Letrozole: n=2 Ninguna paciente recibió terapia dirigida anti-HER2. No se menciona. - Mediana de tiempo libre de enfermedad fue de 39 meses desde el diagnóstico y 36,5 meses desde la cirugía. - Se identificaron alteraciones en 55 genes. En cada muestra se detectó al menos una alteración. Media de 3,95 GAs por muestra (rango, 1-12). - Se identificaron mutaciones en numerosos genes como PIK3CA, TP53, ARID1A, PTEN, AKT1, NF1, FBXW7 y FGFR3, y amplificaciones (>6 copias) en MCL1, CCND1, FGFR1, MYC, IGF1R, MDM2, MDM4, AKT3, CDK4 y AKT2. - Alteraciones en TP53 se detectaron en el 87,5% de los triples negativos, en 68,8% de los HER2+ y 18,2% de los HR+. Esta diferencia según subtipo fue significativa (p=0,0028). - Amplificaciones en HER2 en 12 (30%) muestras. - En 33 tumores primarios y recurrentes emparejados, 97 de 112 (86,6%) mutaciones somáticas fueron concordantes. - 40 pacientes (93%) presentaron alteraciones intervenibles. Y la mayoría se conservaron entre el tumor primario y la recurrencia/metástasis. Vasan y cols131, 2014, EEUU. Estudiar la frecuencia de GAs potencialmente intervenibles en cáncer de mama que puedan ser dianas de fármacos aprobados o en investigación en ensayos clínicos. Serie de casos. N=51 Edad media de 52 años (rango, 28-86). - F1. Muestras de DNA recogidas de forma prospectiva. - No comparador. Cáncer de mama. Estadios: I: n= 1 II: n=17 III: n= 15 IV: n=18 ER+: 58% HER2+: 20% Triple negativos: 31% En los metastásicos, al menos 2 líneas de tratamiento previo. Recibieron una media de 7 fármacos diferentes (rango, 5-17). No lo especifican. - Se detectaron 158 GAs en 55 genes de 48/51 (94%) de tumores. Media de 3,1 GAs por tumor (rango, 0-9). - En 39 (76%) tumores se identificaron numerosas GAs mientras que sólo 9 (18%) tumores presentaron una sola GA y 3 (6%) no presentaron ninguna GA. No se encontraron diferencias significativas entre la media de GAs por tumor primario (2,9) y en los tumores metastásicos hipertratados (3,4), p=0,31. - Las GAs fueron 45 (15%) sustituciones de bases, 24 (28%) indels, 63 (40%) amplificaciones focales, 18 (11%) deleciones homocigóticas y 8 (5%) reordenamientos. - El 84% de las muestras presentaba al menos 1 GA intervenible. - Número medio de GAs potencialmente intervenibles fue similar en el tumor primario (1,6; rango, 0-4) y en los metastásicos hipertratados (2,0; rango, 0-4), p=0,24. - Las GAs intervenibles más frecuentes se dieron en los genes: PIK3CA (n=9, 18%), HER2 (n=9, 18%), NF1 (n=7, 14%), MCL1 (n=6, 12%) y PTEN (n=5, 10%). Otros 25 genes con alteraciones intervenibles se identificaron a una frecuencia menor (<10%). - Tiempo hasta recibir el informe de F1 fue de 7-14 días. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 144 autor, año, país objetivo tipo estudio muestra, características población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Wheler y cols127, 2014, EEUU. Estudiar el perfil genómico de pacientes con cáncer de mama metastásico para buscar el tratamiento óptimo que se ajuste al perfil molecular de cada paciente. Series de casos consecutivos. N=57 Mujeres: 100%. - F1. Secuenciador Illumina HiSeq 2000. - No comparador. Cáncer de mama metastásico. HR+ y HER2-: n=26 HR+ y HER2+: n=7 HR- y HER2+: n=4 Triple negativos: n=20. No se menciona. Mencionan fármacos dirigidos pero no que los administren a las pacientes ni estudian la respuesta a los mismos. - Ninguna paciente presentaba el mismo patrón molecular. - Se identificaron 131 GAs somáticas. - Número medio de GAs por paciente fue de 4. - La mayoría de las GAs eran intervenibles. - Los genes más frecuentemente alterados fueron: TP53 (n=30, 13,9%), PIK3CA (n=25; 11,6%), CCNDA (n=12; 5,6%), MYC (n=12; 5,6%), HER2/ERBB2 (n=11; 5,1%), MCL1 (n=7; 3,2%), PTEN (n=7; 3,2%), FGFR1 (n=6; 2,8%), GATA3 (n=5;2,3%), NF1 (n=5; 2,3%), PIK3R1 (n=5; 2,3%), BRCA2 (n=4; 1,9%), EGFR (n=4; 1,9%) y IRS2 (n=4; 1,9%). - Las GAs más frecuentes fueron mutaciones (46%) y amplificaciones (45%). Entre las 80 mutaciones diferentes identificadas, 49 no se habían descrito en TCGA ni COSMIC en pacientes con cáncer de mama. Todas las amplificaciones habían sido encontradas anteriormente en pacientes con este tumor. Balko y cols128, 2013, EEUU. Estudiar perfil molecular de pacientes con cáncer de mama residual triple negativo tras tratamiento con quimioterapia neoadyuvante. Serie de casos. N=111 aunque F1 se realiza en sólo en 74. Edad mediana de 48 años (rango, 24-78). Premenopáusicas: n=55 (50%) Ganglios positivos: n=70 (63%) - IHC determinó que eran triples negativos. - FISH para estudiar HER2 en casos dudosos o discrepantes. - F1. Cáncer de mama. IIa: n=3 (3%) IIb: n=5 (5%) IIIa: n=13 (12%) IIIb: n=77 (69%) IIIc: n=10 (9%) Triples negativas: 100%. QT Taxanos: n=55 (50%) No se menciona. - 81/85 muestras fueron analizadas con F1. - 74 muestras mostraron datos evaluables. - Se identificaron alteraciones en el gen TP53 en el 89% de las muestras. Los otros genes con alteraciones más frecuentes fueron MCL1 (54%) y MYC (35%). - En esta cohorte de pacientes ya tratadas se detectó un porcentaje mayor de alteraciones PTEN, amplificaciones JAK2, CDK6, CCND1, CCDN2, CCDN3 y de IGF1R del descrito en TCGA para cáncer de mama. - CNAs en familia AKT y CCND asociadas a resistencia a QT. También truncamientos y mutaciones TSC1. Estas alteraciones son sensibles a everolimus. - Amplificaciones JAK2 y amplificaciones MYC predecían pobre supervivencia global mientras que alteraciones PTEN se relacionaron con pronóstico favorable. - Los inhibidores MEK podrían tener un papel terapéutico en pacientes con amplificaciones MYC. - Los autores aconsejan realizar estudio molecular en todas las pacientes resistentes a QT. Ross y cols134, 2013, EEUU. Estudiar si F1 permite detectar dianas terapéuticas nuevas en pacientes con carcinoma lobular invasivo con mutación en CDH1 recidivante o metastásico o resistente a tratamiento. Serie de casos. N=22 Edad media de 56 años (rango, 44-74). - F1. Muestras del tumor primario: n=9 y de metástasis: n=13. - IHC para ER, PR y HER2. - FISH para HER2. Carcinoma lobular invasivo con mutación en CDH1. Grado 1: n=1 (5%) Grado 2: n=16 (73%) Grado 3: n=5 (23%). Estadio III: n=6 (27%) Estadio IV: n=16 (73%). ER+: 88%, PR+: 61% HER2: 5% No se mencionan. No se mencionan. - Se detectaron 75 GAs en los 22 tumores. Media de GAs por tumor: 3,4. - 35 GAs intervenibles. Media de GAs intervenibles por paciente de 1,59 (rango, 0-3). - 19 de 22 (86%) presentaban al menos 1 GA intervenible asociada a terapia dirigida que había demostrado beneficio clínico. - Todas las pacientes presentaban alteraciones en CDH1 y todas estas GA eran diferentes, no se repetía el patrón de secuencia de la GA en ninguna paciente. - Las mutaciones más frecuentes se encontraron en PIK3CA (n=8, 36%),TP53 (n=6, 27%), RB1 (n=2; 9%), KRAS (n=2; 9%), AKT1 (n=2; 9%) y ERBB4 (n=1; 5%). - La mutación en PIK3CA se daba con más frecuencia en el tumor primario que en el metastásico mientras que la mutación TP53 se dio más en las metástasis. - Entre las CNAs se detectaron en CCND1 (n=6; 27%), FGFR1 (n=3; 14%), MYC (n=2; 9%) y ESR1 (n=1; 5%). - En 6 pacientes (27%) se encontraron alteraciones en ERBB2 (en 4, mutaciones; en 1, amplificación; en 1, genes de fusión). Es una proporción superior a la habitualmente descrita en cáncer de mama. Podría ayudar a seleccionar la terapia dirigida. AI: inhibidor de aromatasas, CGP: perfil genómico completo, CNA: alteraciones en el número de copias, CRGA: Clinical relevant genomic alteration, CT: tomografía computerizada, ctDNA: DNA tumoral libre circulante, EE: enfermedad estable, ER: receptores de estrógenos, F1: FoundationOne, FFPE: Fijado en formalina e incluido en parafina FISH: hibridación in situ fluorescente, G360: Guardant 360, GA: alteración genómica, HR: receptores hormonales, IHC: inmunohistoquímica, QT: quimioterapia, NGS: secuenciación de nueva generación, RP: respuesta parcial, VUS: variantes de significado desconocido. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 145 Tabla 6. estudios de f1 en pacientes con melanoma. autor, año, país objetivo tipo de estudio muestra, características población index test/ comparador tumor, estadio tto. previo tto. dirigido f1 resultados Carlson y cols100, 2017, EEUU. Se utiliza F1 para realizar CGP e identificar las GAs que puedan influir en el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico. Serie de casos. N=30. Edad mediana de 56 años (media de 60 y rango, 41-83). Hombres: n=17 (57%) Mujeres: n=13 (43%) F1. Illumina HiSeq 2000 a una profundidad media de cobertura de 776x. Melanoma en estadio IV. Varios tipos histológicos. No se menciona. No se menciona. - Todos tenían al menos 1 GA. Se detectaron 83 GAs, mediana de 2,5 GAs por muestra (rango, 1-7). - Las GAs más frecuentes fueron sustituciones (54/83; 65%), amplificaciones (17/83; 20%), pérdidas del gen completo o de exones (11/83; 13%). - Número significativamente superior de GAs en los melanomas pobremente diferenciados y en los anaplásicos. - Mutación BRAF significativamente más frecuente en el fenotipo nevoide (100% vs 32%, p=0,02) - Las principales vías de señalización afectadas fueron MAPK (77%), PTEN-PI3K-AKT (50%) y p16INH4a-CCND1-CDK4-RB1 (43%). - Todos tenían, al menos, 1 GA clínicamente relevante (CRGAs). Se identificaron 64 CRGAs (77%; 64/83). Mediana de 2 CRGAs por tumor (media de 2,1; rango: 1-7). - 29% (24/83) muestras presentaron GAs intervenibles. - Gracias a F1 se identifican más CRGAs lo que supondrían una influencia en la selección del tratamiento. Johnson y cols105, 2016, EEUU. Estudiar el valor predictivo de la TMB detectada por F1 de respuesta a la inmunoterapia. Estudio retrospectivo sobre muestras almacenadas. Entre enero-2011 y marzo-2015. N=65. F1 sobre muestras de biopsia o resección. Melanoma metastásico. Mediana de líneas de tratamiento previas de 1. Anti-PD-1 (nivolumab y pembrolizumab) o Anti-PD-L1 (atezolizumab). - La mediana de TMB fue diferente entre grupos según la mutación driver: BRAF, NRAS, NF1 y triple wild-type (12,0 vs 17,6 vs 62,7 vs 2,2 mut/Mb; p<0,001). - GAs en NF1 fueron más frecuentes entre respondedores (50% vs 21%; p=0,015) mientras que el triple wild-type fue más frecuente en los no-respondedores (13% vs 35%; 0=0,045). - Los melanomas con mutaciones BRCA2 presentaron mayor TMB (mediana de 68,2 vs 15,9; p=0,028). - TMB significativamente mayor en los respondedores a anti-PD-1/PD-L1 (mediana de 45,6 vs 3,9 mut/Mb; p=0,003). - Se calculan los cutoffs para clasificar a los pacientes en tres grupos según la probabilidad de respuesta al tratamiento: alta TMB (>23,1 mut/Mb), intermedia (3,3-23,1 mut/Mb) y baja (<3,3 mut/Mb). - Tasa de respuesta objetiva mayor en los de alta TMB en comparación a los de intermedia y baja (85% vs 29% vs 14%; p<0,001). - PFS y supervivencia global superiores de forma significativa en el grupo de alta TMB. Wheler y cols139, 2015, EEUU. Estudio piloto para investigar pacientes con melanoma avanzado que responden a inhibidores BRAF y/o MEK. Análisis retrospectivo de una serie consecutiva de pacientes y que tras inhibidores BRAF y/o MEK alcanzan RP o RC. Se inicia el estudio en julio de 2010. N=10. Edad mediana de 52 años (rango, 23-60). Hombres: n=7 (70%). Mujeres: n=3 (30%). ECOG=0: n=5 ECOG=1: n=5. - PCR para detectar alteraciones BRAF. Cuando fue posible, se estudiaron también KRAS, NRAS, PIK3CA y TP53. - IHC para estudiar deleciones PTEN. - F1, profundidad media de cobertura de 734x con >99% de bases cubiertas a >100x. Melanoma avanzado con mutación BRAF en los que ha fracasado el tratamiento estándar, y posterior respuesta parcial o completa a inhibidores BRAF y/o MEK. Mediana de 2 tratamientos previos (rango, 0-5). Inhibidores BRAF a 7 pacientes. Inhibidores MEK a 1 pacientes. Inhibidores BRAF y MEK a 2 pacientes. - Todos los pacientes tenían la mutación BRAF V600E pero también se constató que la mayoría de pacientes presentaba múltiples GAs. Estas GAs podían ser responsables de la resistencia al tratamiento con inhibidores BRAF/MEK. - 7 (70%) tenían alteraciones somáticas de significado conocido además de la mutación BRAF. - 7 (70%) tenían alteraciones somáticas de significado incierto. - Evaluación radiológica de la respuesta por CT y/o PET aplicando criterios RECIST v1.0 o v 1.1: RC en 4 (40%), RP en 6 (60%). - Tiempo hasta el fallo del tratamiento (TTF): de los pacientes con RC, TTF=5,6; 23,6+; 27,4+ y 28,7+ meses. De los pacientes con RP: TTF= 3,0; 4,2; 5,7; 7,0; 7,9 y 11,2 meses. CGP: perfil genómico completo, CRGA: Clinical relevant genomic alteration, CT: tomografía computerizada, F1: FoundationOne, GA: alteración genómica, IHC: inmunohistoquímica, NGS: secuenciación de nueva generación, PET: tomografía por emisión de positrones, PFS: supervivencia libre de progresión RC: respuesta completa, RECIST: Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RP: respuesta parcial, PD-1: proteína de muerte programada 1, PD-L1: ligando de muerte programada 1, TTF: tiempo hasta el fallo del tratamiento. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 146 ANEXO VII. Otras plataformas NGS distintas de F1 Hoy día, se dispone de múltiples plataformas NGS comercializadas. Estas plataformas intentan identificar las GAs somáticas presentes en muestras tumorales tisulares FFPE, en el DNA tumoral circulante y algunas platafor- mas permiten, también, analizar tejidos sanos como saliva o sangre para dis- poner de DNA de referencia con el que comprar los resultados procedentes del DNA tumoral. La mayoría de las plataformas NGS requieren de una muestra de al menos 5 mm2 y un mínimo de un 5% de células tumorales; son capaces de identificar mutaciones e indels pero también fusiones/transloca- ciones y CNAs, además de aportar información sobre la MSI y TMB, impor- tantes predictores de respuesta a la inmunoterapia. En la tabla 7 de este anexo se presentan las principales características de estas NGS. FoundationOne® Liquid Es un test de biopsia líquida de nueva generación para el estudio del ctDNA de tumores sólidos. Analiza unos 70 genes, y se ha descrito una sensibilidad del 99% y un valor predictivo positivo del 99%. Identifica las GAs clínica- mente relevantes, además de MSI. Puede ayudar en la toma de decisiones al profesional sanitario al identificar las potenciales terapias dirigidas y/o ensa- yos clínicos y por aportar información relevante para el diagnóstico, estrati- ficación del riesgo y pronóstico. El test se considera como complemento al estudio de las muestras tisulares o cuando estas muestras no son válidas. El resultado se obtiene en algo menos de 2 semanas. FoundationOne® Heme Se trata de un test de perfil genómico completo para el estudio de tumores hematológicos y sarcomas. Las muestras pueden estar FFPE, ser de sangre periférica o de aspirado de médula ósea. Se utiliza para la secuenciación de DNA, de 405 genes alterados en cáncer y 31 genes implicados frecuente- mente en reordenamientos además de la secuenciación de RNA de 265 ge- nes que permite estudiar un amplio rango de fusiones, muchas en el origen de los sarcomas y tumores hematológicos. Permite estudiar todo tipo de GAs: sustituciones de bases, inserciones, deleciones, fusiones, CNAs, duplica- ciones y reordenamientos. Las alteraciones genómicas diana pueden incluir variaciones en el número de copias (amplificaciones, deleciones, duplicacio- nes) o mutaciones (deleciones, reordenamientos, truncamientos o fusiones) en los genes reparadores de DNA, discordancia en los genes reparadores, VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 147 alteraciones en la vía PIK3/mTOR, en los ERBB2, BRAF, etc. Aporta infor- mación sobre las CRGAs, las potenciales terapias dirigidas, ensayos clínicos disponibles y sobre la posibilidad de respuesta a inmunoterapia. Guardant360® (G360, Guardant Health, Redwood City, CA, EEUU) Se trata de una biopsia líquida que utiliza ctDNA tomado de una muestra de sangre con el fin de identificar mutaciones, indels y reordenamientos en más de 70 genes diferentes. Fue aprobado por la FDA en enero de 2018. En unos 7 días proporciona un informe que sugiere el tratamiento más indicado para las GAs o, en su defecto, la existencia de algún ensayo clínico en el que pue- da ser para ofrecer al paciente. Está indicado en pacientes con tumor sólido avanzado o metastásico cuando la enfermedad progresa después de recibir el tratamiento convencional. Otras indicaciones serían no disponer de sufi- ciente cantidad de tejido, que resulte imposible volver realizar biopsia o si ésta se descarta por su carácter invasivo, o que se hayan administrado varias líneas de tratamiento después de obtener la biopsia. Caris Molecular Intelligence® (CMI, Caris Life Sciences, Phoenix, AZ, EEUU) Esta plataforma se basa en una multiplataforma que trata de utilizar toda la información clínica relevante para buscar opciones terapéuticas para tumo- res sólidos. Se trata de una herramienta para la ayuda a la toma de decisio- nes para identificar el mejor tratamiento para cada paciente. CMI obtuvo el marcado CE como dispositivo médico de diagnóstico in vitro en 2015. CMI estudia el perfil tumoral, analizando proteínas, RNA y DNA tumo- rales, mediante el uso de las siguientes técnicas: 1) IHC para determinar el nivel de expresión de ciertas proteínas; 2) hibridación in situ para detectar deleciones, amplificaciones, translocaciones y fusiones de determinados genes; 3) NGS para identificar mutaciones del DNA, variaciones en el número de copias, genes de fusión y reordenamientos, amplificaciones e indels. Estudia 592 genes. También con NGS es posible determinar la TMB y la MSI43; 4) Se- cuenciación de Sanger que examinar las cadenas de DNA para identificar mu- taciones mediante el análisis de secuencias largas y contiguas; 5) Pirosecuen- ciación para detectar y cuantificar mutaciones, metilaciones, etc. a través de la secuenciación por síntesis; 6) Análisis de Fragmentos, que detecta cambios en el DNA o RNA para indicar la presencia o ausencia de marcadores genéticos. CMI define una TMB alta si en el tumor se presentan 17 mut/Mb. En este sentido CMI ayudaría a la toma de decisiones sobre la idoneidad de INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 148 establecer o no el tratamiento con inhibidores de punto de control. La con- cordancia entre CMI y PCR para el total de tumores indica una sensibilidad de la NGS del 95,8%, una especificidad del 99,4%, valor prodictivo positivo del 94,5% y valor prodictivo negativo del 99,2%43. Utiliza una muestra de tejido FFPE. Se requiere una superficie de 25 mm2. El porcentaje mínimo de núcleos tumorales debe ser >20%. El secuen- ciador utilizado es de Illumina. Los resultados de CMI se resumen en un informe que tarda unos 14 días en completarse desde que se recibe la muestra. En este informe se incluyen las GAs identificadas y otros biomarcadores tumorales, además de una relación de fármacos que podrían ser efectivos contra el tumor, tanto quimioterápicos, como tratamiento hormonal, inmunoterapia y terapia dirigida. Por otro lado, se incluye un listado de ensayos clínicos en los que se investiga la efectividad de determinados fármacos frente a GAs concretas. También en el informe se presenta la evidencia que respalda el uso de cada terapia, agrupados según si hay un beneficio potencial, falta de beneficio o beneficio incierto. MSK-IMPACT MSK-IMPACT (Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets) es un test de diagnóstico in vitro que utiliza la tecnología NSG sobre mues- tras tisulares FFPE de tumores malignos sólidos para detectar GAs en un panel de 468 genes. El test identifica mutaciones somáticas, tanto mutacio- nes puntuales, SNVs como pequeños indels, además de determinar la MSI. MSK-IMPACT fue desarrollado por el Memorial Sloan Kettering (MSK) Cancer Center185. Fue aprobado por la FDA en noviembre de 201712. Requiere entre 5-20 cortes de muestras de tejido sin teñir, de 10 micras de grosor, con más de un 20% de células tumorales aunque para determinar la MSI se precisa >25% de células tumorales. La cantidad de DNA necesaria oscila entre 100-250 ng. Se utiliza el secuenciador Illumina HiSeq™ 2500. MSK-IMPACT utiliza la herramienta OncoKB (http://oncokb.org/)186 para facilitar la interpretación clínica de las mutaciones detectadas. OncoKB es una base de datos de conocimiento en oncología de precisión, con infor- mación biológica, clínica y terapéutica, constituida a partir de múltiples fuentes de información basada en la evidencia, como guías y recomendacio- nes de profesionales y grupos de expertos, información terapéutica y datos procedentes de la literatura médica. Las mutaciones detectadas son clasifica- das en dos grupos, uno con evidencia de significación clínica y otro de poten- cial significación clínica, tanto pronóstica como predictiva. Todos los datos recogidos de los tests MSK-IMPACT están disponibles para la comunidad científica en la basa de datos cBioPortal (http://www. cbioportal.org/), también desarrollada por MSK. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 149 OncoDEEP® (OncoDNA, Gosselis, Bélgica) Se trata de una multiplataforma que permite el análisis de DNA y proteínas a partir de muestras FFPE de tumores sólidos. En total secuencia 313 genes ligados a terapias dirigidas aprobadas. Las GAs que puede identificar son mutaciones puntuales, indels y CNAs. Las translocaciones, genes de fusión y reordenamientos se analizan mediante secuenciación RNA. También realiza análisis IHC, FISH y otras pruebas para detectar algunas proteínas relevantes implicadas en el proceso oncológico, que se seleccionarán en función del tipo de tumor y de los tratamien- tos previos recibidos por el paciente. Además permite evaluar la MSI y TMB. Se considera que la muestra para NGS es de suficiente calidad si el te- jido tumoral es al menos un 10% del total de la muestra, el tamaño del tejido tumoral debe ser >5 mm2 y la invasión de linfocitos debe ser <20% en la zona donde estén localizadas las células tumorales. Se requiere un bloque FFPE o 20 cortes de 5 µm. Utiliza el secuenciador Ion TorrentTM. OncoDEEP® genera un informe en unos 10 días hábiles que el incluye la asociación de la alteración genómica con algunos fármacos quimioterápi- cos (taxanos, análogos de nucleósidos y basados en platino), con inmunote- rapia, terapia dirigida y fármacos en investigación en ensayos clínicos, pero no con tratamiento hormonal, aunque no está claro el nivel de evidencia que sustenta estas asociaciones. OncoSELECTTM (OncoDNA, Gosselis, Bélgica) Permite detectar las mutaciones en ctDNA. Dispone de tras paneles especí- ficos para pacientes con NSCLC, cáncer de colon y cáncer de mama HR+ o HER2+. Facilita la identificación de resistencias al tratamiento, antes de que éstas puedan ser diagnosticadas mediante las pruebas de imagen. Y también puede servir para monitorizar la respuesta tumoral y en caso de ser necesa- rio, modificar el tratamiento. BioSequence-OncoDNA selecciona los estudios genómicos más apropia- dos para cada indicación. Genera un informe detallado integrado en la platafor- ma interactiva Oncoshare, donde se expresa a la asociación directa entre las al- teraciones detectadas, las opciones de tratamiento y los ensayos clínicos. Según la propia empresa, hasta mayo de 2016, había conseguido cambiar la estrategia terapéutica en un 67% de los pacientes informados. En este sentido, sería una herramienta de gran valor para la toma de decisiones clínicas para el paciente. OncoSTRAT&GO (OncoDNA, Gosselis, Bélgica) Combina sendos análisis, de muestras tisulares FFPE de tumores sólidos malignos y la biopsia líquida de muestras sanguíneas para análisis de ctD- INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 150 NA. Se debe enviar un bloque tumoral y se considerará que la muestra es válida si incluye se dan tres condiciones: que incluya más de un 10% de cé- lulas tumorales, que éstas estén localizadas en un área de más de 5 mm2 y que el porcentaje de linfocitos en la región donde se sitúan las células tumo- rales sea inferior al 20%. El secuenciador utilizado para la NGS es Ion TorrentTM para analizar DNA y RNA de un elevado número de genes en el tejido y en el ctDNA, genes seleccionados por su relevancia clínica en el cáncer. Además de NGS, también se realiza análisis IHC, FISH o análisis de translocaciones, que se realizarán dependiendo del tipo de tumor del paciente y de los tratamientos recibidos. Este test genera multitud de datos para cuyo análisis se desarrolló el software OncoKDO que integra todos esos resultados, además de incluir la evidencia publicada y con todo ello genera un informe donde se incluyen recomendaciones de tratamiento, tanto con fármacos aprobados para el tipo de tumor como otros que han demostrado su utilidad en otros tumores o que sólo pueden usarse en ensayos clínicos. Este informe tarda unos 10 días e incluye las GAs, MSI y TMB. Ha sido el test utilizado en el ensayo clínico NCI-MATCH (National Cancer Institute-Molecular Analysis of Therapy Choice). OncomineTM Dx Target Test (Thermo Fisher Scientific) Se trata de una tecnología NGS que permite estudiar hasta 46 GAs en genes relacionados con el cáncer, incluyendo mutaciones en EGFR (incluyendo L858R, T790M y deleciones en exón 19), BRAF, KRAS, ERBB2 y MET, y fusiones en ALK, ROS1, RET y NTRK1/2/3, y en función de las alteraciones identificadas, recomendará el tratamiento con dabrafenib, trametinib, crizo- nitib o gefitinib. Utiliza un secuenciador Ion TorrentTM. El informe de Onco- mine se emite en unos 4 días evitando el retraso en las decisiones terapéuti- cas. Fue aprobado por la FDA como un dispositivo de diagnóstico complementario (companion diagnostic device) in vitro en junio de 2017 para pacientes con NSCLC. Paradigm Cancer Diagnostic (PCDx) (Paradigm Diagnostics, Phoenix, AZ, EEUU) Utiliza muestras tumorales FPPE de tumores sólidos recurrentes, recidivan- tes o metastásicos, sobre los cuales realiza NGS que permite identificar mu- taciones y CNAs de DNA, análisis de RNA para estudiar fusiones y análisis VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 151 IHC para ver la expresión de ciertas proteínas. También determina la MSI y TMB. Utiliza Illumina NextSeq que puede ofrecer resultados en 25 horas. Las muestras deben contener un mínimo de un 15% de células tumorales y superficie >3 mm2. Se considera uno de los tests más sensibles del mercado, con sensibilidad y especificidad ≥99%. OncoVantage (Quest Diagnostics) Utiliza la tecnología NGS para identificar GAs de tumores sólidos, aunque sólo detecta mutaciones puntuales e indels, no reordenamientos ni CNAs. Su estudio incluye los 34 genes intervenibles, más frecuentemente alterados en procesos tumorales sólidos con fines diagnósticos, pronósticos y terapéuti- cos187. Utiliza un secuenciador Ion TorrentTM. Tempus xT/xE/xF (TEMPUS, Chicago, IL, EEUU) Tempus xT incluye tecnología NGS que utiliza un secuenciador Illumina para secuenciar DNA y RNA. Permite identificar mutaciones, fusiones, CNAs de 595 genes de relevancia diagnóstica, pronóstica y terapéutica en cancer. También determina la TMB y MSI. Tarda entre 14 y 21 días en emitir un informe pero también otro en los siguientes 18 meses desde el resultado inicial con el fin de aportar información sobre la evolución del tumor en el tiempo188. Tempus xE secuencia el exoma completo. Analiza muestras tisulares tumorales FPPE y muestras normales de saliva o sangre para confirmar las variantes somáticas. Identifica SNPs, indels y CNAs. Presenta una sensibili- dad del 98,8% y especificidad del 99,9% para SNPs e indels a 10% VAF (variant allele fraction) y una sensibilidad del 87% y especificidad del 99% para las CNAs. Tempus xF es una forma de biopsia líquida, basada en tecnología NGS, que incluye un panel de 105 genes para detectar las GAs intervenibles de tumores sólidos en sangre circulante. Permite estudiar SNVs, indels, CNAs y reordenamientos cromosómicos (translocaciones). Este test tiene un límite de detección de 0,5% de VAF con una sensibilidad del 99% para SNVs, in- dels y CNAs; y un límite de detección del 1% VAF con una sensibilidad del 99% para las translocaciones. INFORMES, ESTUDIOS E INVESTIGACIÓN 152 Tabla 7. plataformas ngs: principales características. nombre fabricante aprobación fda, marcado ce, fecha. tipo de ácido nucleico tipo de muestra número de genes mide tmb y msi cantidad mínima necesaria de ácido nucleico cantidad de muestra secuenciador tiempo hasta el informe FoundationOne Foundation Medicine, Inc. CE, 2014 DNA FFPE 287 Sí 40-50 ng ≥40 μm de tejido tumoral Illumina 14 días FoundationOne CDx Foundation Medicine, Inc. FDA, nov-2017 DNA FFPE 315 Sí 40-50 ng ≥40 μm de tejido tumoral Illumina 14 días FoundationOne Heme Foundation Medicine, Inc. ctDNA, RNA FFPE, sangre periférica y aspirado de médula ósea 405 Sí 14 días FoundationOne Liquid Foundation Medicine, Inc. ctDNA sangre periférica 70 MSI 14 días Guardant 360 Guardant Health, Redwood City, CA, EEUU. FDA, ene-2018 ctDNA sangre periférica 73 ¿? 5 ng 7 días MSK Impact Memorial Sloan Kettering (MSK) Cancer Center. FDA, nov-2017 DNA FFPE 468 MSI 100-250 ng Illumina 30 días Caris Mollecular Intelligence (CMI) Caris Life Sciences. CE, 2015 DNA y RNA FFPE 592 Sí 25 mm2 tejido tumoral Illumina 10-14 días Paradigm Cancer Diagnostic (PCDx) Paradigm Diagnostics, Phoenix, AZ, EEUU. No se han encontrado datos DNA y RNA FFPE 131-234 Sí 1,5 ng Illumina 4-5 días OncoDeep OncoDNA, Gosselis, Bélgica. DNA y RNA FFPE 313 Sí >5 mm2 de tejido tumoral Ion Torrent 10 días OncomineTM Dx Thermo Fisher Scientific. FDA, jun-2017 DNA y RNA FFPE 161 Sí 10 ng Ion Torrent 4 días OncoVantage Quest/ IBM Genomics. No se han encontrado datos DNA FFPE 34 ¿? Sin datos Ion Torrent 14 días Tempus xT/xE/ xF Tempus Labs, Inc. Chicago, IL, EEUU. No se han encontrado datos DNA y RNA FFPE, saliva, sangre 595/Exoma Completo/105 Sí Sin datos Illumina 14-21 días FFPE: muestra de tejido tumoral fijada en formalina y embebida en parafina; ctDNA: DNA tumoral circulante. VALIDEZ, UTILIDAD CLÍNICA Y SEGURIDAD 153 ANEXO VIII. Ensayo clínicos con F1/F1CDx Tabla 8. ensayos clínicos con f1/f1cdx. título Identificador/País/Año de inicio tipo de estudio tipo de cáncer objetivo participantes tiempo de seguimiento estado FoundationOneTM Test Registry Study NCT01851213/EEUU/2013 Observacional, prospectivo, multicéntrico - Caracterizar los patrones de utilización de la prueba F1 por parte de oncólogos bajo condiciones de práctica clínica rutinaria en EEUU. 510 12 meses Completado IMAGE Study: Individualized Molecular Analyses Guide Efforts in Breast Cancer - Personalized Molecular Profiling in Cancer Treatment at Johns Hopkins NCT01939847/EEUU/2013 Ensayo clínico no aleatorizado Cáncer de mama metastásico Estudiar la viabilidad para la identificación de pacientes que podrían beneficiarse del análisis del perfil molecular del tumor así como analizar los resultados de los pacientes que siguieron el tratamiento dirigido sugerido en comparación con los que no lo hicieron. 32 12 meses Completado Comprehensive Gene Sequencing in Guiding Treatment Recommendations Patients With Metastatic or Recurrent Solid Tumors NCT01987726/EEUU/2013 Ensayo clínico piloto, observacional prospectivo Cáncer de mama y CCR recurrentes o en estadio IV Estudiar la secuenciación genómica completa para guiar las recomendaciones de tratamiento en pacientes con tumores sólidos metastásicos o recurrentes. 150 18 meses Activo Concordance Between ctDNA Assay and FoundationOne NCT02620527/EEUU/2014 Observacional Tumores sólidos Evaluar la capacidad de un nuevo test de Foundation Medicine Inc. para la detección de alteraciones genómicas en la sangre periférica concordantes con las alteraciones genómicas detectadas por la prueba F1. 1400 - Completado Outcomes of FoundationOne Directed Therapy in Cancer of Unknown Primary NCT02628379/EEUU/2015 Observacional prospectivo Tumor primario de origen desconocido Determinar si F1 proporciona información que permita a los médicos tomar decisiones terapéutica para utilizar terapias dirigidas. 125 20 meses Completado Genomic Profiling in Previously Untreated Metastatic Non-small Cell Lung Cancer NCT02671045/EEUU/2015 Estudio de cohortes NSCLC Comparar los datos sobre supervivencia y costes basándose en el uso de diferentes perfiles genómicos. 649 20 meses Finalizado, reclutamiento no completado TEMPO study: A Prospective Observational Trial Evaluating Outcomes of FoundationOne (Registered Trademark)-Directed Matched Targeted Therapy in Patients with Cancer of Unknown Primary ACTRN12616000331437/ Australia y EEUU/2016 Estudio observacional Tumor primario de origen desconocido Evaluar la utilidad del F1 en pacientes diagnosticados de tumor de origen desconocido. 500 - Finalizado, reclutamiento no completado PROFILER02: Evaluation of the Added Value of a Large Molecular Profiling Panel Versus a Limited Molecular Profiling Panel in Advanced Solid Tumors. NCT03163732/Francia/2017 Ensayo clínico multicéntrico aleatorizado Tumor sólido avanzado Comparar la relevancia clínica de F1 frente al panel CONTROL. 300* 28 meses Reclutando BLCIO: Beating Lung Cancer in Ohio Protocol in Improving Survival in Patients With Stage IV Non-Small Cell Lung Cancer NCT03199651/EEUU/2017 Ensayo clínico aleatorizado NSCLC Evaluar las inmunoterapias y terapias dirigidas para NSCLC frente a los tratamientos convencionales en términos de supervivencia, toxicidad y calidad de vida. 2994 36 meses Reclutando An Investigational Immuno-therapy Study of Nivolumab, or Nivolumab in Combination With Ipilimumab, or Placebo in Patients With Extensive-Stage Disease Small Cell Lung Cancer (ED-SCLC) After Completion of Platinum-based Chemotherapy NCT02538666/varios países/2015 Ensayo clínico aleatorizado Cáncer de pulmón de células pequeñas Evaluar si el tratamiento con nivolumab o con nivolumab+ipilimumab seguido de nivolumab prolonga la supervivencia global de los pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas. 1327 37 meses? Activo BREAKOUT - International Breast Cancer Biomarker, Standard of Care and Real World Outcomes Study BREAKOUT. NCT03078036/varios países/2017 Estudio de cohorte Cáncer de mama metastásico Estudiar la prevalencia del gen BRCA en una población no seleccionada, describir los tratamientos administrados y estimar los resultados clínicos asociados de la supervivencia global y la supervivencia libre de progresión entre las portadoras de mutaciones en el contexto de un entorno de tratamiento con un inhibidor de la PARP. 1864 30 meses Activo, no reclutando Evaluation of the Safety and Tolerability of Niraparib With Everolimus in Ovarian and Breast NCT03154281/EEUU/2017 Ensayo clínico no aleatorizado Cáncer de ovario y de mama Determinar la dosis máxima tolerada de la combinación de niraparib y everolimus para el tratamiento de cáncer de ovario y cáncer de mama. 24 24 meses Reclutando Evaluation of the Safety and Tolerability of TAK-228 With TAK-117 and Paclitaxel in Advanced Solid Tumors NCT03154294/EEUU/2017 Ensayo clínico no aleatorizado Tumor sólido avanzado Determinar la tolerabilidad de la administración combinada de los medicamentos combinación de TAK-228 y TAK-117 junto con paclitaxel en pacientes con tumor sólido avanzado. 30 24 meses Reclutando Unraveling KAdcyla (Trastuzumab Emtansine; T-DM1) Resistance In HER2-positive Advanced Breast Cancer (ABC): a Prospective GEICAM Study” (KATIA) NCT03829306/España/2018 Estudio de casos prospectivo Mama Evaluar los mecanismos de resistencia primaria y adquirida al Kadcyla en una cohorte de 50 pacientes de HER2+ progresivos/recurrentes que se prevé tratar con Kadcyla dentro de la indicación aprobada en España. 50 12 meses Reclutando *estimado. F1: FoundationOne®, NSCLC: cáncer de pulmón no microcítico, CCR: cáncer colorrectal. Instituto Carlos III de Salud Agencia de Evaluación de Tecnologías Sanitarias MINISTERIO DE SANIDAD, CONSUMO Y BIENESTAR SOCIAL